CN109115737B - 一种三螺旋pH生物传感器及其应用 - Google Patents

一种三螺旋pH生物传感器及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109115737B
CN109115737B CN201810847896.5A CN201810847896A CN109115737B CN 109115737 B CN109115737 B CN 109115737B CN 201810847896 A CN201810847896 A CN 201810847896A CN 109115737 B CN109115737 B CN 109115737B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chain
sequence
biosensor
hairpin
magnetic bead
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810847896.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109115737A (zh
Inventor
毕赛
齐洪杰
李园芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao University
Original Assignee
Qingdao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao University filed Critical Qingdao University
Priority to CN201810847896.5A priority Critical patent/CN109115737B/zh
Publication of CN109115737A publication Critical patent/CN109115737A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109115737B publication Critical patent/CN109115737B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种三螺旋pH生物传感器及其应用，通过改变pH值即可实现DNA的模块化组装。因此，基于不同pH值下DNA组装方式的不同可实现pH值在4.0到9.0范围内信号的快速、准确响应，具有成本低廉、操作简便、反应快速、灵敏度高等优点，该体系有望应用于基于pH值控制的DNA纳米技术的生物诊断领域，在药物输送等方面具有潜在的应用前景。

Description

一种三螺旋pH生物传感器及其应用
技术领域
本发明涉及一种三螺旋pH生物传感器及其应用，属于生物传感器制备领域。
背景技术
从化学反应到生命有机体，不论是简单的变化或是复杂的反应都与pH值密切相关。对pH值进行监测，能帮助人们更好地理解微观世界的变化。例如，人体体液pH值异常会影响免疫系统或神经系统，甚至与癌症等重大疾病密切相关。因此，对pH值及其变化进行精准测量具有重要意义。
目前，pH测量方法主要有pH试纸、氢电极、醌氢醌电极、锑电极、Pd-H pH指示电极、光导纤维pH传感器等。pH试纸操作简便，但是测量结果人为误差较大，不适合精准测量。醌氢醌电极虽制备简单、使用方便、电位精确，但却不能长久放置，且在pH>8时不能使用，易受氧化剂、还原剂的影响。锑pH指示电极很大程度上依赖于电极表面的状态，所以表现出较差的稳定性和重现性。氢电极由于装置的复杂性，一般只用做pH测定的基准参考电极，即标准氢电极。Pd-H pH指示电极制备简单，pH测量范围广，可用于非水体系的检测，但其不耐高温，强度不高，难以用于特殊环境下pH的测量。光导纤维pH传感器测量精度高，但其pH值的线性范围一般较窄。随着现代环境科学、生命医学、分析科学等的进步与发展，对pH值的检测提出越来越多的要求，传统pH检测方法面临极大的挑战。
因此，目前需要研究一种操作简便、成本低廉、检测范围宽、测量精准、性能稳定的pH值检测方法。
发明内容
本发明基于不同pH值下DNA杂交过程的不同设计生物传感器，实现对pH值的精准检测，有望为生物医学的研究提供有效信息，对相关疾病的诊断和临床研究具有重要意义。
本发明的目的之一是提供一种三螺旋pH生物传感器。
本发明的目的之二是提供所述三螺旋pH生物传感器的应用。
本发明的目的之三是提供一种检测pH的方法。
为实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
首先，本发明提供一种三螺旋pH生物传感器，该生物传感器包括两种发夹DNA(H1和H2)、单链引发DNA(I)、捕获探针(UT)和羧基化磁珠，各链的结构特点是：H1链从5'端至3'端依次包括序列a、序列b、序列c和序列b*，5'末端修饰荧光基团；H2链从5'端至3'端依次包括序列b*、序列a*、序列b和序列c*，3'末端修饰荧光基团；I链从5'端至3'端依次包括序列b*和序列a*，3'末端修饰氨基，I链3'末端的氨基与羧基化磁珠能够形成I链/磁珠复合物；UT链从5'端至3'端的序列为b；其中，所述序列a和a*为互补序列，序列b和b*为互补序列，序列c和c*为互补序列。
其次，本发明提供所述三螺旋pH生物传感器在检测pH中的应用。
最后，本发明提供一种检测pH的方法，该方法包括使用所述三螺旋pH生物传感器进行检测的步骤。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
基于不同pH值下DNA组装方式的不同可实现pH值在4.0到9.0范围内信号的快速、准确响应，具有成本低廉、操作简便、反应快速、灵敏度高等优点，该体系有望应用于基于pH值控制的DNA纳米技术的生物诊断领域，即可通过不同pH值下DNA组装方式的不同诊断疾病的发生与发展，在药物输送等方面具有潜在的应用前景。
附图说明
构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明的实验原理图。
图2是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3是荧光标准工作曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有的pH检测方法存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种三螺旋pH生物传感器，该生物传感器体系包括两种发夹DNA(H1和H2)、单链引发DNA(I)、捕获探针(UT)和羧基化磁珠，各链的结构特点是：H1链从5'端至3'端依次包括序列a、序列b、序列c和序列b*，5'末端修饰荧光基团；H2链从5'端至3'端依次包括序列b*、序列a*、序列b和序列c*，3'末端修饰荧光基团；I链从5'端至3'端依次包括序列b*和序列a*，3'末端修饰氨基，I链3'末端的氨基与羧基化磁珠能够形成I链/磁珠复合物；UT链从5'端至3'端的序列为b；其中，所述序列a和a*为互补序列，序列b和b*为互补序列，序列c和c*为互补序列。
在本发明的一个实施方式中，在酸性条件下，发夹H1链、H2链的双螺旋茎部与UT链结合，形成反Hoogsteen键的三螺旋发夹结构M1、M2；加入I链/磁珠复合物后，I链无法发生toehold介导的链取代反应。
优选的，所述酸性条件是指pH＝4.0-6.0。
在本发明的一个实施方式中，在中性及碱性条件下，发夹H1链、H2链与UT链共存在溶液中，无法形成三螺旋结构；加入I链/磁珠复合物后，基于toehold介导的链取代反应，I链序列a*与H1链的toehold区域a互补杂交，引发链迁移过程，使H1链的发夹结构打开，裸露出c-b*序列；溶液中H2链的toehold区域c*与H1链打开后裸露的单链DNA序列c互补杂交，引发链迁移过程，使H2链的发夹结构打开，裸露出a*-b*序列；H2链打开后裸露的单链DNA序列a*-b*与I链的序列相同，引发新一轮反应，继而实现H1链、H2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链DNA结构。
优选的，所述中性及碱性条件是指pH＝7.0-9.0。
在本发明的一个实施方式中，本发明所述的互补序列为完全互补序列。
在本发明的一个实施方式中，提供了序列a、序列b、序列c、序列a*、序列b*、序列c*的具体序列，分别为：5'-TACAGC-3'，5'-GAGGAAGGGAGAAGAGGA-3'，5'-TAGGAG-3'，5'-GCTGTA-3'，5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTC-3'，5'-CTCCTA-3'。
在本发明的一个实施方式中，所述I链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTA-3'，如SEQ ID NO:1所示，H1链的序列为5'-TACAGCGAGGAAGGGAGAAGAGGATAGGAGTCCTCTTCTCCCTTCCTC-3'，如SEQ ID NO:2所示，H2链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTAGAGGAAGGGAGAAGAGGACTCCTA-3'，如SEQ ID NO:3所示，UT链的序列为5'-GAGGAAGGGAGAAGAGGA-3'，如SEQ ID NO:4所示。
需要说明的是，本发明不仅仅限于以上具体序列，还可以是其他的序列，根据上述各链的结构特点，本领域的技术人员可设计多种序列，以实现本发明的发明目的。
在本发明的一个实施方式中，所述荧光基团为Alexa Fluor488，该荧光基团的荧光特性不随pH变化。
在本发明的一个实施方式中，所述磁珠为聚苯乙烯磁珠，可较好的实现磁分离。
在本发明的一个典型实施方式中，提供所述三螺旋pH生物传感器在检测pH中的应用。
在本发明的又一个典型实施方式中，本发明提供一种检测pH的方法，该方法包括使用所述三螺旋pH生物传感器进行检测的步骤。
在本发明的一个实施方式中，待检测样品包括但不限于缓冲液或者其他不同pH值的溶液，例如，生物机体的体液。
在本发明的一个实施方式中，提供一种检测pH的方法，该方法包括：
(1)制作标准曲线：
用pH＝7.0的TAE缓冲液稀释引发链I链、发夹H1链、H2链和捕获探针UT链；
发夹H1链和H2链分别退火；
制备I链/磁珠复合物(pH＝7.0)；
取退火后的发夹H1链和H2链各2μL与4μL UT链混合，并加入到不同pH值(pH＝4.0-9.0)的TAE缓冲液中进行反应；优选的，所述反应条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为20～40min；
取2μL I链/磁珠复合物加入到所述不同pH值的TAE缓冲液中进行反应；优选的，所述反应条件为：反应温度为25～30℃，反应时间为1～2h；
将上述反应结束后的混合液进行磁分离，得到不同pH值的上清液；
对不同pH值的上清液进行荧光检测，得到不同pH值样品对应的荧光光谱图；
根据不同pH值样品荧光光谱图在530nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；
(2)取待检测样品，按照步骤(1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品的pH值。
在本发明的一个实施方式中，发夹H1链和H2链的退火，包括以下步骤：
将H1链、H2链溶液分别加热至90～95℃ 5～10min，随即以0.1～0.3℃/s冷却至25～30℃，并于25～30℃下继续稳定2～3h。
在本发明的一个实施方式中，所述I链/磁珠复合物的制备方法，包括以下步骤：
采用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤羧基化磁珠，然后采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(0.1M)活化羧基；优选的，活化条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为20～40min；
将反应后的体系用pH＝7.0磷酸缓冲溶液进行洗涤，去除多余的EDC；
将氨基化的引发链I链加入到上述磁珠分散液中进行反应，制备得到I链/磁珠复合物；优选的，所述反应条件为：反应温度为35～40℃，反应时间为10～15h。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1实验原理
实验原理如图1所示，该体系由两种发夹DNA(H1和H2)、单链引发DNA(I)和捕获探针(UT)组成。其中发夹H1链的5'末端和H2链的3'末端分别修饰荧光基团Alexa Fluor488。体系中引入了羧基化的聚苯乙烯磁珠，3'末端修饰氨基的引发链I链可以通过酰胺反应连接到磁珠表面，得到I链/磁珠复合物。酸性条件下(pH＝4.0-6.0)，发夹H1链、H2链的双螺旋茎部与UT链结合，形成反Hoogsteen键的三螺旋发夹结构M1、M2。加入I链/磁珠复合物后，I链无法发生toehold介导的链取代反应。磁分离后，对上清液进行荧光光谱扫描，可检测到荧光信号。
在中性及碱性条件下(pH＝7.0-9.0)，发夹H1链、H2链与UT链共存在溶液中，无法形成三螺旋结构；加入I链/磁珠复合物后，基于toehold介导的链取代反应，I链序列a*与H1链的toehold区域a互补杂交，引发链迁移过程，使H1链的发夹结构打开，裸露出c-b*序列；溶液中H2链的toehold区域c*与H1链打开后裸露的单链DNA序列c互补杂交，引发链迁移过程，使H2链的发夹结构打开，裸露出a*-b*序列；H2链打开后裸露的单链DNA序列a*-b*与I链的序列相同，从而引发新一轮反应，实现H1链、H2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链DNA结构。磁分离后，对上清液进行荧光光谱扫描，仅可检测到背景荧光信号。
实施例2
一种三螺旋pH生物传感器，该生物传感器体系包括两种发夹DNA(H1和H2)、单链引发DNA(I)、捕获探针(UT)，H1链的序列为5'-TACAGCGAGGAAGGGAGAAGAGGATAGGAGTCCTCTTCTCCCTTCCTC-3'，H2链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTAGAGGAAGGGAGAAGAGGACTCCTA-3'，I链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTA-3'，UT链的序列为5'-GAGGAAGGGAGAAGAGGA-3'，其中，发夹H1链的5'末端和H2链的3'末端分别修饰荧光基团Alexa Fluor488，I链的3'末端修饰氨基，体系中引入羧基化的聚苯乙烯磁珠，3'末端修饰氨基的引发链I链可以通过酰胺反应连接到磁珠表面，得到I链/磁珠复合物。
实施例3
(1)用pH＝7.0的TAE缓冲液(40mM tris-base，1M冰醋酸，2mM EDTA-2Na，15mMMgCl2)分别稀释引发链I链至2μM，稀释发夹H1链、H2链、捕获探针UT链至20μM。
(2)发夹H1链和H2链分别退火：将DNA溶液加热至95℃运行5min，随即以0.1℃/s冷却至25℃，并于25℃下继续稳定2h；
(3)分别取退火后的H1链和H2链(20μM)各2μL与4μL UT链(20μM)混合，并分别加入到42μL pH＝4.0-9.0的TAE缓冲液中，37℃下反应30min。
(4)取10μL羧基化的聚苯乙烯磁珠(～5μm，10mg/mL)(天津倍思乐色谱技术开发中心)，用200μL磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M，pH＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，然后，向其中加入200μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(0.1M)，在37℃的条件下，反应30min，活化羧基。
(5)用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M，pH＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，去除多余的EDC。
(6)将10μL引发链I链(2μM)加入到上述磁珠分散液中，在37℃条件下，反应12h，制得I链/磁珠复合物(I链浓度为1μM)。
(7)取I链/磁珠复合物(I链浓度为1μM)2μL加入到步骤(3)所述溶液中，25℃下反应2h。
(8)反应结束后进行磁分离，得到不同pH值的上清液。
表1本发明中用到的DNA序列
Figure BDA0001746994910000061
实施例4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证DNA在不同pH下的反应途径。如图2所示，当pH＝4.0-6.0(泳道1-3)时，由于发夹H1链和H2链的茎部与UT链形成反Hoogsteen键的三螺旋发夹结构，加入I链后，无法由I链引发H1链和H2链的自组装，因此没有大分子量的产物产生。然而，当pH＝7.0-9.0(泳道4-6)时，由于发夹H1链和H2链无法与UT链形成三螺旋结构，加入I链后，H1链和H2链由I链引发一系列toehold介导的链取代反应，生成大分子量的长的双链DNA产物。因此，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果验证了我们提出的不同pH值下DNA不同组装方式的可行性。
实施例5荧光光谱
通过荧光光谱验证DNA在不同pH下的反应途径。当pH＝4.0-6.0时，由于发夹H1链和H2链的茎部与UT链结合，形成反Hoogsteen键的三螺旋发夹结构M1、M2。加入I链/磁珠复合物后，I链无法发生toehold介导的链取代反应，磁分离后，H1链和H2链共存在上清液中，因此荧光较强。
当pH＝7.0-9.0时，由于发夹H1链和H2链无法与UT链形成三螺旋结构。加入I链/磁珠复合物后，I链引发溶液中的H1链和H2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链DNA结构。因此磁分离后，上清液仅能检测到背景荧光信号。
实施例6
一种检测pH的方法，该方法包括：
(1)制作标准曲线(如图3所示)：
1)分别用pH＝7.0的TAE缓冲液稀释引发链I链至2μM、发夹H1链、H2链和捕获探针UT链至20μM；
2)发夹H1链和H2链分别退火：将含有H1链和H2链的DNA溶液加热至95℃运行5min，随即以0.1℃/s冷却至25℃，并于25℃下继续稳定2h；
3)分别取退火后的H1链和H2链(20μM)各2μL与4μL UT链(20μM)混合，并分别加入到42μL pH＝4.0-9.0的TAE缓冲液中，37℃下反应30min。
4)取10μL羧基化的聚苯乙烯磁珠，用200μL磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M，pH＝7.0)利用磁悬浮作用重复洗涤三次，然后，向其中加入200μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(0.1M)，在37℃的条件下，反应30min，活化羧基。
5)用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M，pH＝7.0)将体系重复洗涤三次，去除多余的EDC。
6)将10μL引发链I链(2μM))加入到上述磁珠分散液中，在37℃条件下，反应12h，制得I链/磁珠复合物(1μM)。
7)取I链/磁珠复合物(1μM)2μL加入到步骤(3)所述溶液中，25℃下反应2h。
8)反应结束后进行磁分离，得到不同pH值的上清液。
9)对不同pH值的上清液进行荧光检测，得到不同pH值样品对应的荧光光谱图；
10)根据不同pH值样品的荧光光谱图在530nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；
其中，各链的序列如表1所述。
(2)取待检测样品，按照步骤(1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品的pH值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> 一种三螺旋pH生物传感器及其应用
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> I链
<400> 1
tcctcttctc ccttcctcgc tgta 24
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> H1链
<400> 2
tacagcgagg aagggagaag aggataggag tcctcttctc ccttcctc 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> H2链
<400> 3
tcctcttctc ccttcctcgc tgtagaggaa gggagaagag gactccta 48
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> UT
<400> 4
gaggaaggga gaagagga 18

Claims (15)

1.一种三螺旋pH生物传感器，其特征是：该生物传感器体系包括两种发夹DNA，分别是H1链和H2链、单链引发DNAI链、捕获探针UT链和羧基化磁珠，各链的结构特点是：H1链从5'端至3'端依次包括序列a、序列b、序列c和序列b*，5'末端修饰荧光基团，H2链从5'端至3'端依次包括序列b*、序列a*、序列b和序列c*，3'末端修饰荧光基团，I链从5'端至3'端依次包括序列b*和序列a*，3'末端修饰氨基，I链3'末端的氨基与羧基化磁珠能够形成I链/磁珠复合物，UT链从5'端至3'端的序列为b；其中，所述序列a和a*为互补序列，序列b和b*为互补序列，序列c和c*为互补序列。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：序列a、序列b、序列c、序列a*、序列b*、序列c*分别为：5'-TACAGC-3'，5'-GAGGAAGGGAGAAGAGGA-3'，5'-TAGGAG-3'，5'-GCTGTA-3'，5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTC-3'，5'-CTCCTA-3'。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：所述I链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTA-3'，H1链的序列为5'-TACAGCGAGGAAGGGAGAAGAGGATAGGAGTCCTCTTCTCCCTTCCTC-3'，H2链的序列为5'-TCCTCTTCTCCCTTCCTCGCTGTAGAGGAAGGGAGAAGAGGACTCCTA-3'，UT链的序列为5'-GAGGAAGGGAGAAGAGGA-3'。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：所述荧光基团为Alexa Fluor488。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：所述磁珠为聚苯乙烯磁珠。
6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：在酸性条件下，发夹H1链、H2链的双螺旋茎部与UT链结合，形成反Hoogsteen键的三螺旋发夹结构M1、M2；加入I链/磁珠复合物后，I链无法发生toehold介导的链取代反应。
7.如权利要求6所述的生物传感器，其特征是：所述酸性条件是指pH＝4.0-6.0。
8.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是：在中性及碱性条件下，发夹H1链、H2链与UT链共存在溶液中，无法形成三螺旋结构；加入I链/磁珠复合物后，基于toehold介导的链取代反应，I链序列a*与H1链的toehold区域a互补杂交，引发链迁移过程，使H1链的发夹结构打开，裸露出c-b*序列；溶液中H2链的toehold区域c*与H1链打开后裸露的单链DNA序列c互补杂交，引发链迁移过程，使H2链的发夹结构打开，裸露出a*-b*序列；H2链打开后裸露的单链DNA序列a*-b*与引发链I序列相同，引发新一轮反应，继而实现H1链、H2链的持续组装，在磁珠表面形成长的双链DNA结构。
9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征是：所述中性及碱性条件是指pH＝7.0-9.0。
10.权利要求1～9中任一项所述的三螺旋pH生物传感器在检测pH中的应用。
11.一种检测pH的方法，其特征是：该方法包括使用权利要求1～9中任一项所述的三螺旋pH生物传感器进行检测的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征是：待检测样品为缓冲溶液或者其他不同pH值的溶液。
13.如权利要求11所述的方法，其特征是，该方法具体包括：
(1)制作标准曲线：
分别用TAE缓冲液稀释引发链I链、发夹H1链、H2链和捕获探针UT链；
发夹H1链和H2链分别退火；
制备I链/磁珠复合物；
取退火后的发夹H1链和H2链与UT链混合并加入到不同pH值的TAE缓冲液中进行反应；
取I链/磁珠复合物加入到所述不同pH值的TAE缓冲液中进行反应；
将上述反应结束后的混合液进行磁分离，得到不同pH值的上清液；
对不同pH值的上清液进行荧光检测，得到不同pH值样品对应的荧光光谱图；
根据不同pH值样品荧光光谱图在530nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；
(2)取待检测样品，按照步骤(1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品的pH值。
14.如权利要求13所述的方法，其特征是：所述I链/磁珠复合物的制备方法，包括以下步骤：
采用磷酸缓冲溶液洗涤羧基化磁珠，然后采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液活化羧基；
将反应后的体系用磷酸缓冲溶液进行洗涤，去除多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
将引发链I链加入到上述磁珠分散液中进行反应，制备得到I链/磁珠复合物。
15.如权利要求13所述的方法，其特征是：退火发夹H1链和H2链，包括以下步骤：
将H1链和H2链溶液加热至90～95℃运行5～10min，随即以0.1～0.3℃/s冷却至25～30℃，并于25～30℃下继续稳定2～3h。
CN201810847896.5A 2018-07-27 2018-07-27 一种三螺旋pH生物传感器及其应用 Active CN109115737B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810847896.5A CN109115737B (zh) 2018-07-27 2018-07-27 一种三螺旋pH生物传感器及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810847896.5A CN109115737B (zh) 2018-07-27 2018-07-27 一种三螺旋pH生物传感器及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109115737A CN109115737A (zh) 2019-01-01
CN109115737B true CN109115737B (zh) 2021-03-26

Family

ID=64863485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810847896.5A Active CN109115737B (zh) 2018-07-27 2018-07-27 一种三螺旋pH生物传感器及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109115737B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1312372A (zh) * 1999-07-30 2001-09-12 辉瑞产品公司 氯化筒箭毒碱调节区、核苷酸序列测定及其使用的方法
EP1135525A2 (en) * 1998-11-19 2001-09-26 Cygene, Inc. Methods and compositions for detection of nucleic acid sequences and signal amplification
CN104049087A (zh) * 2014-06-05 2014-09-17 青岛科技大学 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用
CN106153588A (zh) * 2016-06-21 2016-11-23 吉林大学 基于三螺旋dna分子开关检测啶虫脒的方法
CN107012226A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2952726A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-30 Immunomic Therapeutics, Inc. Nucleic acids for treatment of peanut allergies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1135525A2 (en) * 1998-11-19 2001-09-26 Cygene, Inc. Methods and compositions for detection of nucleic acid sequences and signal amplification
CN1312372A (zh) * 1999-07-30 2001-09-12 辉瑞产品公司 氯化筒箭毒碱调节区、核苷酸序列测定及其使用的方法
CN104049087A (zh) * 2014-06-05 2014-09-17 青岛科技大学 一种检测l-组氨酸的生物传感器的制备方法及其应用
CN106153588A (zh) * 2016-06-21 2016-11-23 吉林大学 基于三螺旋dna分子开关检测啶虫脒的方法
CN107012226A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA logic assembly powered by a triplex-helix molecular switch for extracellular pHimaging;Hongjie Qi;《Chem.Commun》;20180706;第8498-8501页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109115737A (zh) 2019-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Luo et al. A ratiometric electrochemical DNA biosensor for detection of exosomal MicroRNA
Huang et al. An electrochemical biosensor for the highly sensitive detection of Staphylococcus aureus based on SRCA-CRISPR/Cas12a
Wang et al. Numerous long single-stranded DNAs produced by dual amplification reactions for electrochemical detection of exosomal microRNAs
Gao et al. Molecular beacon mediated circular strand displacement strategy for constructing a ratiometric electrochemical deoxyribonucleic acid sensor
CN114518359B (zh) 一种基于g-四联体的双模式卡那霉素适配体传感器的制备方法
CN114295694B (zh) 一种用于乳腺癌her-2检测的电化学发光适体传感器及其检测方法
Hua et al. LAMP-generated H+ ions-induced dimer i-motif as signal transducer for ultrasensitive electrochemical detection of DNA
CN113686934B (zh) 一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用
CN108398406B (zh) 一种检测尿嘧啶糖基化酶（udg）的生物传感器及其应用
Zhang et al. Framework nucleic acid-wrapped protein-inorganic hybrid nanoflowers with three-stage amplified fluorescence polarization for terminal deoxynucleotidyl transferase activity biosensing
Zhou et al. Ultrasensitive enzyme-free fluorescent detection of VEGF 165 based on target-triggered hybridization chain reaction amplification
CN110257519A (zh) 一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒
CN105567808B (zh) 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用
CN109115737B (zh) 一种三螺旋pH生物传感器及其应用
CN105445350A (zh) 一种基于肽核酸的电化学dna生物传感器及其制备方法
Xu et al. CRISPR/Cas12a-drived electrochemiluminescence and fluorescence dual-mode magnetic biosensor for sensitive detection of Pseudomonas aeruginosa based on iridium (III) complex as luminophore
Lin et al. Electrochemiluminescence aptasensor for vascular endothelial growth factor 165 detection based on Ru (bpy) 32+/Au nanoparticles film modified electrode and double signal amplification
CN112322703B (zh) 基于dna自组装结构对两种循环肿瘤dna同时检测的方法
Cui et al. A homogeneous strategy of target-triggered catalytic hairpin assembly for thrombin signal amplification
CN109975561B (zh) 一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法
CN102937613B (zh) 一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测pcr的电化学安培检测法
CN112143781A (zh) 基于移动反应界面的核酸扩增-芯片电泳滴定传感的核酸检测方法
CN110819717A (zh) 包含氧化石墨烯的扩增体系及其在结直肠癌标志物检测中的应用
Jin et al. A sensitive thrombin aptasensor based on target circulation strategy
CN110982879A (zh) 一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 266071 Shandong city of Qingdao province Ningxia City Road No. 308

Applicant after: Qingdao University

Address before: 266061 No. 7 East Hongkong Road, Shandong, Qingdao

Applicant before: Qingdao University

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 266100 Hongkong East Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province, No. 7

Patentee after: QINGDAO University

Address before: 266071 Shandong city of Qingdao province Ningxia City Road No. 308

Patentee before: QINGDAO University