CN102495125A

CN102495125A - 利用dna序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测l-组氨酸的方法

Info

Publication number: CN102495125A
Application number: CN2011104042584A
Authority: CN
Inventors: 李丽东
Original assignee: Beihang University
Current assignee: Beihang University
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: CN102495125B

Abstract

本发明公开了一种利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，该方法利用制备的纳米金晶体和双链DNA对预处理的玻碳电极表面进行修饰，得到玻碳电极传感器，采用该玻碳电极传感器对L-组氨酸进行检测，该检测方法的最低检测限可以达到0.1pM，另外电流信号0.1pM～0.1μM的范围内具有良好的线性关系，为高灵敏度定量测量提供了依据。同时，该种检测方法具有检测速度快，重复性好，特异性强，不受类似氨基酸的影响，同时可以手性识别组氨酸的优点。

Description

利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体是基于DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体的检测L-组氨酸的方法。

背景技术

L-组氨酸，20种天然氨基酸中的一种，它作为一个神经传递介质或神经调质在哺乳动物的中枢神经系统中发挥着重要作用，它也已经被表明在生物的重要基底里支配金属的传输和减小微小创伤的内部流血；足够高剂量的L-组氨酸的摄取能导致中毒症状，因此，生物体液里的L-组氨酸的检测将是非常重要的。

被经常用来分析L-组氨酸水平的方法是毛细管电泳、荧光测定法和比色法。然而这些方法却存在一些不足，包括不稳定的化学和荧光特性、来自于污染的着色剂、荧光团和冷却器的潜在的错误信号以及经常对笨重的光学仪器设备的依赖。

和质谱分析相结合的高性能的液体色谱分析法和气体色谱分析法也已经被应用在L-组氨酸的检测，这些方法经常需要昂贵的机器设施和复杂的操作程序，同时需要生物样品的乏味冗长的前处理过程，因此检测微量L-组氨酸的电化学方法被开发，但是很少描述L-组氨酸的手性分析，到目前为止关于报道的手性分析技术都是建立在色谱法、毛细管区带电泳、质谱分析和电分析基础上的，电分析方法具备相对高的效率和低费用的特征，然而，现有的采用电化学法分析L-组氨酸的方法，存在窄的线性范围和相对高的检测限。

脱氧核酶是具有催化性能的DNA序列，它通过试管内育种分离出来。辅酶依赖型的脱氧核酶能在选择的过程中通过变化的辅酶和变化的辅酶浓度产生。RNA的自断裂活动产生于核糖2’羟(基)氢氧基。当某种阳离子金属出现或者在碱性条件下，这个羟(基)氢氧基形成一个2’阳离子，这个2’阳离子在一个酯交换反应中充当一个亲核试剂，切断RNA链。Roth和Breaker(见参考文献[1]Roth，A.，Breaker，R.R.，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，6027-6031.)报道了一个催化性的DNA的试管内筛选，在RNA链断裂反应中用L-组氨酸作为一个主动的辅酶，动力分析表明，一个DNA-L-组氨酸复合物可能完成反应类似于核糖核酸酶的催化机制的第一步，L-组氨酸的咪唑官能团充当一般的碱性催化剂。

另外纳米金晶体具有独特的表面等离子共振性质，以及卓越的生物兼容性的特点。它在生物传感领域有着巨大的潜在应用前景。但是，以往传统方法合成的纳米金晶体都是以较低的指数面包围，如(100)，(111)，(110)等。众所周知，具有高能指数面的纳米金晶体由于表面具有高密度的原子阶梯而具有极高的化学活性和电催化活性，然而正是由于这些具有高表面能的晶面在晶体合成过程中迅速地消失，以致长期以来，合成高指数面的纳米金晶体具有很大的难度。

发明内容

本发明的目的是克服传统L-组氨酸检验方法的不足，提供一种简单快速、特异性强、重复性好、灵敏度高，可以手性识别L-组氨酸的方法。在本发明中，采用简单方便的湿化学方法合成出具有24个高能指数面的纳米金晶体(拉长二十四面体)，极大地提高了电化学法检测L-组氨酸的灵敏度。本发明中首次提出采用电化学方法来快速检测L-组氨酸，该方法建立在依赖于L-组氨酸的自断裂脱氧核酶上，并且基于具有高能指数面的纳米金晶体的信号放大作用。本发明提供的检测方法，基于L-组氨酸存在和脱氧核酶的自断裂活动来产生传感信号，并通过高能指数面的纳米金晶体的修饰达到信号放大的目的。本发明可以达到很低的检测限(0.1pM)和非常好的选择性，同时可以手性识别L-组氨酸。

本发明提供的L-组氨酸的检测方法，具体包括如下步骤：

第一步：晶种溶液的制备：把NaBH₄溶液倒入含有浓度为0.1M的CTAB和浓度为0.5mM的HAuCl₄的溶液中剧烈搅拌，溶液的颜色由黄色变为深棕色，表明金颗粒的形成，之后，晶种溶液静置1小时以备后用；

第二步：生长液的制备：把CTAB粉末溶解在浓度为0.01M的DDAB溶液中配制成双表面活性剂溶液，并且使双表面活性剂溶液中CTAB和DDAB的摩尔比为4；在该双表面活性剂溶液中，依次加入：浓度为1mM的HAuCl₄溶液，浓度为0.01M的AgNO₃溶液，浓度为0.5MH₂SO₄溶液和浓度为0.1M的丙烯酸溶液制备出生长液，该生长液的pH值为2.7；如果DDAB溶液的体积为V，则加入双表面活性剂溶液中的各溶液体积分别为：V、0.02V、0.008V和0.016V；

第三步：取第一步中制备得到的晶种溶液，将晶种溶液混入第二步中制备的生长液中，30℃下保持10小时，得到具有高能指数面的纳米金晶体，即拉长二十四面体；

第四步，双链DNA的制备：在I-B缓冲溶液中配置混合溶液，混合溶液中含有1μMDNA1、1μM DNA2和1mM TCEP，将混合溶液放置在90℃水浴下保持5分钟，然后自然冷却到常温；使用前放入-20℃条件下保存；

第五步，玻碳电极表面的预处理：

(1)玻碳电极的清洗；

(2)将浓度为5mg ml^-1的纳米金晶体的乙醇溶液均匀滴在清洗后的玻碳电极上直至完全干燥，然后用乙醇反复清洗直至洗去纳米金晶体上的表面活性剂，然后用二次去离子水冲洗干净至干燥，得到纳米金晶体修饰的玻碳电极；

(3)再移取第四步中制备的双链DNA混合溶液滴在由纳米金晶体修饰的玻碳电极上，在室温下保持100％湿度放置20小时后，分别用Tris-HCl缓冲液和二次去离子水冲洗，用氮气吹干，得到双链DNA修饰的玻碳电极；

(4)再滴加浓度为1mM的巯基己醇到第(3)步中双链DNA修饰的玻碳电极表面，室温下保持半小时，然后分别用Tris-HCl缓冲液和二次去离子水冲洗，即得到最终的修饰后的玻碳电极传感器；

第六步，L-组氨酸的电化学方波检测：对于L-组氨酸的检测，将经过第五步修饰后的玻碳电极传感器放入具有不同浓度的L-组氨酸的I-B缓冲溶液里进行即时检测，检测所选用的方波扫描范围为0-0.8V。

本发明的优点在于简单快速，灵敏度高，选择性好，可以进行手性识别，具体为：

(1)本发明提供的检测方法对于L-组氨酸的最低检测浓度可以达到0.1pM，并且线性范围大。在0.1pM-0.1μM浓度范围内，检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数呈线性关系；

(2)检测速度快，峰电流值可以在30s内达到稳定；

(3)本发明提供的检测方法具有很强的专一性，类似的氨基酸都不会对L-组氨酸的检测产生干扰，并且该方法的具有手性识别特点，D-组氨酸也不会对检测产生任何干扰；

(4)重复性好，数次检测结果的标准偏差不高于3％；

(5)本发明提供的检测方法具有良好的实用性，加标样品的回收率符合痕量分析标准。

附图说明

图1：本发明中检测L-组氨酸的双链DNA结构示意图；

图2：本发明中利用DNA自断裂和高能指数面纳米金晶体检测L-组氨酸的机理图；

图3：本发明中制备的纳米金晶体的微观结构图，其中(a)是低分辨率的纳米金晶体SEM图；(b)和(c)是放大的SEM图(比例尺是60nm)；(d)是TEM图和沿[001]方向的SEAD图；(e)是TEM图和沿[010]方向的SEAD图；(f)是纳米金晶体的结构模型图；

图4清洗好的裸玻碳电极在0.5M H₂SO₄溶液中的典型的循环伏安谱图；

图5A：采用本发明的玻碳电极传感器检测L-组氨酸的方波图；B：在L-组氨酸浓度为0.1pM-0.1μM浓度范围内，采用本发明的玻碳电极传感器检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数的线性关系；C：双链DNA修饰而未经纳米金晶体修饰的裸金电极检测不同浓度的L-组氨酸的方波伏安曲线；D：双链DNA修饰而未经纳米金晶体修饰的裸金电极检测的L-组氨酸浓度和方波伏安峰电流的关系，内插图为方波伏安峰(SWV峰)电流与L-组氨酸在1.0×10^-9～1.0×10^-5M的对数成线性关系；

图6A本发明的玻碳电极传感器在不同时间对1nM的L-组氨酸的SWV图；B：检测浓度为1nM的L-组氨酸的方波伏安峰电流随时间的关系曲线；

图7A：本发明的玻碳电极传感器同(a)浓度为0M L-组氨酸(b)浓度均为1μM的D-组氨酸、L-胱氨酸和L-缬氨酸的混合物(c)浓度为1nM L-组氨酸反应后的方波伏安曲线；B：应用本发明提供的玻碳电极传感器检测不同的氨基酸后的方波峰电流相对于背景方波峰电流信号的信号变化柱状图；

图8：本发明的检测方法对于浓度为1nM的L-组氨酸的重复性检验柱状图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供的检测方法的主要技术特征是L-组氨酸的传感原理以及高能指数面的纳米金晶体的应用。其中L-组氨酸的传感原理是利用双链DNA在L-组氨酸存在的条件下可以自发断裂的机理设计而成的。其具体原理如下：

如图1所示，本发明中使用的L-组氨酸所需的双链DNA包括一个二茂铁修饰的催化DNA2链和一个与之杂交且互补的具有22个碱基的底物寡核苷酸DNA1，所述的DNA1包含一个单个的、无柄的腺嘌呤，如图1箭头所示。所述的DNA2由24个脱氧核苷酸的功能域组成，在这24个脱氧核苷酸两侧(从5’到3’)分别是由8个核苷酸组成的底物和识别区域，为了设计一个信号增大的自断裂脱氧核酶传感器，一个氧化还原探针(二茂铁)被增加到DNA2链的5’方向的尾端。DNA 1：3’-CGA CTC ACT ATrA GGA AGA GAT G-5’；DNA 2：3’-SH-(CH₂)₆-CAT CTC TTG ATC GGG GCT GTG CGG GTA GGA AGT-AAT AGTGAG-5’-(CH₂)₆-ferrocene。

如图2，当L-组氨酸未出现时，双链DNA双螺旋结构是相当牢固的，可能阻止二茂铁接触电极传递电子。通过Marcus电子转移理论可知，二茂铁的氧化还原反应是非常受距离制约的，因此，在这个双链DNA双螺旋构造情况下，几乎没有法拉第电流被观察到。当L-组氨酸出现时，反式作用的催化链DNA2使DNA1链在DNA1链自身的无固着的磷酸二酯处断裂成两部分，因此在两DNA链之间的杂化消失了，允许DNA片段分离，并释放DNA2折叠成二级结构，从而产生明显的法拉第电流。产生法拉第电流的原因是二茂铁端基足够靠近电极。

基于上述的原理，本发明中所提出的利用双链DNA序列自断裂和高能指数面纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，包括如下步骤：

第一步：晶种溶液的制备：把0.6mL的刚刚配制好的浓度为0.01M的NaBH₄溶液倒入10mL含有浓度为0.1M的CTAB和浓度为0.5mM的HAuCl₄的溶液中剧烈搅拌。溶液的颜色由黄色变为深棕色，表明金颗粒的形成。之后，晶种溶液静置1小时以备后用。

第二步：生长液的制备：把0.0729g溴化十二烷基三甲基铵(CTAB)粉末溶解在5mL浓度为0.01M的双十烷基二甲基溴化铵(DDAB)溶液中配制成双表面活性剂溶液，并且使双表面活性剂溶液中CTAB和DDAB的摩尔比为4。在该双表面活性剂溶液中，依次加入：5mL浓度为1mM的HAuCl₄溶液，0.1mL浓度为0.01M的AgNO₃溶液，40μL浓度为0.5M H₂SO₄溶液和80μL浓度为0.1M的丙烯酸溶液(AA)制备出生长液，该生长液的pH值为2.7。

第三步：取第一步中制备得到的晶种溶液0.3mL，将晶种溶液混入第二步中制备的生长液中，30℃下保持10小时，即得到具有高能指数面的纳米金晶体，即拉长二十四面体。

制备出的纳米金晶体的TEM图如图3所示，其中图3(a)-(c)给出了通过本发明提供的制备方法获得的纳米金晶体的扫描电镜图。如图所示，该拉长二十四面体，长度大约104±8nm，宽度大约83±5nm。在图3(d)中二面角α＝131.6°、β＝149.4°、γ＝152.2°分别和{140}，{210}、{100}三种晶面的理论值相等，另外在图3(e)中，同样的方法可以得出有8个晶面平行于[010]方向应为{301}晶面。由以上电镜图可以得出该二十四面体主要高能面为{140}，{210}和{301}，如图3(f)所示。

第四步，双链DNA (dsDNA)的制备：在I-B缓冲溶液中配置混合溶液，混合溶液中含有1μM DNA1、1μM DNA2和1mM磷酸三(β-氯乙基)酯TCEP，TCEP的作用是去除双硫键，以保证适配子的巯基基团与金晶体表面更好的结合。将混合溶液放置在90℃水浴下保持5分钟，然后自然冷却到常温。这一水浴加热和自然冷却的过程有助于适配子结构的灵活性。使用前放入-20℃条件下保存。所述的I-B缓冲溶液为含有20mM Tris-HCl，pH＝7.41，140mM NaCl，20mM MgCl和20mMKCl的溶液。

第五步，玻碳电极表面的预处理：

(1)玻碳电极的清洗，包括：(a)将玻碳电极在纱布抛光纸上分别用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉进行打磨；(b)将玻碳电极分别在乙醇和二次去离子水中超声两分钟；(c)进行电化学清洗，具体为：玻碳电极在0.5M的H₂SO₄溶液中，在-0.2和+1.6V之间进行循环伏安扫描，直到获得典型的循环伏安谱图如图4所示。

(2)将10μL(浓度为5mg ml^-1)的纳米金晶体的乙醇溶液均匀滴在清洗后的玻碳电极上直至完全干燥。然后用乙醇反复清洗直至洗去纳米金晶体上的表面活性剂(CTAB和DDAB)，然后用二次去离子水冲洗干净至干燥，得到纳米金晶体修饰的玻碳电极。

(3)再移取第四步中制备的双链DNA混合溶液20μL滴在由纳米金晶体修饰的玻碳电极上，在室温下保持100％湿度放置20小时后分别用Tris-HCl缓冲液(0.1M三羟甲基氨基甲烷和0.1M盐酸的均匀混合液)和二次去离子水冲洗，用氮气吹干，得到双链DNA修饰的玻碳电极。

(4)再滴加20μL浓度为1mM的巯基己醇(MCH)到第(3)步中双链DNA修饰的玻碳电极表面，室温下保持半小时，目的是除去修饰到玻碳电极表面多余的双链DNA。然后分别用Tris-HCl缓冲液和二次去离子水冲洗，即得到玻碳电极传感器。

第六步，L-组氨酸的电化学方波检测：对于L-组氨酸的检测，将经过第五步修饰后的玻碳电极传感器放入2ml具有不同浓度的L-组氨酸的I-B缓冲溶液里进行即时检测，检测所选用的方波扫描范围为0-0.8V。电化学方波检测选用三电极体系：工作电极是采用本发明方法最终修饰后的玻碳电极传感器的圆盘玻碳电极(电极直径2mm)，参比电极是Ag/AgCl(饱和KCl)电极，对电极是铂丝电极。

本发明提供的检测方法对信号的放大作用通过用修饰了DNA双链而未经纳米金晶体修饰的裸金电极来对比验证。我们利用方波伏安法来进行检测L-组氨酸，以得到应用本发明的玻碳电极传感器对L-组氨酸检测范围以及最低检测限。图5A和图5B出示了应用本发明的玻碳电极传感器检测L-组氨酸的方波图以及方波伏安峰电流和L-组氨酸浓度的关系曲线。从图5A可以看出，方波伏安峰电流随着L-组氨酸浓度的增加而增大。从图5B看出，在0.1pM～0.1μM浓度范围内，方波伏安峰电流和浓度的对数成良好的线性关系，检测限为0.1pM。为了证明具有高能指数面的纳米金晶体修饰对检测灵敏度的影响，L-组氨酸的检测也被应用在dsDNA/裸金电极上，从图5C和5D看出，未经过高能指数面纳米金修饰的裸金电极对L-组氨酸的响应范围缩减到1nM～0.1μM，检测限仅仅为1nM。从图5A～5D的对比能很清楚的看出通过具有高能指数面修饰的纳米金晶体修饰后的玻碳电极对目标物的传感能力大大增强。

本发明提供的检测方法的时间响应关系通过实验的方法得到了验证。本发明制备得到的玻碳电极传感器在检测L-组氨酸过程中很快达到平衡，在28秒内观察到98％的信号改变，在不到半分钟内信号达到完全饱和，如图6A和图6B。在实验中，当所制备的玻碳电极传感器被置入含有不同浓度的L-组氨酸的I-B缓冲溶液中，每个浓度的样品测量在30秒内完成。经分析可知，上述的快速反应的速率常数为k_obs＝0.2min^-1(23℃，pH 7.5)，反应速度快是由于的脱氧核酶的高催化性能和DNA的构造有利的DNA二级结构之间的快速平衡。一般说来，速率常数k_obs和温度的关系由Arrhenius方程式得出，速率常数k_obs的增加同温度成线性关系，并在37℃下达到最大值。

本发明提供的检测方法的专一性是通过检测另外三种性质相似的氨基酸：D-组氨酸(D-histidine)，L-胱氨酸(L-cystine)和L-缬氨酸(L-valine)来证明的，这三种氨基酸的浓度均为1μM。对于本发明中修饰后的玻碳电极传感器的检测结果，如图7A，其中曲线a为背景峰，L-组氨酸浓度为0M，当检测浓度均为1μM的D-组氨酸、L-胱氨酸和L-缬氨酸的混合物时，反应后的方波伏安曲线相对于背景峰没有出现明显的信号变化(见曲线b)。当加入浓度为1nM的L-组氨酸时，方波峰电流信号明显增强(见曲线c)。结果表明，用修饰后的玻碳电极传感器对L-组氨酸的检测具有明显的专一性。图7B出示了修饰后的玻碳电极传感器检测上述不同的氨基酸后的方波伏安峰电流相对于背景方波峰电流信号的信号变化柱状图，从图7B可以看出，同背景峰电流相比，浓度为1μM的D-组氨酸、L-胱氨酸和L-缬氨酸的混合物产生的方波峰电流改变不到5％。然而，浓度为1nM的L-组氨酸产生的方波峰电流相对于背景方波峰电流值增加了27％，这表明用修饰后玻碳电极传感器对L-组氨酸进行检测具有明显的专一性和手性识别性。

对本发明提供的检测方法的重复性进行实验。采用相同的条件分别制备了四个玻碳电极传感器，在含浓度为1nM的L-组氨酸的I-B缓冲液里分别进行4次独立的实验。图8出示了4个相同的玻碳电极传感器对浓度为1nM的L-组氨酸的检测结果。从该图8中我们可以看出四个玻碳电极传感器对L-组氨酸都产生了可重复的方波电流信号，四个结果的相对标准偏差分别是2.08％，显示了本发明提供的检测方法具有很好的重复性能。

为了检验本发明提供的检测方法对实际样品是否具有实用性，我们测试了一个人体生理基质和具有不同浓度的L-组氨酸的加标样品，当使用本发明制备的玻碳电极传感器时，向所在溶液添加5nM，50nM，0.5μM，和5μM的L-组氨酸后的回收率分别是97.772％、99.608％、99.393％和99.574％，说明该玻碳电极传感器有希望应用于复杂生物样品的分析。

Claims

1.利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，其特征在于如下步骤：

第二步：生长液的制备：把CTAB粉末溶解在浓度为0.01M的DDAB溶液中配制成双表面活性剂溶液，并且使双表面活性剂溶液中CTAB和DDAB的摩尔比为4；在该双表面活性剂溶液中，依次加入：浓度为1mM的HAuCl₄溶液，浓度为0.01M的AgNO₃溶液，浓度为0.5M H₂SO₄溶液和浓度为0.1M的丙烯酸溶液制备出生长液，该生长液的pH值为2.7；如果DDAB溶液的体积为V，则加入双表面活性剂溶液中的各溶液体积分别为：V、0.02V、0.008V和0.016V；

第五步，玻碳电极表面的预处理：

(1)玻碳电极的清洗；

2.根据权利要求1所述的利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，其特征在于：所述的I-B缓冲溶液为含有20mM Tris-HCl，pH＝7.41，140mMNaCl，20mM MgCl和20mMKCl的溶液。

3.根据权利要求1所述的利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，其特征在于：所述的玻碳电极的清洗步骤为：(a)将玻碳电极在纱布抛光纸上分别用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝抛光粉进行打磨；(b)将玻碳电极分别在乙醇和二次去离子水中超声两分钟；(c)进行电化学清洗，具体为：玻碳电极在0.5M的H₂SO₄溶液中，在-0.2和+1.6V之间进行循环伏安扫描，直到获得典型的循环伏安谱图。

4.根据权利要求1所述的利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，其特征在于：电化学方波检测选用三电极体系：工作电极是采用玻碳电极传感器的圆盘玻碳电极，电极直径2mm，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极是铂丝电极。

5.根据权利要求1所述的利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法，其特征在于：第一步中NaBH₄溶液的浓度为0.01M。