一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于分析化学和生物传感器技术领域,具体为一种检测L-组氨酸生物传感器的制备方法及其应用。另外,本发明还涉及所述的生物传感器检测L-组氨酸的方法。
背景技术
L-组氨酸(L-Histidine,L-His)作为一个神经传递介质或神经调质在哺乳动物的中枢神经系统中发挥重要作用,研究表明其在生物的重要基底里支配金属的传输和减小微小创伤的内部流血;过多L-组氨酸的摄取能导致中毒,生物体内L-组氨酸浓度的变化会导致一些疾病的发生,因此,对L-组氨酸的检测将是非常重要的。
近年来L-组氨酸测定方法主要有:电化学法(Junfei Liang,Zhengbo Chen,Lin Guo and Lidong Li,Chem.Commun.,2011,47,5476–5478);化学发光法(Johann Elbaz,Bella Shlyahovsky and Itamar Willner,Chem.Commun.,2008,1569–1571);表面增强纳曼散射法(Sujuan Ye,Yuanyuan Guo,Jie Xiao and Shusheng Zhang,Chem.Commun.,2013,49,3643--3645);荧光法(Rongmei Kong,Xiaobing Zhang,Zhuo Chen,Hongmin Meng,Zhiling Song,Weihong Tan,Guoli Shen,Ruqin Yu,Anal.Chem.2011,83,7603–7607;Nathalia Braga Amaral,Simon Zuliani,Valérie Guieu,Corinne Ravelet,Sandrine Perrier,Eric Peyrin,Anal Bioanal Chem(2014)406:1173–1179)等。这些方法各有其优点,能不同程度的满足对L-组氨酸的检测要求,但方法复杂,需要贵重的仪器,检测成本高。所以必须发展一种方法简单、成本低廉的新型检测方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及应用,以及提供一种采用所述的生物传感器检测L-组氨酸的方法。
本发明的目的是这样实现的:
一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)将0.1~10.0μmol巯基修饰DNA2在TCEP溶液中活化,再加入到1mL转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)溶液中,轻微震荡8~24小时,然后在8000~16000转/分转速下离心30分钟,用1mL的PBS洗涤三次,再将沉淀分散于1mL PBS中,得DNA2修饰转化酶-胶体金,置于4℃下储存;
(2)在20~200μL链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1,37℃下反应后,并用PBS洗涤两次,去除上清液,沉淀分散于1mL PBS缓冲液中,即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs);
(3)取1mL的DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠,加入1mL的DNA2修饰转化酶-胶体金,室温震荡反应,然后磁性分离,并用PBS洗涤3次,得L-组氨酸生物传感器。
其中:所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成:取10~200μL的转化酶加入装有1mL的胶体金的离心管内,在37℃下反应10~80分钟,在8000~16000转/分转速下离心20分钟,去除未被结合的酶,再用50μL PBS洗涤3次,得转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金);
所述的DNA1的部分序列为:5’-GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3’
所述的DNA2的部分序列为:5’-GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3。
优选地,上述的生物传感器的制备方法,其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而 成:先把制备与储存胶体金溶液所用的玻璃容器(容量瓶,棕色广口瓶,圆底烧瓶等)用王水泡洗30分钟,然后用二次水冲洗干净,烘干备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mmol/L的HAuCl4,搅拌加热至沸腾,然后快速加入5mL38.8mmol/L的Na3C6H5O7,再加热10分钟,搅拌15分钟,冷却至室温后用0.8μm的尼龙膜过滤器过滤,转移到棕色瓶中于4℃下保存。用扫描电镜观察胶体金的粒径为20-25nm。
一种利用上述方法制备的生物传感器检测L-组氨酸含量的方法,使用不同浓度的L-组氨酸加入L-组氨酸生物传感器中反应后,通过磁性分离,取出上清液。在上清液中加入10~200μL的0.5mM蔗糖溶液,37℃下反应30~180分钟,用血糖仪检测生成葡萄糖含量,以血糖仪读数(Glucose meters signal)为分析信号,进行L-组氨酸的测定。
由于上述方法制备的生物传感器可以检测L-组氨酸,因此,本发明提供了上述的生物传感器在检测L-组氨酸含量中的应用。
与现有技术相比,本发明涉及的生物传感器具有如下优点和显著地进步:金纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载转化酶,使得本发明设计的生物传感器具有高灵敏度。另外,根据实验血糖仪读数(图6)可以看出,当本发明的生物传感器用于检测L-甘氨酸,L-酪氨酸,L-精氨酸,赖氨酸和D-组氨酸时,其血糖仪读数远远低于检测L-组氨酸的血糖仪读数,这说明该生物传感器具有很高的选择性来检测L-组氨酸。其次,以血糖仪为检测仪器,操作简单、能够及时快速的提供定量的结果,检测仪器体积小、价格便宜,方便携带。再者,以磁珠为载体可以很容易实现分离和洗涤,操作简单、方便。因此,本发明涉及的生物传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
图1为检测L-组氨酸的实验原理图。
图2为DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响。横坐标为DNA2-转化酶修饰胶体金用量(Dose of NDA2-invertase-AuNPs(μL)),纵坐标为血糖仪读数(Glucose meters signal(mg/dL))
图3为DNA的杂交时间(Hybridization reaction time(min))对信号强度的影响。
图4为L-组氨酸与传感器孵育时间(Incubation time(min))对信号强度的影响。
图5为L-组氨酸溶液的标准曲线。横坐标为L-组氨酸浓度(CL-Histidine/nM)。
图6为本发明的生物传感器检测不同物质(Sample)L-甘氨酸(L-Gly),L-酪氨酸(L-Tyr),L-精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys),D-组氨酸(D-His)和L-组氨酸(L-His)的血糖仪读数。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例,对本发明的技术方案做进一步描述,但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明涉及的一种检测L-组氨酸的生物传感器,在链霉亲和素(streptavidin,SA)修饰的磁珠(magneticheads,MBs)上固定生物素(biotin)修饰的单链DNA1,通过磁性分离,再用水洗涤去除多余的DNA1,得到DNA1-MBs复合物。另外用转化酶修饰胶体金,得转化酶-胶体金,再把DNA2修饰在转化酶-胶体金上,离心后,用PBS洗涤,得DNA2-转化酶修饰胶体金。再把DNA1-MBs和DNA2-转化酶修饰胶体金混合,通过DNA1和DNA2杂交作用一段时间后,再用PBS洗涤,得到L-组氨酸传感器。
利用L-组氨酸传感器测定L-组氨酸含量:再将一定量的L-组氨酸加入所制备的L- 组氨酸传感器中,反应一段时间,通过磁性分离,取上清液并加入过量的蔗糖,反应一段时间,转化酶把蔗糖转化为葡萄糖,直接用血糖仪检测生成的葡萄糖,通过检测葡萄糖的含量来检测L-组氨酸的含量。
本发明是通过以下措施来实现的:一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)利用现有方法,制备出合适粒径的胶体金;
(2)利用转化酶与胶体金作用,将转化酶修饰在胶体金表面;
(3)利用DNA2与转化酶-胶体金作用,将巯基修饰的DNA2修饰到转化酶-胶体金上;
(4)利用DNA1与链霉亲和素修饰的磁珠作用,将DNA1-链霉亲和素修饰到磁珠上,得到DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs);
(5)利用杂交技术,构建生物传感器。
所述的DNA2修饰的转化酶-胶体金、DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠和传感器的制备包括以下步骤:
(1)将3.0μmol巯基修饰DNA2在2μL10mM的TCEP溶液中活化1.5小时,然后加入到1mL转化酶修饰胶体金溶液中,轻微震荡16小时,暗处放置48小时,将其放入离心机中在10000转/分转速下离心30分钟,用0.3mol/L NaCl溶液和1mL的PBS洗涤三次,将沉淀分散于1mL PBS中得DNA2修饰的转化酶-胶体金,置于4℃下储存备用。
(2)在100μL1.2mg/mL的链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1,使单链DNA1的终浓度是1μM,37℃反应40分钟,并用PBS洗涤,去除上清液,沉淀分散于1mL PBS缓冲液中,即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)。
(3)取1mL DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠,加入1mL DNA2修饰转化酶-胶体金,室温震荡反应30分钟,然后磁性分离,并用PBS洗涤3次,得L-组氨酸传感器。
具体的实验原理如图1所示。
本发明的检测条件,具体特征如下:
(1)DNA2-转化酶修饰胶体金用量。优选的,实验结果如图2所示。从图2可以看出,随着DNA2-转化酶修饰胶体金用量从5增加到40μL时,信号强度逐渐增加,当DNA2-转化酶修饰胶体金用量为50μL时,信号强度最大。优选的,最佳用量为50μL。
(2)DNA的杂交时间。优选的,实验结果如图3所示。从图3可以看出,反应的时间从20分钟增加到60分钟时,信号强度逐渐增大,当反应时间为70分钟时,信号强度最大。优选的,最佳杂交时间为70分钟。
(3)L-组氨酸与传感器孵育时间。优选的,实验结果如图4所示。从图4可以看出,反应的时间从10分钟增加到25分钟时,信号强度逐渐增大,当反应时间为30分钟时,信号强度最大,随后信号基本保持不变。优选的,最佳孵育时间选定为30分钟。
实施例:基于DNA杂交技术的生物传感器检测L-组氨酸
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器
怡成血糖仪(北京怡成生物电子技术有限公司)、Z-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂);Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)。
1.1.2试剂
HAuCl4、Na3C6H5O7、TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、蔗糖购于国药集团化学试剂 有限公司;转化酶购于Sigma;链霉亲和素修饰磁珠购自于天津倍思乐色谱技术开发中心。
DNA由赛百盛公司合成,序列如下:
DNA1:5’-GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3’
DNA2:5’-GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3’
磷酸缓冲溶液浓度为0.2M,磷酸盐缓冲液组成:磷酸氢二钠–磷酸二氢钠溶液。
本发明的PBS缓冲溶液为0.2M(pH7.4),其配置方法为:称取0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O及0.2g KCl溶解于1L水中即得。
1.2实验方法
1.2.1胶体金制备
先把制备与储存胶体金溶液所用的玻璃容器(容量瓶,棕色广口瓶,圆底烧瓶等)用王水泡洗30分钟,然后用二次水冲洗干净,烘干备用。
在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mmol/L的HAuCl4,搅拌加热至沸腾,然后快速加入5mL38.8mmol/L的Na3C6H5O7,再加热10分钟,搅拌15分钟,冷却至室温后用0.8μm的尼龙膜过滤器过滤,转移到棕色瓶中于4℃下保存。用扫描电镜观察胶体金的粒径为20-25nm。
1.2.2转化酶修饰胶体金制备
取100μL的转化酶加入1mL的胶体金离心管内,在37℃下反应30分钟,在12000转/分离心20分钟,去除未被结合的酶上清液,再用50μL PBS洗涤3次,得转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)。
1.2.3DNA2修饰转化酶-胶体金的制备
将3.0μmol巯基修饰DNA2在2μL10mM TCEP溶液中活化1.5小时,然后加入到1mL转化酶修饰胶体金溶液中,轻微震荡16小时,暗处放置48小时,将其放入离心机中在10000转/分转速下离心30分钟,用0.3mol/L NaCl溶液和1mL的PBS洗涤三次,将沉淀分散于1mL PBS中置于4℃下储存备用。
1.2.4DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠制备
在100μL1.2mg/mL的链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1,使单链DNA1的终浓度是1μM,37℃反应40分钟,并用PBS洗涤两次,去除上清液,沉淀分散于1mL PBS缓冲液中,即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)。
1.2.5传感器的制备
取1mL的DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠,加入1mL的DNA2修饰转化酶-胶体金,室温震荡反应30分钟,然后磁性分离,并用PBS洗涤3次,得传感器。
1.2.6L-组氨酸的测定
向10μL传感器溶液加入一定浓度的L-组氨酸,37℃反应30分钟,通过磁性分离,取出上清液。在上清液中加入100μL的0.5mM蔗糖溶液,37℃下反应2h,用血糖仪检测生成葡萄糖含量,根据血糖仪读数和L-组氨酸浓度关系得标准曲线。
2.结果与讨论
2.1实验原理
在链霉亲和素(streptavidin,SA)修饰的磁珠(magneticheads,MBs)上固定生物素(biotin)修饰的单链DNA1(通过SA-biotin相互作用),通过磁性分离,再用水洗涤去除多余的DNA1,得到DNA1-MBs复合物。另外用转化酶修饰胶体金,再把DNA2修饰在转化酶-胶体金上,离心后,用PBS洗涤,得DNA2-转化酶修饰胶体金。再把DNA1-MBs和DNA2-转化酶修饰胶体金混合,通过DNA1和DNA2杂交作用一段时间 后,再用PBS洗涤,得到L-组氨酸传感器(图1)。再将一定量的L-组氨酸加入所制备的传感器中,反应一段时间,通过磁性分离,取上清液并加入过量的蔗糖,反应一段时间,转化酶把蔗糖转化为葡萄糖,直接用血糖仪检测生成的葡萄糖,通过检测葡萄糖的含量来检测L-组氨酸的含量。
2.2DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响
实验发现,DNA2-转化酶修饰胶体金用量影响葡萄糖浓度。图2显示了DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响。结果发现,随着DNA2-转化酶修饰胶体金用量从5增加到40μL时,信号强度逐渐增加,当DNA2-转化酶修饰胶体金用量为50μL时,信号强度最大。因此,DNA2-转化酶修饰胶体金用量选为50μL。
2.3DNA的杂交时间对信号强度的影响
DNA的杂交孵化时间影响信号强度。实验结果表明,反应的时间从20分钟增加到60分钟时,信号强度逐渐增大,当反应时间为70分钟时,信号强度最大(图3),故在后续的实验中,孵育时间选定为70分钟。
2.4L-组氨酸与传感器孵育时间对信号强度的影响
L-组氨酸与传感器孵育时间影响信号强度。实验结果表明,反应的时间从10分钟增加到25分钟时,信号强度逐渐增大,当反应时间为30分钟时,信号强度最大(图4),随后信号基本保持不变。故在后续的实验中,孵育时间选定为30分钟。
2.5分析参数及工作曲线
在最佳最佳条件下,随着L-组氨酸浓度的增加,血糖仪的读数增大。依本实验方法,测定不同浓度的L-组氨酸溶液下血糖仪的读数,绘制标准工作曲线,如图5。发现L-组氨酸在0.2~500.0nM范围内与血糖仪读数呈线性关系,线性回归方程为y=0.719x+5.339(x,L-组氨酸浓度,单位:nM,R=0.998),检出限为0.08nM。对浓度为25nM的进行7此测定,RSD为3.9%。
2.6生物传感器的选择性
同时,考察了该传感器的选择性。图6为本发明的生物传感器检测L-甘氨酸(L-Gly),L-酪氨酸(L-Tyr),L-精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys),D-组氨酸(D-His)和L-组氨酸(L-His)的血糖仪读数,从图6可以看出,检测L-甘氨酸(L-Gly),L-酪氨酸(L-Tyr),L-精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys),D-组氨酸(D-His)读数远远低于检测L-组氨酸(L-His)的读数,说明该生物传感器检测L-组氨酸具有很高的选择性。
2.7实际样品中L-组氨酸含量的测定
使用建立的方法测定了血液中L-组氨酸的含量。测得的L-组氨酸的浓度如表1所示。并通过回收实验考察了方法的准确度与精密度,回收率在94.0%-101.4%之间。
表1实际样品中L-组氨酸含量的测定结果
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。