CN113092309B - 一种毛细管高度指示剂装置及其检测硫化氢的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种毛细管高度指示剂装置及其检测硫化氢的应用，向N3‑MBs溶液中加入硫化氢溶液，在室温下反应反应50 min;然后向混合溶液中加入Alk‑PtNPs溶液、抗坏血酸、硫酸铜、PBS缓冲溶液，在室温下反应反应30 min；将磁珠连接的PtNPs立即转移到装有过氧化氢的玻璃小瓶，立即旋上装有毛细管指示剂的硅胶盖，对毛细管上升的高度进行测量。本发明装置易于携带，可操作性强，检测方便，有望在食品安全分析上得到广泛的应用。

Description

一种毛细管高度指示剂装置及其检测硫化氢的应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种毛细管高度指示剂装置及其检测硫化氢的应用。
背景技术
H2S 是一种致命的、具有臭鸡蛋气味的毒性气体，会对人体健康造成危害，在食品、环境和医学领域中得到广泛的研究和关注。它广泛存在于各类食品中，是各种食品中的芳香活性化合物。同时， H2S 作为一种内源性气体信号分子，具有一定的生理学作用，与心脏病、肝硬化、糖尿病、 高血压、老年痴呆和唐氏综合症等疾病有关。目前已经有许多分析方法被开发用于 H2S 的检测，例如电化学法、光学法和表面增强拉曼散射法和荧光方法中。其中，硫化氢能够还原叠氮基，形成氨基的性质被广泛应用于荧光检测方法中。但是，建立一些新型的便携性的分析方法以实现对硫化氢的检测仍具有重要意义。
Cu+催化的叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）是点击反应的典型示例，它由Cu [I]催化在两种反应物之间产生1,2,3-三唑键。目前，在分析化学中，他已广泛用于连接DNA链，和纳米偶联，他能够增加DNA链之间连接的稳定性，并且具有出色的特异性。而点击化学反应也是建立便携式检测的重要手段之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛细管高度指示剂装置用于硫化氢检测，其可用于食品、环境中铜离子的便携式初步检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种毛细管高度指示剂装置，其制备方法包括以下步骤：
（1）铂纳米颗粒PtNPs的制备：首先将1 mM H2PtCl6溶液加热到80℃保持20 min，然后添加0.4 M抗坏血酸溶液并搅拌均匀，并在80℃继续保持30 min，取1mL离心过滤获得铂纳米颗粒。H2PtCl6溶液与抗坏血酸溶液比例体积比为25:1。
链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒SA–PtNPs的制备：将铂纳米颗粒在含30μg/mL 链霉亲和素的H3BO3（0.1 M，PH 7.5）溶液中重新悬浮，然后在37 ℃下孵育1小时。此外，添加10wt％BSA溶液，在37℃下继续孵育1h。离心后，将反应物产物重悬于含有0.1wt％BSA的0.1M，pH 7.5H3BO 3溶液中，获得链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒溶液；
（2）Alk-PtNPs 溶液的制备：将10 μM两端各修饰有生物素和炔基的DNA (Bio-DNA-Alk) 溶液添加至步骤（2）制备的SA–PtNPs溶液中，并在37℃反应2 h。
（3）N3-MBs 溶液的制备：将链霉亲和素磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入10 μM两端修饰有生物素和叠氮基团的DNA 溶液(Bio-DNA- N3)，并在37℃反应2 h。
（5）向N3-MBs溶液中加入50ul检测样品，在室温下反应，然后向混合溶液中加入Alk-PtNPs溶液、抗坏血酸、 硫酸铜、PBS缓冲溶液，形成检测体系；
（6）将步骤（5）获得的检测体系立即转移到装有过氧化氢的玻璃小瓶，立即旋上装有毛细管指示剂的硅胶盖，对毛细管上升的高度进行测量。
步骤（5）所述检测体系中， N3-MBs溶液的终浓度为0.5 mg/mL，Alk-PtNPs溶液浓度0.06 μM，抗坏血酸钠溶液浓度为10 mM，硫酸铜溶液浓度为200 μM，PBS缓冲液浓度为0.01 M。
步骤（5）中N3-MBs溶液：硫化氢溶液：Alk-PtNPs溶液：抗坏血酸溶液：硫酸铜溶液：PBS缓冲溶液的体积比为10:50:10:3:1:3。
本发明其检测原理是利用修饰了叠氮基团的磁珠、修饰了炔基基团的铂纳米颗粒，当有Cu2+ 和抗坏血酸钠存在时，Cu2+ 将会被抗坏血酸钠还原成Cu+，从而催化炔基和叠氮基团之间发生CuAAC反应，使磁珠连接上铂纳米颗粒。当有硫化氢存在时，它会特异性还原磁珠表面的叠氮基团，生成氨基，从而抑制点击化学反应的连接。反之，当没有硫化氢存在时，点击化学反应会使磁珠连接有大量的铂纳米颗粒。将磁珠连接的铂纳米立即转移到转移到装有过氧化氢的玻璃瓶中 ，并将小瓶用装有硅隔垫和毛细管的旋盖密封。在封闭的反应装置中，由于铂纳米颗粒的催化作用，过氧化氢分解并产生大量的氧气，从而导致管中的墨水量上升。因此，用肉眼就能实现对硫化氢的裸眼检测。磁珠连接的铂纳米颗粒的量与硫化氢浓度有关，毛细管中墨滴的高度与铂纳米颗粒的量有一定关系。因此，可以在墨滴高度和硫化氢之间建立紧密的关系。
本发明的显著优点在于：
本发明制备的毛细管高度指示剂装置易于携带，可操作性强，采用其进行硫化氢的检测，无需先进的仪器，因此在食品安全分析等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备方法的原理示意图。
图2为本发明中在不同时间下，不同浓度的Alk-PtNPs下毛细管高度随时间的变化。
图3为实施例2中反映硫化氢含量与毛细管墨滴高度之间关系的标准曲线图。
具体实施方式
一种毛细管高度指示剂装置用于硫化氢检测，其制备方法包括以下步骤：
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实验例1
（1） 铂纳米颗粒的制备：首先将5 mL H2PtCl6溶液（1 mM）加热到80 ℃保持20min，然后添加200 μL抗坏血酸（0.4 M）并搅拌均匀，并在80℃继续保持30分钟。取1 mL的铂纳米颗粒溶液，在4 ℃下以12000 rpm的速度离心5分钟，然后弃去上清液。
（2） 链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒SA–PtNPs的制备：将上述步骤（1）中离心获得的铂纳米颗粒在1 mL含30 μg/mL 链霉亲和素的H3BO3（0.1 M，pH 7.5）溶液重新悬浮，然后在37 ℃下孵育1小时。此外，继续添加100 μL BSA溶液（10 wt％），在37℃下继续孵育1 h。
将上述链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒溶液（SA–PtNPs）在4 ℃下以8000 rpm的速度离心5分钟。弃上清液，并将反应物产物重悬于含有BSA（0.1wt％）的1mL H3BO3（0.1M，pH7.5）溶液中（Pt 存储缓冲液）。
（3） Alk-PtNPs 溶液的制备：将400 μL两端各修饰有生物素和炔基的DNA (Bio-DNA-Alk，序列：5'-CHCH-TGT CCG TAG CTA AAA AAA AAA AAA-Bio-3'，10 μM) 溶液添加至步骤（2）制备的SA–PtNPs溶液中，并在37℃反应2 h。将反应物在4°C下以8000 rpm的速度离心5分钟，弃去上清液，重悬于 Pt 存储缓冲液（1 mL）中，并在 4°C 下存储直至使用。
（4） 将10 μL 不同浓度的 Alk-PtNPs转移到装有1 mL过氧化氢溶液(30 wt％)的玻璃小瓶，立即旋上装有毛细管指示剂的硅胶盖，测量不同时间下，不同浓度的Alk-PtNPs对毛细管墨滴地上升高度。
图2结果显示了修饰有Alk-PtNPs对H2O2分解的催化能力。可以发现，墨水的高度几乎随反应时间线性增加。此外，在不同的反应时间下，墨水的高度与PtNPs-ALK的浓度之间存在线性关系。这些结果表明，合成的Alk-PtNPs具有对H2O2分解的优异的催化性能。
实验例2
一种刺激润湿响应性铜离子检测毛细管，其制备方法包括以下步骤：
（1） 铂纳米颗粒的制备：首先将5 mL H2PtCl6溶液（1 mM）加热到80 °C 保持20min，然后添加200 μL抗坏血酸（0.4 M）并搅拌均匀，并在80 °C继续保持30分钟。取1mL的铂纳米颗粒溶液，在4 ℃下以12000 rpm的速度离心5分钟，然后弃去上清液。
（2） 链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒的制备：将上述步骤（1）中离心获得的铂纳米颗粒在1 mL含30μg/mL 链霉亲和素的H3BO3（0.1 M，pH 7.5）溶液重新悬浮，然后在37 ℃下孵育1小时。再继续添加100 μL BSA（10 wt％），在37℃ 下继续孵育1 h。将上述链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒溶液（SA–PtNPs）在4°C下以8000 rpm的速度离心5分钟。弃上清液，并将反应物产物重悬于含有BSA（0.1wt％）的1mL H3BO 3（0.1M，pH 7.5）溶液中。
（3） Alk-PtNPs 溶液的制备：将400 μL两端各修饰有生物素和炔基的DNA (Bio-DNA-Alk: 5'-CHCH-TGT CCG TAG CTA AAA AAA AAA AAA-Bio-3'，10 μM) 溶液添加至步骤（2）制备的SA–PtNPs溶液中，并在37℃反应2 h。将反应物在4°C下以8000 rpm的速度离心5分钟，弃去上清液，重悬于 Pt 存储缓冲液（1 mL）中，并在 4℃下存储直至使用。
（4） N3-MBs 溶液的制备：使用1×PBS缓冲液（含0.1 wt％BSA，0.1％Tween-20）将0.6 mL链霉亲和素磁珠（1 mg /mL ）洗涤3次，洗涤后磁珠与600 μL生物素及和叠氮基团修饰的N3-DNA溶液混合（Bio-DNA- N3, 序列：5'-Bio-AAA AAA AAA AAA TCA CAG ATG AGTAGT-azido-3'，
10 μM），在37°C下孵育1 h。然后，将获得的磁珠（N3-MBs）洗涤3次，悬浮于1 mL的1x PBS缓冲液（0.1 wt％ BSA，0.01％ Tween-20）中，并保存在4°C下。
（5） 检测操作方法为：向10 μL、0.05mg/mL的 N3-MBs溶液中加入 50 μL不同浓度（2，3，5，10，20，40，60 μM）的硫化氢溶液，在室温下反应50 min；然后向混合溶液中加入10μL 0.06 μM的Alk-PtNPs溶液、3 μL 10 mM的抗坏血酸钠溶液、1 μL10mM的硫酸铜溶液、3 μL0.01mM PBS缓冲溶液，在室温下反应反应30 min；并用PBS缓冲溶液清洗三次，将磁珠连接的PtNPs立即转移到装有1 mL过氧化氢 (30 wt％) 的玻璃小瓶，立即旋上装有毛细管指示剂的硅胶盖，对毛细管上升的高度进行测量。
利用磁珠连接的中铂纳米颗粒催化H2O2(催化时间为50min)产生O2，以使排水装置内压力增大，通过对毛细管墨滴高度的测定，即可计算获得硫化氢的含量。结果如图3所示，其所得线性方程为Y=59.83-0.8973x (R2 =0 .9985)，最低检测限为1.9 μM。由图3可见，不同硫化氢浓度对应的毛细管墨滴高度差距明显，证明利用本发明可通过毛细管墨滴高度判断硫化氢浓度的高低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的等效变化，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种毛细管高度指示剂装置及其检测硫化氢的应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtccgtagc taaaaaaaaa aaaa 24
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaaaaaaaa aatcacagat gagtagt 27

Claims (8)

1.一种毛细管高度指示剂装置的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备铂纳米颗粒PtNPs，并在含有60 μg/mL链霉亲和素的0.1 M，pH 7.5 H3BO3溶液中重新悬浮，在37℃下孵育1 h，添加10 wt% BSA溶液，在37℃下继续孵育1h，离心后，将反应物产物重悬于含有0.1wt% BSA的0.1M，pH 7.5 H3BO3溶液中，获得链霉亲和素修饰的铂纳米颗粒溶液；
（2）将两端各修饰有生物素和炔基的DNA溶液添加至步骤（1）制备的铂纳米颗粒溶液中孵育，体积比为2:5，获得炔基-DNA修饰的铂纳米粒子Alk-PtNPs；
（3）将链霉亲和素磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入两端修饰有生物素和叠氮基团的DNA溶液，进行反应，制备获得1mg/mL的叠氮基修饰的磁珠N3-MBs溶液；
（4）向步骤（3）制备的叠氮基修饰的磁珠N3-MBs溶液中加入检测样品，在室温下反应，然后向混合溶液中加入Alk-PtNPs溶液、抗坏血酸溶液、硫酸铜溶液、PBS缓冲溶液，形成检测体系；
（5）将步骤（4）获得的检测体系立即转移到装有过氧化氢溶液的玻璃小瓶，立即旋上装有毛细管指示剂的硅胶盖，对毛细管上升的高度进行测量。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述铂纳米颗粒的制备方法为：将1 mM H2PtCl6溶液加热到80℃保持20 min，然后添加0.4 M抗坏血酸溶液并搅拌均匀，并在80℃继续保持30 min，取1mL溶液离心过滤获得铂纳米颗粒；H2PtCl6溶液与抗坏血酸溶液比例体积比为25:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述修饰有生物素和炔基的DNA为：5’-CHCH-TGTCCGTAGCTAAAAAAAAAAAAA-Bio-3’，DNA溶液的浓度为10 μmol/L，所述孵育的温度为37 ℃，时间为2小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述两端修饰有生物素和叠氮基团的DNA为5’-Bio-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT-azido-3’，溶液的浓度为10 μM，所述反应的温度为37 ℃，时间为2 小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述检测体系中，N3-MBs溶液的浓度为0.5 mg/mL，Alk-PtNPs溶液浓度0.06 μmol/L，抗坏血酸钠溶液浓度为10 mmol/L，硫酸铜溶液浓度为200 μmol/L，PBS缓冲液浓度为0.01 mol/L；所述N3-MBs溶液：硫化氢溶液：Alk-PtNPs溶液：抗坏血酸溶液：硫酸铜溶液：PBS缓冲溶液的体积比为10:50:10:3:1:3。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中过氧化氢溶液为30 wt%。
7.权利要求1-6任一所述的方法制备获得的一种毛细管高度指示剂装置。
8.权利要求7所述的毛细管高度指示剂装置在检测硫化氢中的应用。
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