CN103808716A - 一种便携快速检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法。首先制备蔗糖转化酶-端炔修饰DNA。随后将生物素-叠氮修饰DNA结合在磁珠表面，并加入不同浓度的赭曲霉毒素A混合。然后加入先前制备好的蔗糖转化酶-端炔修饰DNA、CuSO4溶液、抗坏血酸溶液。其中抗坏血酸溶液能还原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化生物素-叠氮修饰DNA与蔗糖转化酶-端炔修饰DNA发生点击化学反应。反应结束后取上层清液加入至蔗糖溶液中，蔗糖转化酶能有效催化溶液中蔗糖转化为葡萄糖。最后采用血糖仪进行测定。该方法有机地将点击化学快速反应的优势与适配体高特异性的特点结合起来，采用简单便携的血糖仪进行数据采集，大大降低了操作的复杂性和检测成本，提高了灵敏度和选择性。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其是涉及一种基于点击化学反应构建的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
赭曲霉毒素A是最普遍的食物污染毒素之一，主要是由一些曲霉菌属和青霉菌属真菌产生，而这些真菌易在谷类作物、水果、啤酒和白酒中生长繁殖。在动物体内，赭曲霉毒素A易于被肠道吸收，容易引起肾脏和肝脏的强毒性，而且还具有致癌、致畸、抑制免疫力等作用。国际癌症研究机构已经将赭曲霉毒素A列为一种潜在的人类致癌物。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(FAO/WHO JECFA)指出食物间接传递给人类的赭曲霉毒素A中，50%是来自于谷类物质。因此很多国家制定了赭曲霉毒素A在谷类物质中的最高限量标准，例如在未加工的谷物中，不能超过5.0 μg/kg，在加工过的谷类物质中，不得超过3.0 μg/kg。随之也涌现出了许多方法对赭曲霉毒素A进行检测，如可被接受的液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术、薄层色谱法，但这些方法所需仪器昂贵，耗时，而且需要专门的培训人员进行操作，检测成本高，因此在一定程度上阻碍了它们的应用。目前一些高灵敏的免疫检测技术也相继报道，如酶联免疫检测法、电化学免疫传感器、荧光免疫检测技术等，然而这些方法都需要依赖于抗体、半抗原以及免疫抗原的制备，该制备过程不但复杂、耗时，而且也需要借助于大型仪器进行检测，不便携带。因此一些灵敏度高、操作简单和成本低的方法需要被开发，例如采用适配体DNA结合技术来降低操作的复杂性。
点击化学是美国化学家Sharpless首先提出的一种合成概念。它主要是基于小分子单元依赖自身的性质快速生成新物质而建立的一类反应。其中Cu(I)催化叠氮与端炔基团的环加成反应是点击化学反应中研究最为广泛，也最为成熟的反应类型之一。该类反应速度快、立体选择性好、产率高、副产物少、对环境污染小，并且原料易得，所需要的反应条件简单、温和，而且氧气和水溶剂所带来的影响较小。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种制备简单、成本低、便于携带、适合现场检测的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法。该方法有机地将点击化学快速反应的优势与适配体的高特异性特点结合起来，采用简单便携的血糖仪进行数据采集，大大降低了操作的复杂性和检测成本，提高了灵敏度和选择性。
本发明的目的是这样实现的：
一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，特征是：具体步骤如下：
1．按照参考文献（Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, Nature Chemistry, 2011, 3, 697-703.），采用巯基-端炔修饰DNA、磺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐、蔗糖转化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制备蔗糖转化酶-端炔修饰DNA；
2．将5.0 μL 0.05 μM的生物素-叠氮修饰DNA、10 μL 链霉素修饰的磁珠一起加入至25 μL PBS缓冲溶液（由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制的磷酸盐缓冲溶液）中，PBS缓冲溶液的浓度为0.01 M，pH为7.3，在室温下震荡30分钟，促使生物素-叠氮修饰DNA结合在磁珠表面；
3．在步骤2反应结束后的PBS缓冲溶液中加入5.0 μL NaCl和不同浓度的赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素A的浓度范围为0.2 ng/mL～50 ng/mL，在室温下震荡15分钟；反应结束后，采用磁铁进行第一次分离，弃去第一次上层清液，得到下层磁珠，并用PBS缓冲溶液清洗磁珠两次，清洗结束后在磁珠中加入50 μL PBS缓冲溶液混匀，得到含有结合在磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4．取20 μL步骤3中反应所得的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μL步骤1中所得的蔗糖转化酶-端炔修饰DNA溶液、5.0 μL 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μL 1.0 mM抗坏血酸溶液，在室温下培育10分钟，让抗坏血酸还原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖转化酶-端炔修饰DNA与磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A发生点击化学反应，得到蔗糖转化酶修饰磁珠溶液；
5．步骤4反应结束后，对步骤4中所得到的蔗糖转化酶修饰磁珠溶液采用磁铁进行第二次分离，得到第二次上层清液；取10 μL第二次上层清液，加入至2.5 μL 2.0 M蔗糖溶液，在室温下反应20分钟，取3.0 μL溶液至血糖仪试纸上，采用血糖仪进行测量，绘制所测数据在不同赭曲霉毒素A浓度条件下的变化趋势图，根据该图就能检测赭曲霉毒素A的浓度。
其中：
步骤1中所述的巯基-端炔修饰DNA的序列从5’到3’端为：5’-炔基- AAA AAA AAA AAA-巯基- 3’。
步骤2中所述的生物素-叠氮修饰DNA的序列从5’到3’端为：5’-生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-叠氮- 3’。
当溶液存在赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A能与生物素-叠氮修饰DNA进行结合，引起DNA链构象发生变化，促使叠氮基团紧靠磁珠表面，并产生空间位阻效应，导致生物素-叠氮修饰DNA不能与蔗糖转化酶-端炔修饰DNA发生点击化学反应，致使蔗糖转化酶不能有效地结合在磁珠表面，而是处于上层清液中。因此，取第二次上层清液进行检测时，蔗糖转化酶能有效催化步骤5溶液中的蔗糖转化为葡萄糖。采用血糖仪测定该反应溶液时，数值较高。并且随着赭曲霉毒素A浓度增加，血糖仪数值逐渐增大，达到检测赭曲霉毒素A的目的。
本发明在0.2 ng/mL～5.0 ng/mL的浓度范围内对赭曲霉毒素A的检测呈现良好的线性响应，检测限约为73 pg/mL，远低于赭曲霉毒素A在谷类物质中的最高限量标准。此外，血糖仪试纸上的圆斑颜色随着赭曲霉毒素A浓度的增加逐渐由黄色变为绿色，而且能直接用肉眼观测到该过程。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明结合点击化学反应速度快的优势以及适配体特异性高的特点，大大降低了操作的复杂性，提高了灵敏度和选择性。
（2）本发明的操作过程都是在室温下进行，反应条件温和，容易控制。
（3）本发明采用简单、小巧的血糖仪进行数据采集，降低了检测成本，而且便于携带，适合现场适时检测。
（4）本发明在用于赭曲霉毒素A的检测过程中，能直接用肉眼观测到试纸上的圆斑颜色随着赭曲霉毒素A浓度的增加逐渐由黄色变为绿色的过程，显示出高效、简单的优势。
附图说明：
图1为本发明的便携快速检测赭曲霉毒素A方法的原理示意图；
图2为本发明所述方法在含有和不含赭曲霉毒素A的数值变化示意图，其中a为含有赭曲霉毒素A， b为不含赭曲霉毒素A。插入图为相应的试纸圆斑颜色变化，其中a显示出绿色，b显示出黄色。
图3为本发明所述方法在赭曲霉毒素A浓度为0.2 ng/mL～50 ng/mL范围内的变化趋势示意图。其中I和I0分别表示体系在含有和不含赭曲霉毒素A条件下的数值。
图4为本发明所述方法在不同毒素条件下的变化示意图。其中AFB1为黄曲霉毒素B1，AFM1为黄曲霉毒素M1，F-2为玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A浓度为1.0 ng/mL，其它毒素浓度为5.0 ng/mL。
具体实施方式：
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
为了更好地理解本发明的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案，具体包括合成、性质测定等。这些实施方式只是对本发明的说明，并不限制本发明。
实施例1：
一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，具体步骤如下：
1．制备蔗糖转化酶-端炔修饰DNA：首先将30 μL 0.3 mM巯基-端炔修饰DNA（巯基-端炔修饰DNA序列从5’到3’端为：5’-炔基- AAA AAA AAA AAA-巯基- 3’）、2.0 μL 30 mM 三-(2-甲酰乙基)膦（TCEP）和2.0 μL 1.0 M PBS缓冲溶液（由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制的磷酸盐缓冲溶液，pH为5.5）均匀混合，室温培育1.0小时，活化巯基-端炔修饰DNA。结束后采用分子量为10K的超滤离心管进行分离清洗5次。其次加入1.0 mg 磺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）至400 μL 20 mg/mL的蔗糖转化酶溶液中，混合均匀，室温震荡1.0小时，用以活化蔗糖转化酶。震荡结束后离心除去多余不溶解的Sulfo-SMCC，上层清液采用分子量为100K的超滤离心管进行离心清洗5次。最后将活化后的巯基-端炔修饰DNA与蔗糖转化酶溶液混合并室温培育48小时，反应结束后，采用分子量为100K的超滤离心管进行离心清洗5次，取出超滤离心管中所得的蔗糖转化酶-端炔修饰DNA溶液，溶解在500 μL的 0.01 M PBS缓冲溶液（pH为7.3）中以备后续实验使用。
2．将5.0 μL 0.05 μM的生物素-叠氮修饰DNA（生物素-叠氮修饰DNA序列从5’到3’端为：5’-生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-叠氮- 3’）、10 μL 链霉素修饰的磁珠加入至25 μL PBS缓冲溶液中，PBS缓冲溶液的浓度为0.01 M，pH为7.3，在室温下震荡30分钟，促使生物素-叠氮修饰DNA结合在磁珠表面。
3．在步骤2反应结束后的PBS缓冲溶液中加入5.0 μL NaCl和不同浓度的赭曲霉毒素A（具体浓度分别为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL），在室温下震荡15分钟；反应结束后，采用磁铁进行第一次分离，弃去第一次上层清液，得到下层磁珠，并用PBS缓冲溶液清洗磁珠两次，清洗结束后在磁珠中加入50 μL PBS缓冲溶液混匀，得到含有结合在磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4．取20 μL步骤3反应所得叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μL步骤1中所得的蔗糖转化酶-端炔修饰DNA溶液、5.0 μL 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μL 1.0 mM抗坏血酸溶液，在室温下培育10分钟，让抗坏血酸还原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖转化酶-端炔修饰DNA与磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A发生点击化学反应，得到蔗糖转化酶修饰磁珠溶液；
5．步骤4反应结束后，对步骤4中所得的蔗糖转化酶修饰磁珠溶液采用磁铁进行第二次分离，得到第二次上层清液；取10 μL第二次上层清液，加入至2.5 μL 2.0 M蔗糖溶液，在室温下反应20分钟，取3.0 μL溶液至血糖仪试纸上，采用血糖仪进行测量。绘制所测数值在不同赭曲霉毒素A浓度条件下的变化趋势图，根据该图就能检测赭曲霉毒素A的浓度。
实施例2：
一种便携快速检测赭曲霉毒素A方法的特异性，具体步骤如下：
在与实施例1同样的实验条件下，用四种其它毒素来代替赭曲霉毒素A作用后分别测定四种其它毒素的血糖仪响应值，并与赭曲霉毒素A的响应值进行对比，即可考察本发明所述方法的特异性。这四种毒素分别为黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素M1（AFM1）、玉米赤霉烯酮（F-2），使用浓度均为5.0 ng/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，特征在于：具体步骤如下：
（1）、按照参考文献（Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, Nature Chemistry, 2011, 3, 697-703.），采用巯基-端炔修饰DNA、磺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐、蔗糖转化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制备蔗糖转化酶-端炔修饰DNA；
（2）、将5.0 μL 0.05 μM的生物素-叠氮修饰DNA 、10 μL 链霉素修饰的磁珠一起加入至25 μL PBS缓冲溶液中，PBS缓冲溶液的浓度为0.01 M，pH为7.3，在室温下震荡30分钟，促使生物素-叠氮修饰DNA结合在磁珠表面；
（3）、在步骤（2）反应结束后的PBS缓冲溶液中加入5.0 μL NaCl和不同浓度的赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素A的浓度范围为0.2 ng/mL～50 ng/mL，在室温下震荡15分钟；反应结束后，采用磁铁进行第一次分离，弃去第一次上层清液，得到下层磁珠，并用PBS缓冲溶液清洗磁珠两次，清洗结束后在磁珠中加入50 μL PBS缓冲溶液混匀，得到含有结合在磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液；
（4）、取20 μL步骤（3）反应所得叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μL步骤（1）所得蔗糖转化酶-端炔修饰DNA溶液、5.0 μL 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μL 1.0 mM抗坏血酸溶液，在室温下培育10分钟，让抗坏血酸还原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖转化酶-端炔修饰DNA与磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A发生点击化学反应，得到蔗糖转化酶修饰磁珠溶液；
（5）、步骤（4）反应结束后，对步骤（4）中所得到的蔗糖转化酶修饰磁珠溶液采用磁铁进行第二次分离，得到第二次上层清液；取10 μL第二次上层清液，加入至2.5 μL 2.0 M蔗糖溶液，在室温下反应20分钟，取3.0 μL溶液至血糖仪试纸上，采用血糖仪进行测量，绘制所测数值在不同赭曲霉毒素A浓度条件下的变化趋势图，根据该图就能检测赭曲霉毒素A的浓度。
2.根据权利要求1所述的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，特征在于：步骤（1）中所述的巯基-端炔修饰DNA序列从5’到3’端为： 5’-炔基- AAA AAA AAA AAA-巯基- 3’。
3.根据权利要求1所述的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，特征在于：步骤（2）中所述的生物素-叠氮修饰DNA序列从5’到3’端为：5’-生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-叠氮- 3’。
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