CN106596532A - 一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法。利用样本溶液中的碱性磷酸酶分析物在催化焦磷酸水解反应后，Cu²⁺因未被焦磷酸络合而可高效率抑制糖化酶活性，使得水溶性较低的淀粉不被糖化酶水解。反应溶液中的淀粉被滴加到纸微流控分析装置中后使得相应纸体发生从亲水性转变为疏水性的润湿性改变，进而使检测试剂溶液可流过该区域的体积降低，最终导致其在纸装置中的流动长度较短。纸装置中检测试剂溶液的流动长度反比于样本中碱性磷酸酶的活性大小，即完成碱性磷酸酶活性的定量检测。本发明方法简单易行，未经专业培训的操作人员也能开展实验，且不使用任何仪器进行定量信号读取，极大降低分析成本，具有广阔的应用前景。

Description

一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法

技术领域

本发明属于生化分析与生物传感技术领域，具体涉及一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法。

背景技术

碱性磷酸酶，也称碱性磷酸酯酶，可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中，肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶、非组织特异性碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶。碱性磷酸酶活性过高或过低与多种疾病相关。例如，分化的结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性会显著升高，被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症，被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关。血清中碱性磷酸酶活性过低也和一些疾病相关。因此，生物样本中碱性磷酸酶活性的定量检测具有十分重要的医学意义。目前现有的碱性磷酸酶活性检测方法主要借助酶标仪、荧光仪、电化学工作站等分析仪器实现定量检测。然而，这些方法对操作人员要求较高的专业技能，特别是所使用的仪器价格较为昂贵且体积庞大，导致整体分析成本较高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法。

本发明的思路：在溶液中进行各种生化反应和在纸微流控分析装置上进行定量信号读取。溶液中进行的生化反应包括碱性磷酸酶特异性催化焦磷酸水解反应、焦磷酸特异络合二价铜离子（Cu²⁺）反应、Cu²⁺抑制糖化酶活性反应以及糖化酶特异性催化水溶性较低的可溶性淀粉水解生成水溶性良好的葡萄糖反应。含有可溶性淀粉分子的最终反应溶液滴加到纸装置中后将使得相应纸体发生从亲水性转变为疏水性的润湿性改变，并使亲水性彩色检测试剂溶液基于毛细管作用流过该区域后的流动长度降低。亲水性彩色检测试剂溶液在纸装置中的流动长度反比于纸体的亲水性-疏水性润湿性改变程度，而后者反比于样本中碱性磷酸酶的活性大小。换言之，通过简单量测纸装置中彩色检测试剂溶液在纸装置中的流动长度即可进行碱性磷酸酶活性的定量检测。因此，通过使用价格极低的直尺代替酶标仪、荧光仪、电化学工作站等分析仪器，或直接读取纸装置自带的长度标尺刻度进行信号读取，可显著降低分析成本。

具体步骤为：

步骤一，将碱性磷酸酶样本溶液与焦磷酸溶液混合，焦磷酸分子被碱性磷酸酶特异性水解为磷酸根离子，然后加入Cu²⁺溶液进行Cu²⁺-焦磷酸络合反应，再加入糖化酶溶液进行Cu²⁺抑制糖化酶活性反应，随后加入可溶性淀粉溶液进行糖化酶催化水解淀粉反应，制得最终反应溶液。

步骤二，将步骤一制得的最终反应溶液滴加到纸微流控分析装置的圆形反应溶液添加区，进而在纸微流控分析装置的圆形检测试剂添加区滴加彩色试剂溶液，该彩色试剂溶液将流经圆形反应溶液添加区进入长方形量测区。

步骤三，当彩色试剂溶液在长方形量测区中停止流动后，测量其在长方形量测区中的流动长度，该长度的大小与碱性磷酸酶样本溶液中碱性磷酸酶活性的大小呈负相关，即完成碱性磷酸酶活性的定量检测。

所述纸微流控分析装置由亲水性纸张制备，含有连续的并按照圆形检测试剂添加区、圆形反应溶液添加区和长方形量测区顺序排列的三部分功能区域。

所述彩色试剂为水溶性彩色墨水、彩色染料和彩色色素中的一种。

所述长方形量测区设置有长度标尺或者未设置长度标尺，当设置有长度标尺时，能够直接读取彩色试剂溶液在长方形量测区中的流动长度，当未设置长度标尺时，使用直尺量测彩色试剂溶液在长方形量测区中的流动长度。

与现有的碱性磷酸酶活性检测方法相比，本发明的突出优点在于：1）分析过程简单易行，未经专业培训的操作人员也能开展实验；2）使用价格极低的直尺或直接读取纸微流控分析装置自带的长度标尺刻度进行信号读取，可极大降低分析成本；3）可直接推广应用于各种体液样本中碱性磷酸酶分析物的活性定量检测，在临床诊断、医学研究等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1和实施例2中的简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法的原理示意图。

图中标记：1—检测试管; 2—缓冲溶液；3—碱性磷酸酶；4—焦磷酸；5—磷酸根；6—Cu²⁺；7—糖化酶；7-1—Cu²⁺-糖化酶复合物；8—可溶性淀粉；9—葡萄糖；10—未设置长度标尺的纸微流控分析装置；10-1—圆形检测试剂添加区；10-2—圆形反应溶液添加区；10-3—长方形量测区；11—由反应溶液形成的印迹；12—彩色试剂溶液；13—彩色试剂溶液在纸微流控分析装置中的流动印迹；14—塑料直尺。

图2为本发明实施例1中使用简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法检测5 U/mL碱性磷酸酶样本溶液所得红墨水水溶液的流动长度与空白样所得红墨水水溶液的流动长度的比较图。

图3为本发明实施例2中使用简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法检测一系列不同活性浓度的碱性磷酸酶样本溶液所得红墨水水溶液的流动长度与碱性磷酸酶活性的Log值之间的工作曲线。

具体实施方式

以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1:

使用简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法检测5 U/mL碱性磷酸酶样本溶液和空白样（不含分析物的缓冲溶液）。

如图1所示，具体实施过程如下：步骤一，在一个1.5 mL的塑料检测试管中加入15µL 5 U/mL碱性磷酸酶样本溶液（由含100 mM NaCl的10 mM tris-HCl缓冲溶液配制，pH7.4），随后加入15 µL 200 µM焦磷酸溶液（由含100 mM NaCl的10 mM tris-HCl缓冲溶液配制，pH 7.4）与之混合，并置于37 ℃下反应 60 min，继续加入15 µL 50 µM硝酸铜水溶液，常温下反应15 min，再继续加入15 µL 1 mg/mL 糖化酶溶液（由20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制，pH 4.5），常温下反应70 min，随后加入15 µL 2%可溶性淀粉溶液（由电阻率为18.2MΩ·cm的超纯水加热后配制），40 ℃下反应 2 h，制得最终反应溶液；步骤二，移取5.6 µL最终反应溶液滴加到纸微流控分析装置（由CO₂激光切割仪切割双圈牌定性滤纸制备而成；激光切割电流和速度分别为5 mA和20 mm/s）的圆形反应溶液添加区（直径为2.2 mm），随后在纸微流控分析装置的圆形检测试剂添加区（直径为2.2 mm）滴加5.5 µL经超纯水稀释20倍的英雄牌红墨水溶液，该红墨水溶液将流经圆形反应溶液添加区进入长方形量测区；步骤三，当红墨水溶液在长方形量测区（长度和宽度分别为15和0.9 mm）中停止流动后，使用普通塑料直尺量测该试剂的流动长度，该长度的大小与碱性磷酸酶样本溶液中碱性磷酸酶活性的大小呈负相关，即完成碱性磷酸酶活性的定量检测。

根据相同的步骤，分析空白样，即10 mM tris-HCl缓冲溶液（含100 mM NaCl，pH7.4），并使用普通塑料直尺量测红墨水溶液在长方形量测区中的流动长度，即空白长度值。从图2可以看出，与检测空白样所得的长度值相比，检测5 U/mL碱性磷酸酶样本溶液所得的长度值几乎可以忽略不计。这是因为样本溶液中的碱性磷酸酶在催化焦磷酸水解反应后，几乎没有游离的焦磷酸去络合Cu²⁺，使得该金属离子可以高效率抑制糖化酶活性，从而可溶性淀粉分子得到很好的保留。这些水溶性较低的分子被滴加到纸微流控分析装置中后极大增加了相应纸体的疏水性，导致几乎没有红墨水溶液流到长方形检测区。图2中的对比实验结果表明，简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法切实可行。

实施例2:

使用简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法检测活性浓度范围为0.0375~5 U/mL的碱性磷酸酶样本溶液。

如图1所示，本实施例中检测每个碱性磷酸酶样本溶液的具体步骤为：步骤一，在一个1.5 mL的塑料检测试管中加入15 µL某一活性浓度的碱性磷酸酶样本溶液（由含100mM NaCl的10 mM tris-HCl缓冲溶液配制，pH 7.4），随后加入15 µL 200 µM焦磷酸溶液（由含100 mM NaCl的10 mM tris-HCl缓冲溶液配制，pH 7.4）与之混合，并置于37 ℃下反应60 min，继续加入15 µL 50 µM硝酸铜水溶液，常温下反应15 min，再继续加入15 µL 1 mg/mL 糖化酶溶液（由20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制，pH 4.5），常温下反应70 min，随后加入15 µL 2%可溶性淀粉溶液（由电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水加热后配制），40 ℃下反应 2 h，制得最终反应溶液；步骤二，移取5.6 µL最终反应溶液滴加到纸微流控分析装置（由CO₂激光切割仪切割双圈牌定性滤纸制备而成；激光切割电流和速度分别为5 mA和20mm/s）的圆形反应溶液添加区（直径为2.2 mm），随后在纸微流控分析装置的圆形检测试剂添加区（直径为2.2 mm）滴加5.5 µL经超纯水稀释20倍的英雄牌红墨水溶液，该红墨水溶液将流经圆形反应溶液添加区进入长方形量测区；步骤三，当红墨水溶液在长方形量测区（长度和宽度分别为15和0.9 mm）中停止流动后，使用普通塑料直尺量测该试剂的流动长度。将所有碱性磷酸酶样本溶液得到的红墨水水溶液的流动长度对碱性磷酸酶活性浓度的Log值作图（图3），即完成基于流动长度量测的碱性磷酸酶活性的定量检测。

由图3可知，随着碱性磷酸酶活性浓度的降低，相应的红墨水水溶液的流动长度逐渐增大。这是因为，当样本溶液中碱性磷酸酶活性较低时，未被水解的焦磷酸则保留较多用于络合较多的Cu²⁺。而具有较高活性糖化酶则催化水解大量的水溶性不佳的可溶性淀粉分子。含有水溶性良好的葡萄糖产物被滴加到纸装置中后改变相应纸体的润湿性较小，使得较多的红墨水溶液可以流到长方形检测区，产生较长的流动长度。此外，图3显示，利用本实施例的方法量测所得的流动长度值与碱性磷酸酶活性浓度的Log值在0.0375~5 U/mL范围内呈现良好的线性关系。

Claims (1)

1.一种简单低成本的碱性磷酸酶活性的检测方法，其特征在于具体步骤为：

步骤一，将碱性磷酸酶样本溶液与焦磷酸溶液混合，焦磷酸分子被碱性磷酸酶特异性水解为磷酸根离子，然后加入Cu²⁺溶液进行Cu²⁺-焦磷酸络合反应，再加入糖化酶溶液进行Cu²⁺抑制糖化酶活性反应，随后加入可溶性淀粉溶液进行糖化酶催化水解淀粉反应，制得最终反应溶液；

步骤二，将步骤一制得的最终反应溶液滴加到纸微流控分析装置的圆形反应溶液添加区，进而在纸微流控分析装置的圆形检测试剂添加区滴加彩色试剂溶液，该彩色试剂溶液将流经圆形反应溶液添加区进入长方形量测区；

步骤三，当彩色试剂溶液在长方形量测区中停止流动后，测量其在长方形量测区中的流动长度，该长度的大小与碱性磷酸酶样本溶液中碱性磷酸酶活性的大小呈负相关，即完成碱性磷酸酶活性的定量检测；

所述纸微流控分析装置由亲水性纸张制备，含有连续的并按照圆形检测试剂添加区、圆形反应溶液添加区和长方形量测区顺序排列的三部分功能区域；

所述彩色试剂为水溶性彩色墨水、彩色染料和彩色色素中的一种；

所述长方形量测区设置有长度标尺或者未设置长度标尺，当设置有长度标尺时，能够直接读取彩色试剂溶液在长方形量测区中的流动长度，当未设置长度标尺时，使用直尺量测彩色试剂溶液在长方形量测区中的流动长度。