CN104020199A - 一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法及应用，将电化学标记物硫堇吸附在金-铂纳米粒子(AuPtNPs)表面，再将巯基DNA1固定在AuPtNPs表面，得电化学探针(DNA1/Th/AuPtNPs)；再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNA1与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNA1/Th/AuPtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs；然后将碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNA1的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，测电化学信号，通过电化学信号强弱实现了电化学方法对多巴胺的定量测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和电化学领域，具体涉及一种性检测多巴胺的电化学方法。
背景技术
多巴胺(DA)是一重要的信息传递物质，其含量的改变可导致一些重要疾病如帕金森氏症等。因此，多巴胺的测定一直是分析化学、生物和医学领域的研究热点。电化学测定多巴胺有较高的灵敏度，但由于大量抗坏血酸(AA)与多巴胺共存于脑内，其在固体电极上的氧化电位与多巴胺重叠，因而严重干扰多巴胺含量的测定。
近年来，提出了一些基于适体技术检测多巴胺的方法。如光度法(Yu Zheng,Yong Wang,Xiurong Yang,Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles.Sensors and Actuators B,156(2011)95-99)、荧光法(Qin Mu,Hu Xu,Yan Li,Shijian Ma,Xinhua Zhong,Adenosine capped QDs based fluorescent sensor for detection of dopamine with high selectivity and sensitivity.Analyst,139(2014)93-98)、酶联免疫方法(Hoyoung Park,Insook Rhee Paeng,Development of direct competitive enzyme-linked aptamer assay for determination of dopamine in serum.Analytica Chimica Acta,685(2011)65-73；Eunhye Kim,Insook Rhee Paeng,Advantageous sensitivity in the DNA homolog of the RNA dopamine aptamer.Journal of Immunoassay and Immunochemistry,35(2014)83-100)等，然而这些检测方法大都灵敏度低，操作繁琐，而且耗时较多。因此，必须发展一种简单，低成本，快速的检测方法用于多巴胺的分析检测。
发明内容
一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法：将电化学标记物硫堇吸附在金-铂纳米粒子(AuPtNPs)表面，再将巯基DNA1固定在AuPtNPs表面，得电化学探针(DNA1/Th/AuPtNPs)；再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNA1与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNA1/Th/AuPtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs；然后将碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNA1的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，测电化学信号，通过电化学信号强弱实现了电化学方法对多巴胺的定量测定。
本发明是通过以下措施来实现的：一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备电化学探针；
(2)制备碳纳米粒子修饰金电极；
(3)电化学检测多巴胺。
优选的，本发明所述的电化学探针制备包括以下步骤：取2mL的离心管，加入10μL10-5M的DNA1和10μL pH5.2500mM的醋酸缓冲溶液，和10μL10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应1h，用以活化巯基。然后，另取2mL离心管依次加入直径15nm1mLAuPtNPs和100μL10-4M的硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金-铂纳米粒子上。将吸附了硫堇的AuPtNPs加入到活化好的巯基DNA1中，放入37℃摇床轻摇反应16h。使巯基DNA1与AuPtNPs通过Au-S键连接起来。再向体系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mM pH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在10mM pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/AuPtNPs电化学探针，4℃避光保存。
优选地，本发明所述的碳纳米粒子修饰金电极制备包括以下步骤：用NaCO3将CNPs调节pH至7.0，移至2mL离心管在15000转速下离心10min。离心产物用0.01M pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤3次。将产物用0.01M pH7.0的磷酸缓冲溶液分散，取10μL滴在金电极表面得碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)，置阴凉处风干备用。
优选地，一种对多巴胺的检测方法，其特征是：取20μL10-5M的DNA2加入电化学探针(DNA1/Th/AuPtNPs)溶液中，反应2h后，14000转速下离心30min，用10mM，pH8.0磷酸缓冲溶液洗涤三次，再用1mL磷酸缓冲溶液分散。在2mL离心管中加入20μL上述溶液，再加入10μL一定浓度的多巴胺，反应30min后将碳纳米粒子修饰金电极插入反应30min，用磷酸缓冲溶液冲洗。以上述修饰金电极作为工作电极，将电极插入0.1M，pH7.4的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法或微分脉冲伏安法(DPV)测电信号(Ip)，电位增量0.001mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
具体实验原理如图1所示。
碳纳米粒子修饰金电极对电化学行为的影响如图2所示。(a)无DA时CNPs/GE的DPV曲线；(b)在10μL3.0×10-6mol L-1DA时GE的DPV曲线；(c)在10μL3.0×10-6mol L-1DA时CNPs/GE的DPV曲线
吸附时间对电化学信号强度的影响如图3所示。
峰电流与多巴胺浓度的标准曲线图如图4所示。
电化学测定多巴胺的选择性如图5所示。
本发明中的检测条件，具体特征如下：
多巴胺与DNA2修饰的探针作用后，将碳纳米粒子修饰金电极插入溶液，碳纳米粒子修饰金电极将吸附生成的探针，吸附时间对电化学信号有着极大的影响。考察了吸附时间对电化学信号的影响。结果如图3所示，用吸附时间和电化学信号作图，从图中可以看出，在10到40min内，电化学信号随着吸附时间的增加而增加，当吸附时间继续增加到50min，60min时，电化学信号趋于平稳。表明吸附时间最优为50min。
分析性能如下：
本发明在最佳条件下，考察了多巴胺的浓度与电化学信号强度的关系。由图4可看出，多巴胺的浓度在3.0×10-8～3.0×10-6M范围内与电化学信号强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是Ip＝1.942C+3.6×10-7(Ip是体系的电化学信号强度；C是多巴胺的浓度，n＝9)，线性相关系数R＝0.9981，检测限是1.0×10-8M(3σ)。该方法的精密度通过对浓度为3.0×10-7M的多巴胺进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差为3.1％。表明本法有较好的重现性。
方法的选择性。选择抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)作为对检测多巴胺选择性的对比物。将电化学方法检测浓度为3.0×10-5mol L-1的AA和UA，3×10-7mol L-1的DA。电流强度如图5所示，可以看出，检测3.0×10-5mol L-1的AA和UA的电流强度远远低于检测3×10-7mol L-1的DA电流强度，说明该电化学方法具有很高的选择性来检测多巴胺。
与现有技术相比，本发明涉及的电化学测定多巴胺的方法具有如下优点和显著的进步：金-铂纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载电化学试剂，使得本发明设计的电化学测定多巴胺的方法具有高灵敏度。另外，利用适体的识别作用，通过检测探针上电化学物质的电化学信号间接测定多巴胺，而不是直接测定多巴胺的电化学信号；根据实验电化学信号强度(图5)可以看出，当本发明的电化学测定多巴胺的方法用于检测抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)时，其电化学信号强度远远低于检多巴胺的电化学信号强度，这说明该方法具有很高的选择性检来测多巴胺。因此，本发明涉及的电化学方法在构建检测小分子化合物的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
图1为实验原理图。
图2为碳纳米粒子修饰金电极对电化学行为的影响。
图3为吸附时间对电化学信号强度的影响。
图4为多巴胺浓度的标准曲线图。
图5为电化学方法检测多巴胺的选择性。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例：一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法
1.实验部分
1.1仪器与试剂
CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)；PHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)；实验采用三电极系统：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgC1(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
NaH2PO4·2H2O，天津市广成化学试剂有限公司；Na2HPO4·12H2O，天津市红岩化学试剂厂；三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，氯金酸(HAuCl4)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)均购于天津市博迪化工有限公司；铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])，天津市博迪化工有限公司；亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6]·3H2O)，天津市广成化学试剂有限公司；氧化铝粉末(α-Al2O3)，多巴胺(DA)，硫堇(Th)购自上海阿拉丁试剂公司。
所用人工合成DNA序列(北京赛百盛生物工程有限公司购得)如下:
优选的DNA1部分序列：5’-GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGC CC-HS-3’；
优选的DNA2部分序列：5’-GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3’。
1.2实验步骤
1.2.1金-铂纳米粒子的制备
把制备和储备金胶溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶)用王水泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用。在1000mL圆底烧瓶中加入50mL1mM的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入5mL38.8mM的柠檬酸钠(NaC6H5O7)，溶液变为酒红色时，向溶液中依次加入5mL4.0×10-3molL-1的HPtCl6，15mL10gL-1的PVP，搅拌加热至沸腾后继续加热2h。溶液由酒红色变为棕褐色，制得AuPtNPs，转移至棕色瓶，4℃储存备用。
1.2.2碳纳米粒子的制备
把制备、储备碳纳米粒子(CNPs)所用的玻璃容器(容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶)用王水(HCl：HNO3＝1:3)泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用。在100mL圆底烧瓶中加入60mL5M的HNO3和0.3g活性炭，加热沸腾后，继续回流12h，转移至棕色广口瓶，置阴凉避光处保存。
1.2.3电化学探针的制备
首先，取2mL的离心管，加入10μL10-5M的DNA1和10μL pH5.2500mM的醋酸缓冲溶液，和10μL10mM的TCEP反应1h，用以活化巯基。然后，另取2mL离心管依次加入1mL AuPtNPs和100μL10-4M的硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金-铂纳米粒子上。将吸附了硫堇的AuPtNPs加入到活化好的巯基DNA1中，放入摇床轻摇反应16h。使巯基DNA1与AuPtNPs通过Au-S键连接起来。再向体系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mM pH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在10mM pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/AuPtNPs电化学探针，4℃避光保存。
1.2.4电化学检测多巴胺方法的构建
1.2.4.1金电极的预处理
用NaCO3将制得的CNPs调节pH至7.0，移至2mL离心管在15000转速下离心10min。离心产物用0.01M pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤3次。将产物用0.01M pH7.0的磷酸缓冲溶液分散，取10μL滴在金电极表面得碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)，置阴凉处风干备用。
1.2.4.2电化学方法对多巴胺的检测
取20μL10-5M的DNA2加入上述电化学探针中，反应2h后，14000转速下离心30min，用10mM，pH8.0磷酸缓冲溶液洗涤三次，再用1mL磷酸缓冲溶液分散。在2mL离心管中加入20μL上述溶液，再加入10μL一定浓度的多巴胺，反应30min后将碳纳米粒子修饰金电极插入，30min后用磷酸缓冲溶液冲洗。以上述所得金电极作为工作电极，将三电极体系插入0.1M，pH7.4的磷酸缓冲溶液中测电信号。实验采用DPV测定电化学信号，电位增量0.001mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
1.3结果与讨论
1.3.1实验原理
图1描述了以硫堇为电化学信号标记物检测多巴胺的电化学适体技术工作原理。首先将电化学标记物硫堇吸附在AuPtNPs表面，再将巯基DNA1固定在AuPtNPs表面，得电化学探针(DNA1/Th/AuPtNPs)；再将电化学探针溶液中加入多巴胺适体链DNA2，DNA1与DNA2发生互补配对，得DNA2修饰的电化学探针(DNA2/DNA1/Th/AuPtNPs)；当向DNA2修饰的探针溶液中加入多巴胺后，适体链DNA2优先与多巴胺结合，导致重新生成了电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs；然后将碳纳米粒子修饰的金电极(CNPs/GE)浸入重新生成的电化学探针DNA1/Th/AuPtNPs溶液中，由于碳纳米粒子与单链DNA1的吸附作用，电化学探针吸附于电极表面，在磷酸缓冲溶液中测电化学信号，通过电化学信号强弱实现对多巴胺的定量测定。AuPtNPs上吸附大量的硫堇，实现了信号的放大；多巴胺只与多巴胺适体作用，方法具有高的选择性。
1.3.2碳纳米粒子修饰金电极对电化学行为的影响
如图2所示，做了对照试验来研究修饰金电极对检测多巴胺灵敏度的影响。首先，将适体链DNA2加入到电化学探针体系中，反应2h后得杂交产物，取20μL杂交产物加入2mL离心管，再加入10μL二次水，30min后浸入CNPs/GE反应30min，取出电极，放入0.1M pH7.4的磷酸缓冲缓冲溶液中采用DPV测电信号，所得曲线如图中a。b是在杂交产物中加入10μL3.0×10-6多巴胺，反应30min后插入GE，后所得DPV图。C是向杂交产物中加10μL3.0×10-6多巴胺，插入CNPs/GE，所测得DPV图。通过a与c的对照表明，向体系中加入多巴胺明显引起电信号的增加，b与c的对照表明CNPs/GE比GE具有更高的灵敏度，这是由于CNPs修饰金电极增加了电极对单链DNA的吸附能力。
1.3.3吸附时间对电化学信号强度的影响
多巴胺与其适体结合引起适体互补链释放，释放越多，与电极发生吸附的探针就越多，经过AuPtNPs的放大作用，最终得到增强的电信号。不同的吸附时间可能引起吸附量的明显差异，从而影响电化学信号的明显不同。为了选择合适的吸附时间，考察了吸附时间对电化学信号的影响。实验结果如图3所示，对吸附时间和电化学信号作图，从图中可以看出，在10到40min内，电化学信号随着吸附时间的增加而增加，当吸附时间继续增加到50min时，电化学信号趋于平稳。表明在50min时，DNA1/Th/AuPtNPs在CNPs/GE上的吸附趋于饱和。
1.3.4方法的线性范围与检出限
由图4可看出，在最佳的实验条件下，多巴胺的浓度在3.0×10-8～3.0×10-6M范围内与电化学信号强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是Ip＝1.942C+3.6×10-7(Ip是体系的电化学信号强度；C是多巴胺的浓度，n＝9)，线性相关系数R＝0.9981，检测限是1.0×10-8M(3σ)。该方法的精密度通过对浓度为3.0×10-7M的多巴胺进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差为3.1％。表明本法有较好的重现性。
1.3.5电化学方法检测多巴胺的选择性
同时，考察了该电化学方法测定多巴胺的选择性。选择抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)作为电化学方法检测多巴胺选择性的对比物(Sample)。检测浓度为3.0×10-5mol L-1的AA和UA，3×10-7mol L-1的多巴胺。所的电流强度如图5所示，可以看出，检测3.0×10-5mol L-1的AA和UA的电流强度远远低于检测3×10-7mol L-1的多巴胺电流强度，说明该电化学方法具有很高的选择性检测多巴胺。
1.4样品测定
根据发明的方法对样品中多巴胺含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，测定结果见表1，样品测定回收率为95.0–102.0％，本发明的方法在多巴胺检测中具有精密度高的特点。
表1.样品分析测定结果
| 编号 | 含量a,b | 标准样品加入量 | 测得量 | 回收率(％) |
| 1 | 2.3 | 2.0 | 4.2 | 95.0 |
| 2 | 4.5 | 5.0 | 9.6 | 102.0 |
| 3 | 11.3 | 10.0 | 21.5 | 102.0 |
| 4 | 13.2 | 15.0 | 28.1 | 99.3 |
| 5 | 14.4 | 15.0 | 29.2 | 98.7 |
a9次测量结果
b单位：10-5mol L-1
Claims (4)
1.一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法，包括如下步骤：
(1)取2mL的离心管，加入1～30μL10-5M的DNA1和10μL pH5.2的500mM的醋酸缓冲溶液，和10μL10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应1h，用以活化巯基；然后，另取2mL离心管依次加入直径15nm，1mL的AuPtNPs和100μL10-4M的硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金-铂纳米粒子上；将吸附了硫堇的AuPtNPs加入到活化好的巯基DNA1中，放入37℃摇床轻摇反应8～32h；使巯基DNA1与AuPtNPs连接起来；再向体系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mMpH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/AuPtNPs电化学探针；
(2)用NaCO3将CNPs调节pH至7.0，移至2mL离心管在15000转速下离心10min；离心产物用0.01M，pH7.0磷酸缓冲溶液洗涤3次；将产物用0.01M，pH7.0的磷酸缓冲溶液分散，取10μL滴在金电极表面得碳纳米粒子修饰金电极(CNPs/GE)；
(3)取5～40μL10-5M的DNA2加入电化学探针(DNA1/Th/AuPtNPs)溶液中，反应0.5～4h后，14000转速下离心30min，用10mM，pH8.0磷酸缓冲溶液洗涤三次，再用1mL磷酸缓冲溶液分散；在2mL离心管中加入20μL上述溶液，再加入2～20μL一定浓度的多巴胺，反应30min后将碳纳米粒子修饰金电极插入反应10～60min，用磷酸缓冲溶液冲洗后测定电化学信号；
所述的DNA1的部分序列为：5’-GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGC CC-HS-3’；
所述的DNA2的部分序列为：5’-GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3’。
2.根据权利要求1所述的测定电化学信号，其特征在于：以上述修饰金电极作为工作电极，将电极插入0.1M，pH7.4的磷酸缓冲溶液中用循环伏安法或微分脉冲伏安法(DPV)测电信号，电位增量0.001mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
3.根据权利要求1所述的碳纳米粒子的制备，其特征在于：在100mL圆底烧瓶中加入10～120mL8M的HNO3和0.3g活性炭，加热沸腾后，继续回流2～24h，即得。
4.根据权利要求1所述的一种基于适体识别作用电化学测定多巴胺的方法在检测多巴胺含量中的应用。
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