CN103364566A

CN103364566A - 一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法

Info

Publication number: CN103364566A
Application number: CN201310291830XA
Authority: CN
Inventors: 林振宇; 周津; 郭隆华; 邱彬; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，在未加入组氨酸，只有抗坏血酸钠还原二价铜为一价铜作为催化剂的条件下，修饰有叠氮基与修饰有炔基的DNA发生1,3-偶极环加成反应，从而将修饰有蔗糖转化酶的DNA固定在磁珠上；但是在同时加入组氨酸的情况下，组氨酸能抑制点击化学反应的发生。因此通过分离磁珠与溶液，并将清洗后的磁珠溶于蔗糖溶液中进行酶解反应，再使用血糖仪测量酶解后的反应溶液，即可由血糖仪读数的差值来间接检测组氨酸的浓度。该传感器成功地应用于牛奶样品中组氨酸浓度的检测，本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。

Description

一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法。

背景技术

组氨酸是人体的一种半必需氨基酸，它作为神经递质或者神经调节物质在哺乳动物的中枢神经系统中起到了重要的作用。组氨酸在组织的生长和修复方面具有不可忽视的作用，例如保护机体使其免受由辐射带来的伤害和预防人体对艾滋病的全面感染等。此外，组氨酸还是生物体内控制金属离子转运的重要基质，并可以减轻由轻伤带来的内出血症状（Chen et al., 1999. Talanta 29, 319–330.；Horrobin et al., 1979. Med. Hypothesis 5, 969.）。但是过量的组氨酸又容易导致机体中毒，还可能引发压力和心理紊乱，例如焦虑、精神分裂甚至是血栓性疾病（Liao et al., 2004. J. Biochem. Biophys. Methods 59,75–87.；Jones et al., 2005. Immunology and Cell Biology 83,106–118.）。

点击化学（Kolb et al., 2001. Angew. Chem. 40, 2004-2021.）是在2001年由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首先提出的。点击化学具有模块化、可靠、高效率、高选择性、反应条件温和、产物收率高、副反应少、分离提纯简单等特点，被广泛应用于环境、化学及生物医学等众多领域。

目前检测组氨酸的方法有毛细管电泳法（Zhang et al., 2004. J. Chromatogr. A 1040, 133–140.； Jalali-Heravi et al., 2005. Electrophoresis 26, 1874–1885.；Zhou et al., 2010. Talanta 82, 72–77.），荧光光谱法（Hortala et al., 2003. Journal of the American Chemical Society 125, 20–21.；Kong et al., 2011. Analytical Chemistry 83, 7603–7607.），比色法（Bae et al., 2010. Langmuir 26, 2181–2185.），电化学检测（Li et al., 2011. Biosensors and Bioelectronics 26, 2781–2785.；Prasad et al., 2011. Biosensors and Bioelectronics 28, 117–126.）和高效液相色谱法（Tateda et al., 1998. Journal of Chromatography B 718, 235–241.）等。但是这些方法的一个普遍缺点是需要用到大型的仪器设备，这类仪器设备不但价格昂贵，操作复杂，而且不方便携带，无法实现现场检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于点击化学的以血糖仪为平台的能够便携的、快速、现场检测组氨酸的方法。该方法对组氨酸的检测灵敏度高、特异性好。在0.01 uM到100 uM的浓度范围内对组氨酸的检测呈现良好的线性响应，检测限为3.4 nM。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法包括以下步骤：

（1）按照参考文献（Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Elsevier: London, 2008）制备浓度为2.0 uM的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物；

（2）将商品化的修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1 M NaCl、0.1 M pH=7.3的磷酸盐缓冲溶液和0.05% 吐温-20组成的混合溶液中，加入2.0 uM修饰有生物素的DNA，室温振荡30±1分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；

（3）将修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入10 nM CuSO₄、1 mM抗坏血酸钠和含有组氨酸的待测样品，室温培育1.5±0.5小时；

（4）用磁铁分离步骤（3）中的磁珠与混合溶液，用50 uL磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 uL磷酸盐缓冲溶液，再加入20 uL 1 M蔗糖溶液，于45℃反应15分钟；

（5）用罗氏血糖仪测定步骤（4）反应后的溶液，记录数据；

（6）根据组氨酸浓度和血糖仪响应差值，计算得到其线性方程为Y=4.089+1.904lgX，其中Y为血糖仪响应差值，单位为mM；X为其所对应的组氨酸浓度，单位为uM。

步骤（1）中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-转化酶。

步骤（2）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-叠氮基。

步骤（3）中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。

步骤（3）中所述的含有组氨酸的待测样品的加入量为3 uL，CuSO₄和抗坏血酸钠的最终含量分别为1 nM 和0.1 mM。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明的两种修饰DNA合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制，得到的DNA化合物具有良好的活性和稳定性。

（2）本发明的操作步骤简单、便捷、灵敏、成本低而且无毒害，实用性强。

（3）本发明的传感器在识别组氨酸的过程中，能快速读取数值，有利于对组氨酸的检测。

（4）上述所提到的检测仪器为血糖仪，仪器小巧方便携带，操作简单快速，特别适用于现场检测。

附图说明

图1为本发明所述的基于点击化学快速检测组氨酸的便携式传感器对组氨酸检测的特异性。（A）从左到右为该传感器在不同干扰物质中所示的血糖仪信号差值，从左到右分别为空白溶液、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和组氨酸；组氨酸的浓度为100 uM，其他干扰物质的浓度均为1 mM；（B）该传感器在不同干扰物质中所示的血糖试纸比色窗颜色，从a到h分别为空白溶液、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和组氨酸；组氨酸的浓度为100 uM，其他干扰物质的浓度均为1 mM。

具体实施方式

实施例1

以下实施例结合附图来说明应用本发明所述方法制备便携式组氨酸传感器并将其应用于牛奶样品中组氨酸浓度的检测的操作过程：

1、修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物的合成，参考文献（Hermanson, G.T., 2008. Bioconjugate Techniques）。具体步骤如下：

A、将30 μM修饰有巯基的DNA与60 μM TCEP于PBS缓冲溶液中混合均匀，室温培育1小时；

B、将11.30 mg/mL蔗糖转化酶与1 mg Sulfo-SMCC于缓冲溶液（0.1 M PBS，PH=7.3，0.1 M NaCl）中混合5 min，室温下置于摇床上振动1小时，再将混合物离心分离，取上清液；

C、将A与B制备的物质混合，室温下反应48小时。

2、修饰有蔗糖转化酶的磁珠的制备与组氨酸的检测，具体步骤如下：

（1）将修饰有链霉亲和素的磁珠溶于由0.1 M NaCl、0.1 M PH=7.3的PBS、0.05% Tween-20组成的缓冲溶液中，加入2.0 uM修饰有生物素的DNA，室温振荡（30±1）分钟。

（2）将制备的2.0 uM修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与2.0 uM修饰在磁珠上的DNA化合物以摩尔比1：1混合均匀，加入10 nM CuSO₄、1 mM抗坏血酸钠和含有组氨酸的待测样品（组氨酸浓度从低到高分别为0.01 uM、0.0316 uM、0.1 uM、1 uM、3.16 uM、10 uM和100 uM），室温培育(1.5±0.05)小时，发生点击化学反应。

（3）用磁铁分离步骤（2）中的磁珠与混合溶液，用由0.1 M NaCl、0.1 M PH=7.3的PBS、0.05% Tween-20组成的缓冲溶液洗涤磁珠三次并向磁珠中加入该缓冲溶液，再加入1 M蔗糖溶液，于45℃反应15分钟。

（4）用罗氏血糖仪测定步骤（3）反应后的溶液，记录血糖仪读数差值。随着组氨酸浓度的增加，其所对应的血糖仪信号的差值也相应增强，其对应的血糖试纸比色窗颜色依次由黄色转变为黄绿色再转变为绿色。

实施例2

1、牛奶样品中组氨酸浓度的检测，具体步骤如下：

向2.0 uM两种修饰的DNA混合物中加入10 nM CuSO₄、1 mM抗坏血酸钠和牛奶样品，室温培育(1.5±0.05)小时，然后用磁铁分离混合物，用50 uL缓冲溶液洗涤磁珠三次并加入10 uL缓冲溶液，再加入20 uL 1 M蔗糖溶液，于45℃反应15分钟，移取2.5 μL用血糖仪测量，记录数据。检测结果显示三组牛奶样品中组氨酸浓度分别为0.10 uM、0.11 uM、0.09 uM。

2、本发明所述方法制备便携式组氨酸传感器对组氨酸检测的特异性，具体步骤如下：

为了检测本发明所述的便携式组氨酸传感器的特异性，将实施例1-2中所使用的组氨酸换成其他干扰物质，分别为空白溶液、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸，组氨酸的浓度为100 uM，其他干扰物质的浓度均为1 mM。如图1（A）所示，从左到右为该传感器在不同干扰物质中所示的血糖仪响应差值，从左到右分别为空白溶液（0.1 mM）、苏氨酸（0.7 mM）、赖氨酸（0.4 mM）、酪氨酸（0.5 mM）、色氨酸（0.7 mM）、缬氨酸（0.5 mM）、甲硫氨酸（0.3 mM）和组氨酸（7.8 mM），其相对应的血糖试纸比色窗颜色变化如图1（B）所示，从a到h分别为空白溶液、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，除了h是明显的绿色，其余均为黄色。结果说明本发明所述方法制备便携式组氨酸传感器对组氨酸检测有较好的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备浓度为2.0 uM的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物；

2.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：炔基-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-转化酶。

3.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-叠氮基。

4.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的修饰有炔基和蔗糖转化酶的DNA化合物与修饰在磁珠上的DNA化合物的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求1所述的基于点击化学的便携式检测组氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的含有组氨酸的待测样品的加入量为3 uL，CuSO₄和抗坏血酸钠的最终含量分别为1 nM 和0.1 mM。