CN104049087A - 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104049087A CN104049087A CN201410246965.9A CN201410246965A CN104049087A CN 104049087 A CN104049087 A CN 104049087A CN 201410246965 A CN201410246965 A CN 201410246965A CN 104049087 A CN104049087 A CN 104049087A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- histidine
- invertase
- collaurum
- minutes
- dna2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 149
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 title claims abstract description 76
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims abstract description 40
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 20
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- NICDRCVJGXLKSF-UHFFFAOYSA-N nitric acid;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.O[N+]([O-])=O NICDRCVJGXLKSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 abstract 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 7
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical class OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000790 scattering method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000009131 zhiling Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用。首先，在链霉亲和素(streptavidin，SA)修饰的磁珠(magneticheads，MBs)上固定生物素(biotin)修饰的单链DNA1，得到DNA1-MBs复合物。另外，用DNA2和转化酶修饰胶体金，得DNA2-转化酶修饰胶体金。再把DNA1-MBs和DNA2-转化酶修饰胶体金混合，得到L-组氨酸传感器。再将一定量的L-组氨酸加入所制备的L-组氨酸传感器中反应一段时间，通过磁性分离，取上清液并加入蔗糖，反应一段时间，转化酶把蔗糖转化为葡萄糖，直接用血糖仪检测生成的葡萄糖，通过检测葡萄糖的含量来检测L-组氨酸的含量。本发明的传感器具有高的灵敏度、选择性；以血糖仪为检测仪器和磁珠为载体，操作简单，检测仪器体积小、价格便宜、方便携带。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和生物传感器技术领域，具体为一种检测L-组氨酸生物传感器的制备方法及其应用。另外，本发明还涉及所述的生物传感器检测L-组氨酸的方法。
背景技术
L-组氨酸(L-Histidine，L-His)作为一个神经传递介质或神经调质在哺乳动物的中枢神经系统中发挥重要作用，研究表明其在生物的重要基底里支配金属的传输和减小微小创伤的内部流血；过多L-组氨酸的摄取能导致中毒，生物体内L-组氨酸浓度的变化会导致一些疾病的发生，因此，对L-组氨酸的检测将是非常重要的。
近年来L-组氨酸测定方法主要有：电化学法(Junfei Liang,Zhengbo Chen,Lin Guo and Lidong Li,Chem.Commun.,2011,47,5476–5478)；化学发光法(Johann Elbaz,Bella Shlyahovsky and Itamar Willner,Chem.Commun.,2008,1569–1571)；表面增强纳曼散射法(Sujuan Ye,Yuanyuan Guo,Jie Xiao and Shusheng Zhang,Chem.Commun.,2013,49,3643--3645)；荧光法(Rongmei Kong,Xiaobing Zhang,Zhuo Chen,Hongmin Meng,Zhiling Song,Weihong Tan,Guoli Shen,Ruqin Yu,Anal.Chem.2011,83,7603–7607；Nathalia Braga Amaral,Simon Zuliani,Valérie Guieu,Corinne Ravelet,Sandrine Perrier,Eric Peyrin,Anal Bioanal Chem(2014)406:1173–1179)等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对L-组氨酸的检测要求，但方法复杂，需要贵重的仪器，检测成本高。所以必须发展一种方法简单、成本低廉的新型检测方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及应用，以及提供一种采用所述的生物传感器检测L-组氨酸的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.1～10.0μmol巯基修饰DNA2在TCEP溶液中活化，再加入到1mL转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)溶液中，轻微震荡8～24小时，然后在8000～16000转/分转速下离心30分钟，用1mL的PBS洗涤三次，再将沉淀分散于1mL PBS中，得DNA2修饰转化酶-胶体金，置于4℃下储存；
(2)在20～200μL链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1，37℃下反应后，并用PBS洗涤两次，去除上清液，沉淀分散于1mL PBS缓冲液中，即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)；
(3)取1mL的DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠，加入1mL的DNA2修饰转化酶-胶体金，室温震荡反应，然后磁性分离，并用PBS洗涤3次，得L-组氨酸生物传感器。
其中：所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成：取10～200μL的转化酶加入装有1mL的胶体金的离心管内，在37℃下反应10～80分钟，在8000～16000转/分转速下离心20分钟，去除未被结合的酶，再用50μL PBS洗涤3次，得转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)；
所述的DNA1的部分序列为：5’-GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3’
所述的DNA2的部分序列为：5’-GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3。
优选地，上述的生物传感器的制备方法，其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而 成：先把制备与储存胶体金溶液所用的玻璃容器(容量瓶，棕色广口瓶，圆底烧瓶等)用王水泡洗30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用。在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mmol/L的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入5mL38.8mmol/L的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温后用0.8μm的尼龙膜过滤器过滤，转移到棕色瓶中于4℃下保存。用扫描电镜观察胶体金的粒径为20-25nm。
一种利用上述方法制备的生物传感器检测L-组氨酸含量的方法，使用不同浓度的L-组氨酸加入L-组氨酸生物传感器中反应后，通过磁性分离，取出上清液。在上清液中加入10～200μL的0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应30～180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数(Glucose meters signal)为分析信号，进行L-组氨酸的测定。
由于上述方法制备的生物传感器可以检测L-组氨酸，因此，本发明提供了上述的生物传感器在检测L-组氨酸含量中的应用。
与现有技术相比，本发明涉及的生物传感器具有如下优点和显著地进步：金纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载转化酶，使得本发明设计的生物传感器具有高灵敏度。另外，根据实验血糖仪读数(图6)可以看出，当本发明的生物传感器用于检测L-甘氨酸，L-酪氨酸，L-精氨酸，赖氨酸和D-组氨酸时，其血糖仪读数远远低于检测L-组氨酸的血糖仪读数，这说明该生物传感器具有很高的选择性来检测L-组氨酸。其次，以血糖仪为检测仪器，操作简单、能够及时快速的提供定量的结果，检测仪器体积小、价格便宜，方便携带。再者，以磁珠为载体可以很容易实现分离和洗涤，操作简单、方便。因此，本发明涉及的生物传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
图1为检测L-组氨酸的实验原理图。
图2为DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响。横坐标为DNA2-转化酶修饰胶体金用量(Dose of NDA2-invertase-AuNPs(μL))，纵坐标为血糖仪读数(Glucose meters signal(mg/dL))
图3为DNA的杂交时间(Hybridization reaction time(min))对信号强度的影响。
图4为L-组氨酸与传感器孵育时间(Incubation time(min))对信号强度的影响。
图5为L-组氨酸溶液的标准曲线。横坐标为L-组氨酸浓度(CL-Histidine/nM)。
图6为本发明的生物传感器检测不同物质(Sample)L-甘氨酸(L-Gly)，L-酪氨酸(L-Tyr)，L-精氨酸(L-Arg)，赖氨酸(L-Lys)，D-组氨酸(D-His)和L-组氨酸(L-His)的血糖仪读数。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明涉及的一种检测L-组氨酸的生物传感器，在链霉亲和素(streptavidin，SA)修饰的磁珠(magneticheads，MBs)上固定生物素(biotin)修饰的单链DNA1，通过磁性分离，再用水洗涤去除多余的DNA1，得到DNA1-MBs复合物。另外用转化酶修饰胶体金，得转化酶-胶体金，再把DNA2修饰在转化酶-胶体金上，离心后，用PBS洗涤，得DNA2-转化酶修饰胶体金。再把DNA1-MBs和DNA2-转化酶修饰胶体金混合，通过DNA1和DNA2杂交作用一段时间后，再用PBS洗涤，得到L-组氨酸传感器。
利用L-组氨酸传感器测定L-组氨酸含量：再将一定量的L-组氨酸加入所制备的L- 组氨酸传感器中，反应一段时间，通过磁性分离，取上清液并加入过量的蔗糖，反应一段时间，转化酶把蔗糖转化为葡萄糖，直接用血糖仪检测生成的葡萄糖，通过检测葡萄糖的含量来检测L-组氨酸的含量。
本发明是通过以下措施来实现的：一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用现有方法，制备出合适粒径的胶体金；
(2)利用转化酶与胶体金作用，将转化酶修饰在胶体金表面；
(3)利用DNA2与转化酶-胶体金作用，将巯基修饰的DNA2修饰到转化酶-胶体金上；
(4)利用DNA1与链霉亲和素修饰的磁珠作用，将DNA1-链霉亲和素修饰到磁珠上，得到DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)；
(5)利用杂交技术，构建生物传感器。
所述的DNA2修饰的转化酶-胶体金、DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠和传感器的制备包括以下步骤：
(1)将3.0μmol巯基修饰DNA2在2μL10mM的TCEP溶液中活化1.5小时，然后加入到1mL转化酶修饰胶体金溶液中，轻微震荡16小时，暗处放置48小时，将其放入离心机中在10000转/分转速下离心30分钟，用0.3mol/L NaCl溶液和1mL的PBS洗涤三次，将沉淀分散于1mL PBS中得DNA2修饰的转化酶-胶体金，置于4℃下储存备用。
(2)在100μL1.2mg/mL的链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1，使单链DNA1的终浓度是1μM，37℃反应40分钟，并用PBS洗涤，去除上清液，沉淀分散于1mL PBS缓冲液中，即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)。
(3)取1mL DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠，加入1mL DNA2修饰转化酶-胶体金，室温震荡反应30分钟，然后磁性分离，并用PBS洗涤3次，得L-组氨酸传感器。
具体的实验原理如图1所示。
本发明的检测条件，具体特征如下：
(1)DNA2-转化酶修饰胶体金用量。优选的，实验结果如图2所示。从图2可以看出，随着DNA2-转化酶修饰胶体金用量从5增加到40μL时，信号强度逐渐增加，当DNA2-转化酶修饰胶体金用量为50μL时，信号强度最大。优选的，最佳用量为50μL。
(2)DNA的杂交时间。优选的，实验结果如图3所示。从图3可以看出，反应的时间从20分钟增加到60分钟时，信号强度逐渐增大，当反应时间为70分钟时，信号强度最大。优选的，最佳杂交时间为70分钟。
(3)L-组氨酸与传感器孵育时间。优选的，实验结果如图4所示。从图4可以看出，反应的时间从10分钟增加到25分钟时，信号强度逐渐增大，当反应时间为30分钟时，信号强度最大，随后信号基本保持不变。优选的，最佳孵育时间选定为30分钟。
实施例：基于DNA杂交技术的生物传感器检测L-组氨酸
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器
怡成血糖仪(北京怡成生物电子技术有限公司)、Z-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)。
1.1.2试剂
HAuCl4、Na3C6H5O7、TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、蔗糖购于国药集团化学试剂 有限公司；转化酶购于Sigma；链霉亲和素修饰磁珠购自于天津倍思乐色谱技术开发中心。
DNA由赛百盛公司合成，序列如下：
DNA1:5’-GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3’
DNA2:5’-GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3’
磷酸缓冲溶液浓度为0.2M，磷酸盐缓冲液组成：磷酸氢二钠–磷酸二氢钠溶液。
本发明的PBS缓冲溶液为0.2M(pH7.4)，其配置方法为：称取0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O及0.2g KCl溶解于1L水中即得。
1.2实验方法
1.2.1胶体金制备
先把制备与储存胶体金溶液所用的玻璃容器(容量瓶，棕色广口瓶，圆底烧瓶等)用王水泡洗30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用。
在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mmol/L的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入5mL38.8mmol/L的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温后用0.8μm的尼龙膜过滤器过滤，转移到棕色瓶中于4℃下保存。用扫描电镜观察胶体金的粒径为20-25nm。
1.2.2转化酶修饰胶体金制备
取100μL的转化酶加入1mL的胶体金离心管内，在37℃下反应30分钟，在12000转/分离心20分钟，去除未被结合的酶上清液，再用50μL PBS洗涤3次，得转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)。
1.2.3DNA2修饰转化酶-胶体金的制备
将3.0μmol巯基修饰DNA2在2μL10mM TCEP溶液中活化1.5小时，然后加入到1mL转化酶修饰胶体金溶液中，轻微震荡16小时，暗处放置48小时，将其放入离心机中在10000转/分转速下离心30分钟，用0.3mol/L NaCl溶液和1mL的PBS洗涤三次，将沉淀分散于1mL PBS中置于4℃下储存备用。
1.2.4DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠制备
在100μL1.2mg/mL的链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1，使单链DNA1的终浓度是1μM，37℃反应40分钟，并用PBS洗涤两次，去除上清液，沉淀分散于1mL PBS缓冲液中，即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)。
1.2.5传感器的制备
取1mL的DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠，加入1mL的DNA2修饰转化酶-胶体金，室温震荡反应30分钟，然后磁性分离，并用PBS洗涤3次，得传感器。
1.2.6L-组氨酸的测定
向10μL传感器溶液加入一定浓度的L-组氨酸，37℃反应30分钟，通过磁性分离，取出上清液。在上清液中加入100μL的0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应2h，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，根据血糖仪读数和L-组氨酸浓度关系得标准曲线。
2.结果与讨论
2.1实验原理
在链霉亲和素(streptavidin，SA)修饰的磁珠(magneticheads，MBs)上固定生物素(biotin)修饰的单链DNA1(通过SA-biotin相互作用)，通过磁性分离，再用水洗涤去除多余的DNA1，得到DNA1-MBs复合物。另外用转化酶修饰胶体金，再把DNA2修饰在转化酶-胶体金上，离心后，用PBS洗涤，得DNA2-转化酶修饰胶体金。再把DNA1-MBs和DNA2-转化酶修饰胶体金混合，通过DNA1和DNA2杂交作用一段时间 后，再用PBS洗涤，得到L-组氨酸传感器(图1)。再将一定量的L-组氨酸加入所制备的传感器中，反应一段时间，通过磁性分离，取上清液并加入过量的蔗糖，反应一段时间，转化酶把蔗糖转化为葡萄糖，直接用血糖仪检测生成的葡萄糖，通过检测葡萄糖的含量来检测L-组氨酸的含量。
2.2DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响
实验发现，DNA2-转化酶修饰胶体金用量影响葡萄糖浓度。图2显示了DNA2-转化酶修饰胶体金用量对信号强度的影响。结果发现，随着DNA2-转化酶修饰胶体金用量从5增加到40μL时，信号强度逐渐增加，当DNA2-转化酶修饰胶体金用量为50μL时，信号强度最大。因此，DNA2-转化酶修饰胶体金用量选为50μL。
2.3DNA的杂交时间对信号强度的影响
DNA的杂交孵化时间影响信号强度。实验结果表明，反应的时间从20分钟增加到60分钟时，信号强度逐渐增大，当反应时间为70分钟时，信号强度最大(图3)，故在后续的实验中，孵育时间选定为70分钟。
2.4L-组氨酸与传感器孵育时间对信号强度的影响
L-组氨酸与传感器孵育时间影响信号强度。实验结果表明，反应的时间从10分钟增加到25分钟时，信号强度逐渐增大，当反应时间为30分钟时，信号强度最大(图4)，随后信号基本保持不变。故在后续的实验中，孵育时间选定为30分钟。
2.5分析参数及工作曲线
在最佳最佳条件下，随着L-组氨酸浓度的增加，血糖仪的读数增大。依本实验方法，测定不同浓度的L-组氨酸溶液下血糖仪的读数，绘制标准工作曲线，如图5。发现L-组氨酸在0.2～500.0nM范围内与血糖仪读数呈线性关系，线性回归方程为y＝0.719x+5.339(x，L-组氨酸浓度，单位：nM，R＝0.998)，检出限为0.08nM。对浓度为25nM的进行7此测定，RSD为3.9％。
2.6生物传感器的选择性
同时，考察了该传感器的选择性。图6为本发明的生物传感器检测L-甘氨酸(L-Gly)，L-酪氨酸(L-Tyr)，L-精氨酸(L-Arg)，赖氨酸(L-Lys)，D-组氨酸(D-His)和L-组氨酸(L-His)的血糖仪读数，从图6可以看出，检测L-甘氨酸(L-Gly)，L-酪氨酸(L-Tyr)，L-精氨酸(L-Arg)，赖氨酸(L-Lys)，D-组氨酸(D-His)读数远远低于检测L-组氨酸(L-His)的读数，说明该生物传感器检测L-组氨酸具有很高的选择性。
2.7实际样品中L-组氨酸含量的测定
使用建立的方法测定了血液中L-组氨酸的含量。测得的L-组氨酸的浓度如表1所示。并通过回收实验考察了方法的准确度与精密度，回收率在94.0％-101.4％之间。
表1实际样品中L-组氨酸含量的测定结果
an＝7
。
Claims (5)
1.一种检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)将0.1～10.0μmol巯基修饰DNA2在TCEP溶液中活化，再加入到1mL转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)溶液中，轻微震荡8～24小时，然后在8000～16000转/分转速下离心30分钟，用1mL的PBS洗涤三次，再将沉淀分散于1mL的PBS中，得DNA2修饰转化酶-胶体金，置于4℃下储存；
(2)在20～200μL链霉亲和素修饰的磁珠中加入biotin修饰的单链DNA1，37℃下反应后，并用PBS洗涤两次，去除上清液，沉淀分散于1mL PBS缓冲液中，即得DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠(DNA1-MBs)；
(3)取1mL的DNA1-链霉亲和素修饰的磁珠，加入1mL的DNA2修饰转化酶-胶体金，室温震荡反应，然后磁性分离，并用PBS洗涤3次，得L-组氨酸生物传感器；
其中：所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成：取10～200μL的转化酶加入装有1mL的胶体金的离心管内，在37℃下反应10～80分钟，在8000～16000转/分转速下离心20分钟，去除未被结合的酶，再用50μL的PBS洗涤3次，得转化酶修饰胶体金(转化酶-胶体金)；
优选的，所述的DNA1的部分序列为：5’-GAG TGA TAT GAA GGA TGG GCG TGT CGG GGC TAT TCT CTA C-biotin-3’；
优选的，所述的DNA2的部分序列为：5’-GTA GAG AAG GATr ATC ACT CAG C-SH-3’；
其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而成：先把制备与储存胶体金溶液所用的玻璃容器(容量瓶，棕色广口瓶，圆底烧瓶等)用王水泡洗30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用；在100mL圆底烧瓶中加入50mL1mmol/L的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入5mL38.8mmol/L的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温后用0.8μm的尼龙膜过滤器过滤，转移到棕色瓶中于4℃下保存；用扫描电镜观察胶体金的粒径为20-25nm。
2.一种利用权利要求1制备的生物传感器检测L-组氨酸含量的方法，其特征在于：使用不同浓度的L-组氨酸加入L-组氨酸生物传感器中反应后，通过磁性分离，取出上清液；在上清液中加入10～200μL的0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应30～180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数为分析信号，进行L-组氨酸的测定。
3.根据权利要求1所述的生物传感器在检测L-组氨酸含量中的应用。
4.根据权利要求1的检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于所述磷酸缓冲液为0.1M，pH＝8.0的配制方法：称取0.1g KH2PO4、1.45g Na2HPO4·12H2O溶解于1L水中，即得。
5.根据权利要求1的检测L-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于所述PBS缓冲溶液为0.2M(pH＝7.4)，其配置方法为：称取0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O及0.2g KCl溶解于1L水中即得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410246965.9A CN104049087B (zh) | 2014-06-05 | 2014-06-05 | 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410246965.9A CN104049087B (zh) | 2014-06-05 | 2014-06-05 | 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104049087A true CN104049087A (zh) | 2014-09-17 |
| CN104049087B CN104049087B (zh) | 2015-10-07 |
Family
ID=51502191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410246965.9A Active CN104049087B (zh) | 2014-06-05 | 2014-06-05 | 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104049087B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104833802A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-08-12 | 中国农业大学 | 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法 |
| CN106350576A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-01-25 | 河南科技大学 | 一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法 |
| CN107478823A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-12-15 | 长沙理工大学 | 一种基于乙酰胆碱酯酶信号放大原理检测双酚a的方法 |
| CN109115737A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 青岛大学 | 一种三螺旋pH生物传感器及其应用 |
| CN109750081A (zh) * | 2017-11-03 | 2019-05-14 | 重庆医科大学 | 基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器 |
| CN109781989A (zh) * | 2017-11-10 | 2019-05-21 | 上海瀚联医疗技术股份有限公司 | 血糖测试的方法及生物传感器 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002001225A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | Minerva Biotechnologies Corporation | Tandem signaling assay |
| CN102495125A (zh) * | 2011-12-07 | 2012-06-13 | 北京航空航天大学 | 利用dna序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测l-组氨酸的方法 |
| CN103025885A (zh) * | 2010-05-26 | 2013-04-03 | 伊利诺伊大学评议会 | 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计 |
| CN103278621A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-09-04 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种利用生物传感器与血糖仪检测转录因子的方法 |
| CN103364566A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-10-23 | 福州大学 | 一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法 |
| CN103822890A (zh) * | 2014-02-27 | 2014-05-28 | 中南大学 | 一种用于atp检测的方法及其配套的光学适配子传感器 |
-
2014
- 2014-06-05 CN CN201410246965.9A patent/CN104049087B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002001225A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | Minerva Biotechnologies Corporation | Tandem signaling assay |
| CN103025885A (zh) * | 2010-05-26 | 2013-04-03 | 伊利诺伊大学评议会 | 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计 |
| CN102495125A (zh) * | 2011-12-07 | 2012-06-13 | 北京航空航天大学 | 利用dna序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测l-组氨酸的方法 |
| CN103278621A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-09-04 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种利用生物传感器与血糖仪检测转录因子的方法 |
| CN103364566A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-10-23 | 福州大学 | 一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法 |
| CN103822890A (zh) * | 2014-02-27 | 2014-05-28 | 中南大学 | 一种用于atp检测的方法及其配套的光学适配子传感器 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LIANG J.,ET AL.: "Electrochemical sensing of L-histidine based on structure-switching DNAzymes and gold nanoparticle-graphene nanosheet composites.", 《CHEM.COMMUN.》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104833802A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-08-12 | 中国农业大学 | 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法 |
| CN106350576A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-01-25 | 河南科技大学 | 一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法 |
| CN107478823A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-12-15 | 长沙理工大学 | 一种基于乙酰胆碱酯酶信号放大原理检测双酚a的方法 |
| CN107478823B (zh) * | 2017-08-01 | 2019-05-24 | 长沙理工大学 | 一种基于乙酰胆碱酯酶信号放大原理检测双酚a的方法 |
| CN109750081A (zh) * | 2017-11-03 | 2019-05-14 | 重庆医科大学 | 基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器 |
| CN109781989A (zh) * | 2017-11-10 | 2019-05-21 | 上海瀚联医疗技术股份有限公司 | 血糖测试的方法及生物传感器 |
| CN109115737A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 青岛大学 | 一种三螺旋pH生物传感器及其应用 |
| CN109115737B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-03-26 | 青岛大学 | 一种三螺旋pH生物传感器及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104049087B (zh) | 2015-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104049087B (zh) | 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用 | |
| Mittal et al. | Biosensors for breast cancer diagnosis: A review of bioreceptors, biotransducers and signal amplification strategies | |
| Jeong et al. | Integrated magneto–electrochemical sensor for exosome analysis | |
| Dong et al. | Highly sensitive electrochemical detection of tumor exosomes based on aptamer recognition-induced multi-DNA release and cyclic enzymatic amplification | |
| Li et al. | Highly sensitive and homogeneous detection of membrane protein on a single living cell by aptamer and nicking enzyme assisted signal amplification based on microfluidic droplets | |
| Lu et al. | Biotin-triggered decomposable immunomagnetic beads for capture and release of circulating tumor cells | |
| Wang et al. | Numerous long single-stranded DNAs produced by dual amplification reactions for electrochemical detection of exosomal microRNAs | |
| Li et al. | A rapid and facile detection for specific small-sized amino acids based on target-triggered destruction of metal organic frameworks | |
| CN108169303A (zh) | 基于金属有机框架材料作为信号探针的核酸适配体电化学传感器 | |
| Hong et al. | A review of biosensors for detecting tumor markers in breast cancer | |
| Celikbas et al. | A bottom-up approach for developing aptasensors for abused drugs: biosensors in forensics | |
| CN106066324B (zh) | 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法 | |
| CN106908429B (zh) | 一种检测谷胱甘肽的方法 | |
| CN104931684B (zh) | 一种纳米荧光传感器及其制备方法和应用 | |
| Tao et al. | Tailored biosensors for drug screening, efficacy assessment, and toxicity evaluation | |
| CN105510420A (zh) | 一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法 | |
| CN104655759A (zh) | 一种适配体功能化磁性纳米材料吸附双酚a检测回收率的方法 | |
| CN104165874A (zh) | 一种量子点荧光阿司匹林印迹传感器及其制备方法和应用 | |
| Molaakbari et al. | First electrochemical report for simultaneous determination of norepinephrine, tyrosine and nicotine using a nanostructure based sensor | |
| CN104330453A (zh) | 一种基于壳聚糖及其衍生物的手性传感器及其制备方法 | |
| CN106932371B (zh) | 一种细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法 | |
| Li et al. | Autonomously driving multiplexed hierarchical hybridization chain reaction of a DNA cobweb sensor for monitoring intracellular microRNA | |
| Jalali et al. | MoS2-Plasmonic nanocavities for Raman spectra of single extracellular vesicles reveal molecular progression in glioblastoma | |
| Gao et al. | Visual detection of alkaline phosphatase based on ascorbic acid-triggered gel-sol transition of alginate hydrogel | |
| Sugai et al. | Microfluidic sensing system with a multichannel surface plasmon resonance chip: damage-free characterization of cells by pattern recognition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 266000 front building village, Mingcun Town, Pingdu City, Qingdao, Shandong Patentee after: Qingdao University of Science & Technology Address before: 266000 Shandong province Qingdao City, No. 53 Zhengzhou Road, College of chemistry and Molecular Engineering Patentee before: Qingdao University of Science & Technology |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180517 Address after: 200120 room 304, 3 lane, 720 lane, Cai Lun Road, Shanghai free trade zone. Patentee after: Kai Hui Sagi Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. Address before: 266000 Qian Lou village, Mingcun Town, Pingdu City, Qingdao, Shandong Patentee before: Qingdao University of Science & Technology |
|
| TR01 | Transfer of patent right |