CN110592092A - 适配体功能材料及其制备方法和在ota检测的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于霉菌毒素检测技术领域，具体涉及一种适配体功能材料及其制备方法和在OTA检测的应用。本发明提供的所述适配体功能材料具体包括：链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’‑Biotin‑A18‑22‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA‑3’；其中，所述链霉亲和素与生物素Biotin亲和性结合，A18‑22为18‑22个A碱基。该适配体功能材料对OTA具有高度特异性识别吸附作用，而且吸附容量高、吸附稳定好，在OTA检测中具有很好的应用前景。

Description

适配体功能材料及其制备方法和在OTA检测的应用
技术领域
本发明属于霉菌毒素检测技术领域，具体涉及一种适配体功能材料及其制备方法和在OTA检测的应用。
背景技术
核酸适配体(Aptamer)能与靶物质特异性亲和结合，当Aptamer与靶物质靠近时，能够通过弯曲盘旋折叠、链内碱基互补配对形成特殊的立体结构(发夹、茎环、假节、凸环、G-四分体等)，这些立体结构是Aptamer与靶物质亲和作用的结构基础，具有特异性识别功能；靶物质或靶物质的一部分恰好能进入到立体结构中，在立体结构中具有某些特异性识别位点，能通过假碱基堆积、氢键作用及静电作用等作用力与靶物质亲和作用。近年来有关于Aptamer在目标物的色谱纯化中应用的报道。
赭曲霉毒素(Ochratoxin)在粮食谷物中分布面广、检出率高、产毒量大且毒性强而引起关注。针对赭曲霉毒素的检测方法中应用较广的是ELISA、HPLC及HPLC-MS法，但是由于食品基质复杂多样且霉菌毒素含量甚微，因此需要合适的前处理手段从样品中富集纯化霉菌毒素，如固相萃取技术。然而，传统的固相萃取材料受到了吸附选择性和吸附容量的限制，目前应用最多的免疫亲和柱价格昂贵、不易生产修饰且容易失活，因此新型的霉菌毒素吸附材料的研发成为了迫切需求。
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是赭曲霉毒素中毒性最高、对农产品污染最严重、食品中分布最广且产毒量最多的毒素，能引发生物体多种剧烈的毒性反应，如免疫毒性(引发淋巴腺体坏死，免疫抑制)、黏膜毒性(胃溃疡、肠道坏死)、生殖毒性、肝毒性和肾毒性(肝硬化、肾小管损伤等)以及致癌作用(国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单中)。因此，对针对OTA的特异性选择吸附材料的研发更为迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适配体功能材料及其制备方法和在OTA检测的应用，旨在解决现有OTA的特异性选择吸附材料有限的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种适配体功能材料，所述适配体功能材料包括：链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；其中，所述链霉亲和素与生物素Biotin亲和性结合，A18-22为18-22个A碱基。
本发明提供一种特异性选择吸附OTA的适配体功能材料，在该适配体功能材料中，以链霉亲和素磁珠为载体材料，用特异性吸附OTA的核酸适配体作为功能单体，且以A18-22作为核酸适配体的5’端连接臂，通过链霉亲和素和生物素的生物学识别结合作用形成；这样的适配体功能材料具有很好的结构稳定性，同时通过试验证明，其仅对OTA具有高度特异性识别吸附作用，而且吸附容量高、吸附稳定好，在OTA检测和分析中具有很好的应用前景。
本发明另一方面提供一种适配体功能材料的制备方法，包括如下步骤：
提供链霉亲和素包被的磁珠，将所述链霉亲和素包被的磁珠分散于缓冲液中，得到磁珠分散液；
将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAC A-3’加入到所述磁珠分散液中，进行孵育处理，得到适配体功能材料。
本发明提供的适配体功能材料的制备方法工艺简单、成本低，可以直接将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’与链霉亲和素包被的磁珠混合孵育得到，该制备方法得到的适配体功能材料结构稳定，对OTA具有高度特异性识别作用，在OTA检测中具有很好的应用前景。
最后，本发明还提供一种本发明所述的适配体功能材料和/或本发明所述的制备方法得到的适配体功能材料在OTA检测中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中核酸适配体对照品溶液、核酸适配体修饰磁珠反应的剩余溶液及空白对照的EIC图；
图2为本发明实施例2中OTA对照品溶液、适配体功能材料对OTA试样吸附试验的洗脱液、空白对照的UPLC色谱图；
图3为本发明实施例3中适配体功能材料的吸附选择性试验结果图；
图4为本发明实施例4中适配体功能材料及链霉亲和素磁珠的等温吸附曲线图；
图5为本发明实施例5中适配体功能材料吸附性能随时间变化曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种适配体功能材料，所述适配体功能材料包括：链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；其中，所述链霉亲和素与生物素Biotin亲和性结合，A18-22为18-22个A碱基。
本发明实施例提供一种特异性选择吸附OTA的适配体功能材料，在该适配体功能材料中，以链霉亲和素磁珠为载体材料，用特异性吸附OTA的核酸适配体作为功能单体，且以A18-22作为核酸适配体的5’端连接臂，通过链霉亲和素和生物素的生物学识别结合作用形成；这样的适配体功能材料具有很好的结构稳定性，同时通过试验证明，其仅对OTA具有高度特异性识别吸附作用，而且吸附容量高、吸附稳定好，在OTA检测和分析中具有很好的应用前景。
具体地，在适配体功能材料中，链霉亲和素包被的磁珠载体的表面修饰部分：5’端为连接基团生物素Biotin，3’端为特异性识别OTA的DNA序列，而A18-22作为生物素Biotin和特异性识别OTA的DNA序列之间的间隔臂，可以减少特异性识别的DNA序列被载体埋没的几率，可使该DNA序列充分舒展，有利于保证固载的DNA序列的特异性识别效果，进一步提高OTA的回收率。在未增加A18-22序列之前，适配体功能材料对OTA的回收率仅为30％-40％，而本发明实施例提供的适配体功能材料增加A18-22序列之后，回收率达到60％-80％。
在一实施例中，A18-22选为A20(连接臂为20个A碱基)，即所述适配体功能材料为链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’-Biotin-A20-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’。
本发明一实施例中，采用纳米金比色法表征核酸适配体(完整的功能单位：5’-Biotin-A20-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’)与OTA之间的特异性亲和作用；通过单因素实验研究金纳米粒子(GNPs)的颜色变化(A650/A530的信号变化)随核酸适配体和盐等因素变化的规律。结果显示：(1)通过单因素试验考察了GNPs处于多种因素作用下处于稳定的临界状态：pH7体系中GNPs加入量为200μL 0.075nmol/L时，上述核酸适配体对GNPs体系颜色变化的影响均随核酸适配体的加入量呈现出一个趋势，只有当核酸适配体的终浓度大于0.035mmol/L才能使GNPs体系达到一个相对稳定状态；而NaCl的诱导聚沉作用对GNPs体系颜色变化的影响的趋势存在一个GNPs体系的A650/A530信号的临界点(35mmol/L NaCl)，在临界点及临界点之后的范围内NaCl的诱导聚沉作用和核酸适配体的稳定作用处于一种拮抗平衡的临界状态，任一因素的变化都能引起GNPs体系颜色显著变化。(2)通过纳米金比色法在诱导作用和稳定作用处于拮抗平衡临界状态的GNPs体系中加入OTA，A650/A530信号随着加入量增加而增加，表明越来越多的核酸适配体与OTA发生亲和作用生成复合物，使拮抗平衡趋向于NaCl的诱导聚沉作用，而非对应靶物质的加入对GNPs体系A650/A530信号无显著影响；结果表明上述核酸适配体能特异性识别OTA，能作为功能单体设计新型的适配体功能化吸附材料。因此，通过上述核酸适配体与链霉亲和素包被的磁珠合成本发明实施例特有的适配体功能材料即核酸适配体功能化微球。
另一方面，本发明实施例还提供了一种适配体功能材料的制备方法，包括如下步骤：
S01：提供链霉亲和素包被的磁珠，将所述链霉亲和素包被的磁珠分散于缓冲液中，得到磁珠分散液；
S02：将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC GGACA-3’加入到所述磁珠分散液中，进行孵育处理，得到适配体功能材料。
本实施例提供的适配体功能材料的制备方法工艺简单、成本低，可以直接将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’与链霉亲和素包被的磁珠混合孵育得到，该制备方法得到的适配体功能材料结构稳定，对OTA具有高度特异性识别作用，在OTA检测中具有很好的应用前景。
在一实施例中，步骤S01：用于分散链霉亲和素包被的磁珠的所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，且所述缓冲液的pH＝7.2；所述缓冲液中Tris-HCl的浓度为20mmol/L。缓冲溶液可以调节核酸适配体、链霉亲和素以及生物素这些生物分子的功能构象、活性及存在形式等，从而影响本发明实施例的适配体功能材料的合成效果，通过以不同pH、不通浓度、以及不同缓冲液和纯水为适配体功能材料的制备体系环境进行试验，结果表明，在pH 7.2的环境下，20mmol/L Tris-HCl缓冲液能使160pmol核酸适配体大部分修饰于于2.5mg链霉亲和素包被的磁珠表面，修饰率约95％，这表明该条件下能使核酸适配体、链霉亲和素以及生物素稳定存在，不会干扰修饰反应的进行。而在pH在偏酸性条件下(如pH为5.2或6.2)，核酸适配体在磁珠表面修饰不完全，这可能是因为链霉亲和素等电点偏高，在弱酸性条件下带正电荷，能与核酸适配体上带负电的磷酸基团部分结合，干扰链霉亲和素和生物素的特异性结合反应，降低了修饰率。因此，本发明实施例选择pH为7.2，且20mmol/L Tris-HCl缓冲液为制备方法的体系环境。
在一实施例中，步骤S02：将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’加入到所述磁珠分散液中的步骤中，A18-22的选择为A20；更进一步地，该5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAG GGAGCATCGGACA-3’以溶液的形式加入到磁珠分散液中，其浓度为0.5μmol/L。通过试验证明，随着核酸适配体的初始浓度增加，磁珠上核酸适配体的修饰量逐渐增大，即修饰反应平衡向着修饰结合的方向移动，但修饰率逐渐下降。当核酸适配体初始浓度达到0.5μmol/L时，2.5mg磁珠上核酸适配体的修饰量达到最大值198.999pmol/mg。因此，核酸适配体功能化磁珠的修饰反应中，核酸适配体的初始浓度选择0.5μmol/L。
对于核酸适配体溶液的配制可以为：取一管5OD核酸适配体，然后在4000rpm 4℃下离心2min，加入137μL超纯水配制成0.1mmol/L的OTA核酸适配体储备液，低浓度工作溶液由储备液用合适的溶剂逐级稀释得到。特异性识别OTA的核酸适配体的结构序列为：5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGG TGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA，可以由生工生物工程(上海)股份有限公司合成及在5’端Biotin修饰间隔臂，并经HPLC纯化得到。
进一步地，所述孵育处理的时间为3.5-4.5h。最佳地，孵育时间为4h，该时间条件下，使核酸适配体完全修饰在磁珠表面。孵育处理后，还可以进一步进行磁分离，保留反应后剩余溶液分析其中核酸适配体(分析修饰率)，磁分离后得到的微球用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)洗涤3次后4℃下保存在缓冲液中，备用。使用前用水充分洗涤除去缓冲盐的干扰。
本发明一实施例中，通过UPLC-Q-Orbitrap MS/MS建立了核酸适配体修饰的分析方法，考察修饰反应中核酸适配体的修饰量，优化核酸适配体对链霉亲和素磁珠的修饰反应条件：核酸适配体的初始浓度为0.5μmol/L，pH7.2 20mmol/L Tris-HCl缓冲液为修饰反应的体系环境，以及孵育时间(即修饰反应时间)4h。
最后，本发明实施例还提供一种本发明实施例所述的适配体功能材料和/或本发明实施例所述的制备方法得到的适配体功能材料在OTA检测中的应用。
具体地，在上述应用中，该OTA检测包括如下步骤：
E01：提供OTA样品溶液；
E02：将所述适配体功能材料加入所述OTA样品溶液中混合，进行吸附处理；
E03：将吸附处理后的适配体功能材料进行洗脱处理，经色谱分析，检测OTA含量。
上述步骤E01中，OTA样品溶液是待检测溶液，也可以是OTA标准溶液。
上述步骤E02中，将适配体功能材料加入OTA样品溶液中摇匀混合，进行的吸附处理是吸附萃取；其中，所述吸附处理的时间为1.5-2h，优选为2h；
为方便考察适配体功能材料对OTA的吸附性能，采用吸附率和洗脱率作为度量吸附性能的指标，按如下公式计算：
随着吸附时间的增加，适配体功能材料与OTA的作用也逐渐增加，当吸附时间达到120min时，吸附率达到最大值51.42％，而吸附时间再增加，对吸附率影响不显著，表明体系中适配体功能材料对OTA的吸附作用达静态吸附平衡。
在一实施例中，所述吸附处理的温度为45-50℃，优选50℃；由于温度升高，能增加分子热运动，增加体系中适配体功能材料与OTA分子的有效碰撞，增加识别结合的机会；此外温度升高还能增强适配体功能材料识别结合OTA的氢键作用力和假碱基堆积作用力，从而增加吸附率。但当温度高于50℃后，温度升高，将减少适配体功能材料的盘旋折叠，不利于其特异性识别作用的立体构象形成，使适配体功能材料对OTA的吸附率下降。综上，选择50℃为吸附体系的反应温度。
在一实施例中，所述吸附处理的体系中含有10mmol/L的Mg2+或5mmol/L的K+；试验证明，该吸附处理使用萃取溶剂进行吸附萃取时，萃取溶剂中如不含有K+和Mg2+，适配体功能材料对水溶液中OTA的吸附率约为51.35％。而随着体系中Mg2+的含量增加，吸附率也随之增加，当体系中Mg2+的浓度大于10mmol/L时，吸附率的接近其最大值达到62.62％。这是由于适配体功能材料在Mg2+诱导和稳定作用下，能形成特殊立体结构、且作为连接介质增加适配体功能材料与OTA的相互作用，从而提高吸附率。而体系中K+的浓度增加，吸附率呈现增大后减小趋势，吸附率最大可达56.14％，这是由于K+能诱导适配体功能材料形成G-四分体结构，在该特异性立体构象中通过假碱基堆积、氢键作用、静电作用增加适配体功能材料与OTA的特异性吸附；随后K+的浓度继续增加，吸附率反而下降。故体系中适量的K+和Mg2+均有利于适配体功能材料对OTA的吸附，选择Mg2+浓度为10mmol/L，K+浓度为5mmol/L。
在一实施例中，所述洗脱处理中所用的洗脱溶剂为乙腈水溶剂；所述洗脱处理为超声洗脱处理。洗脱溶剂对OTA的解吸附效果随有机溶剂(甲醇或乙腈)所占比例增加而增强，这是由于甲醇和乙腈能够抑制氢键的形成和破坏假碱基堆积作用力，利用“相似相溶”原理能从适配体功能材料解吸附OTA，随着有机溶剂的体积比增加，这种解吸附效果越强。相同体积比下，10％乙腈总是显示出比甲醇更强的解吸附效果，这是由于乙腈能够抑制本发明实施例的适配体功能材料形成特异性的立体构象，抑制了其与OTA的特异性识别结合，从而增强了解吸附效果。另外，超声洗脱时间增长，从适配体功能材料上解吸附OTA的效果越好，当超声洗脱时间为10min时，达到最优的洗脱效果，洗脱率约为93％。综上，选择10％乙腈-水(v/v)为洗脱溶剂，超声洗脱10min作为从体系中解吸附OTA的条件。
综上所述，本发明实施例通过UPLC-FLD建立了OTA的分析方法，优化了适配体功能材料对OTA吸附和洗脱条件：吸附时间为120min，吸附体系中Mg2+浓度为10mmol/L或K+浓度为5mmol/L，吸附温度为50℃；10％乙腈-水(v/v)为洗脱溶剂，超声洗脱10min为从体系中解吸附OTA的洗脱条件。
在一实施例中，所述色谱分析为超高效液相色谱分析，且色谱分析条件包括：色谱柱为Shim-pack XR-ODS，流动相为乙腈-水(1:1，v/v，含1％甲酸)，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温为35℃；荧光检测的激发光波长333nm，发射光波长460nm。
另外，本发明实施例还对适配体功能材料吸附选择性试验表明：该适配体功能材料能形成特异性的空间结构与OTA特异性识别。通过适配体功能材料对OTA的吸附平衡试验绘制其等温吸附曲线，吸附量随OTA浓度增加而增大，其吸附容量为38.67μg/g。适配体功能材料的稳定性考察结果表明：其批内批间材料的吸附率RSD不大于1.4％，具有高的批次稳定性；其对OTA的吸附率能在40天内稳定在同一水平，具有较好的时间稳定性。总之，本发明实施例的适配体功能材料被证明是一种新型的OTA吸附富集材料，其能为食品中OTA富集分离提供新的原理和方向。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1适配体功能材料的合成
(1)取0.25mL BioMag-SA链霉亲和素包被磁珠(4μm，10mg/mL)，加水5mL充分摇匀分散，浸润洗涤后分离磁珠，用水重复洗涤5次除去储存溶剂，再用5mL 20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗涤浸润1次，将磁珠重新分散于1.5mL 20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中。
(2)往上述磁珠所分散的缓冲液体系中加入160μL 0.5μmol/L核酸适配体(5’-Biotin-A20-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA)水溶液，加20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)稀释至2mL，充分摇匀，在摇床中室温摇动孵育4h。取出，磁分离，保留反应后剩余溶液分析其中核酸适配体，分离后的微球用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2)洗涤3次后4℃下保存在缓冲液中，备用。使用前用水充分洗涤除去缓冲盐的干扰。
(3)用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析合成的适配体功能材料：
将核酸适配体对照品溶液(即含有核酸适配体的标准溶液)、上述修饰磁珠反应磁分离后的剩余溶液及空白对照(空白溶剂)，在UPLC-Q-Orbitrap MS/MS上分析核酸适配体的含量。
色谱条件：色谱柱为Thermo DNAPacTM RP(2.1mmol/L×100mmol/L,4.0μm)；流动相A为5mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱(见表1的流动相梯度程序)。流速：0.2mL/min；进样量：5μL；柱温：60℃。
质谱条件：离子源：可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)；扫描模式：负离子模式；喷雾电压：3.0kV；气化温度：350℃；离子传输管温度：320℃；鞘气(N2)：35L/min；辅助气(N2)：5L/min；透镜电压：50V；采用数据依赖性扫描模式(Full MS-dd ms2)检测，一级扫描分辨率为70000，AGC target为1.0×106，最大注入时间为100ms，扫描范围为200～2000；二级扫描分辨率为17500，AGC target为1.0×105，最大注入时间为50ms，隔离窗口为2m/z，设置扫描母离子质荷比m/z为1979.00612(通过Q-Orbitrap质谱仪的注射泵系统将核酸适配体标准溶液注入质谱扫描其一级质谱图，选择合适的质荷比离子(m/z为1979.00612的[M-6H]6-)作为检测核酸适配体的母离子)，窗口范围为10ppm。
表1
结果如图1所示，修饰磁珠反应的剩余溶液与对照品溶液中核酸适配体在提取离子通道离子流(EIC)图中显示出相同的保留，且一级和二级质谱图的特征质谱峰和质谱图信息相拟合。由此可以推断，该合成方法能使核酸适配体完全修饰于链霉亲和素包被磁珠表面。
实施例2适配体功能材料富集分离OTA
取2.5mg上述实施例1制备的适配体功能材料于洁净的具塞试管中，加入5mL水充分摇匀，磁分离，重复洗涤3次除去储存液中缓冲盐的干扰。加入4mL1ng/mL的OTA标准品溶液，摇匀分散，在摇床中匀速摇动，50℃温度下萃取吸附2h，取出后磁分离，以4mL萃取溶剂洗涤，并加入4mL洗脱溶剂，摇匀，超声10min完成洗脱，在UPLC上检测流出液及洗脱液中OTA含量。
色谱条件：色谱柱为Shim-pack XR-ODS(2.0mm i.d.×50mm,1.6μm)；流动相为乙腈-水(1:1，v/v，含1％甲酸)，等度洗脱。流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：35℃。荧光检测器：激发光波长333nm，发射光波长460nm。
分别取5μL OTA对照品溶液(即含有OTA的标准品溶液)、上述OTA试样吸附试验后的洗脱液以及空白对照(即空白洗脱溶剂)按上述色谱条件在UPLC上检测OTA含量，结果如图2所示：OTA色谱峰分离度良好，理论塔板数大于3000，峰形良好即拖尾因子在0.95～1.05范围内，连续进样6次色谱峰峰面积的RSD为1.1％，表明色谱系统是有效适用的。
实施例3适配体功能材料特异性吸附OTA
分别取2.5mg适配体功能材料特异性重复洗涤除去储存液中缓冲盐的干扰，分别加入4mL一定浓度的OTA、黄曲霉素M1(AFM1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(Zea)标准品溶液(试样化合物结构参见如下)，按实施例2的方法完成适配体功能材料对四种毒素的吸附和分离。
(a)
结果如图3所示，适配体功能材料对OTA具有较好的吸附效果，吸附率达69％，而适配体功能材料对其他三种毒素(AFM1、DON、Zea)无明显的吸附效果。这是由于适配体功能材料中的核酸适配体能形成特异性的空间结构与OTA特异性识别，在特异性的空间结构中存在活性位点通过氢键作用、假碱基堆积作用和静电作用等作用力与OTA亲和结合，而AFM1、DON、Zea与OTA结构存在差异，不会被核酸适配体所识别结合。故适配体功能材料有高吸附选择性，能特异性地从体系中识别吸附OTA。
实施例4适配体功能材料的吸附平衡实验
分别取2.5mg同一合成批次的适配体功能材料重复洗涤除去储存液中缓冲盐的干扰，加入2mL系列浓度的OTA标准溶液，在摇床中匀速摇动，一定温度下萃取吸附2h，按实施例2的方法分析适配体功能材料的吸附量，绘制其等温吸附曲线及计算吸附容量，考察50℃下，适配体功能材料的吸附容量随体系中OTA浓度变化规律，按照如下公式计算适配体功能材料及链霉亲和素磁珠的吸附容量(Q，μg/g)
式中，Ci为吸附实验前溶液中OTA浓度(ng/mL)，Cti为吸附实验后溶液中OTA浓度(ng/mL)，V为所加入的试样标准溶液体积(L)，w为参与吸附平衡实验的适配体功能材料及链霉亲和素磁珠用量(g)。
结果如图4所示，链霉亲和素磁珠不具备与OTA作用的位点，对OTA无明显吸附作用。在配体功能材料分散固相萃取OTA的体系中，配体功能材料对OTA的静态吸附平衡时的吸附量随OTA的浓度增加而增大，但吸附率则随OTA浓度增大而减少。因为随着体系中OTA的量增大，是OTA和核酸适配体的结合反应向亲和结合方向移动，但是由于体系中活性结合位点和OTA的数量关系愈发紧张，限制了整体的吸附率。当OTA的初始浓度为160ng/mL时，配体功能材料的吸附量达最大值，即其吸附容量为38.67μg/g。
实施例5适配体功能材料的稳定性
批次稳定性：分别取同一合成批次和不同批次合成的适配体功能材料，按实施例2的方法分析其对OTA吸附性能。
时间稳定性：在合成后每隔一定时间取同一批次合成的适配体功能材料，按实施例2的方法分析其对OTA吸附性能。
结果如表2和图5所示：表2中，三个批次的批内材料完成OTA吸附实验的吸附率RSD均不大于1.4％，以批次内吸附率的平均值计算，三个批次的批间材料完成OTA吸附实验的吸附率RSD为0.4％，这表明所采用的适配体功能材料合成方法及OTA吸附实验的方法可行且重复性良好，适配体功能材料对OTA吸附性能的批内及批间稳定性较高。
表2
由图5可知，所合成的适配体功能材料，在40天内能稳定存在，对OTA的萃取性能无显著变化，但随着时间的推移，约在合成60天时，对体系中OTA的吸附率下降至62％附近，表明适配体功能材料具有较好的时间稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适配体功能材料，其特征在于，所述适配体功能材料包括：
链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；其中，所述链霉亲和素与生物素Biotin亲和性结合，A18-22为18-22个A碱基。
2.如权利要求1所述的适配体功能材料，其特征在于，所述适配体功能材料为链霉亲和素包被的磁珠以及与所述链霉亲和素包被的磁珠相结合的5’-Biotin-A20-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’。
3.一种适配体功能材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供链霉亲和素包被的磁珠，将所述链霉亲和素包被的磁珠分散于缓冲液中，得到磁珠分散液；
将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’加入到所述磁珠分散液中，进行孵育处理，得到适配体功能材料。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’加入到所述磁珠分散液中的步骤中，A18-22选为A20；和/或，
5’-Biotin-A18-22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’的浓度为0.5μmol/L。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，且所述缓冲液的pH＝7.2；和/或，
所述缓冲液中Tris-HCl的浓度为20mmol/L。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述孵育处理的时间为3.5-4.5h。
7.一种权利要求1或2所述的适配体功能材料和/或权利要求3-6任一项所述的制备方法得到的适配体功能材料在OTA检测中的应用。
8.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述OTA检测包括如下步骤：
提供OTA样品溶液；
将所述适配体功能材料加入所述OTA样品溶液中混合，进行吸附处理；
将吸附处理后的适配体功能材料进行洗脱处理，经色谱分析，检测OTA含量。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述吸附处理的时间为1.5-2h；和/或，
所述吸附处理的温度为45-50℃；和/或，
所述吸附处理的体系中含有10mmol/L的Mg2+或5mmol/L的K+；和/或，
所述洗脱处理中所用的洗脱溶剂为乙腈水溶剂；和/或，
所述洗脱处理为超声洗脱处理。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述色谱分析为超高效液相色谱分析，且色谱分析条件包括：色谱柱为Shim-pack XR-ODS，流动相为乙腈-水(1:1，v/v，含1％甲酸)，流速为0.4mL/min，进样量为5μL，柱温为35℃；和/或，
荧光检测的激发光波长333nm，发射光波长460nm。
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