CN104357044A - 一种荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荧光探针，其结构式如通式I所示，通式I其中，R为C₇～C₁₂烷基。本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和在检测氰根离子方面的应用。本发明以吩噻嗪衍生物为荧光母体，引入丙二腈结构作为与氰根离子反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光差别，实现选择性地检测氰根离子。本发明制得的荧光探针 PTZ ，在488nm激发，702nm发射，对氰根离子具有很高的选择性和灵敏度，相应速度快，检测最低氰根离子浓度达67nmol·L^-1，并可定量检测氰根离子，可用于水体、土壤及生物体内氰根离子的检测。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化工领域，尤其涉及一种荧光探针，具体来说是一种荧光探针及其制备方法和在检测氰根离子方面的应用。

背景技术

氰化物是一种令人生畏的剧毒物质，受到人类关注已有一百多年的历史，至今仍然受到高度重视。氰化物进入有机体后分解出具有毒性的氰根离子（CN^-），氰根离子能严重影响人体的诸多生理器官与功能，如视觉、心脏、中枢神经、血管、内分泌、代谢系统等。最令人熟知的是氰根离子能与血红素蛋白中的铁离子结合，从而抑制动物体的呼吸作用。此外，氰根离子还会抑制组织细胞内42种酶的活性。虽然氰化物具有剧毒，但是它仍被广泛应用于冶金、电镀工业、钢铁炼造、合成纤维、树脂工业等领域，从而也导致其不可避免的对环境产生了污染。

荧光探针是检测环境和生命体内氰根离子的有效手段之一。具有实际应用前景的荧光探针应具有与待测物作用前后荧光变化明显、对待测物响应快、选择性好、制备简单、成本低廉等优点。迄今，已见报道的用于检测氰根离子的荧光探针主要基于超分子化学方法（F. N. Castellano，et al.， J. Am. Chem. Soc. ，2002，124，6232-6233；J. C. Mareque-Rivas，et al.， Chem. Commun. ，2008，1998-2000），包括离子置换手段（B. Z. Tang，et al.， Chem. Commun. ，2008，1094-1096；L. J. Tang，et al.， Sensor. Actuat. B ，2012，173，862-867）。而以氰基亲核加成反应为基础开发的检测氰根离子的荧光探针正受到人们越来越多的关注，因为该类探针可以最大程度上减弱干扰离子的影响，提高探针对氰根离子的选择性和灵敏度（E. U. Akkaya，et al.， Org. Lett. ，2008，10，461-464；J. L. Hua，et al.， ACS Appl. Mater. Interfaces ，2013，5，1317-1326；A. Misra，et al.， Tetrahedron Lett. ，2014，55，1052-1056）。但是，这类探针仍存在检测灵敏度低、合成路线复杂、成本较高等缺点，因此，开发高灵敏度、高选择性检测氰根离子的低成本荧光探针对人体健康和环境保护等领域仍具有重大的现实意义。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种荧光探针及其制备方法和应用，所述的这种荧光探针及其制备方法和应用要解决现有技术中的探针检测灵敏度低、合成路线复杂、成本较高的技术问题。

本发明提供了一种荧光探针，其结构式如通式I所示，

通式I

其中，R为C₇～C₁₂烷基。

进一步的，R为C₈～C₁₀烷基。

进一步的， R为C₈烷基。

本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

（a）一个制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤，在所述的制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤中，在氩气保护和存在条件下，将正丁基锂注入低温条件下的N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪的干燥四氢呋喃溶液中，反应1-3小时，再滴加N-甲酰吗啉，反应1-3小时后升至室温反应3-12小时，得到N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪（式IV所示化合物）；

（b）一个制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤，在所述的制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤中，以吡啶为溶剂，将N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪（式IV所示化合物）与丙二腈在回流条件下反应1-8小时，得到相应的荧光探针（式I所示化合物）。

进一步的，在所述的制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤中，在一个反应容器中，加入N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪，氩气保护下，注入干燥四氢呋喃，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和四氢呋喃的摩尔体积比为0.8~1.2 mmol：18~30 mL，置于-100~-60℃的条件下搅拌，注入正丁基锂的正己烷溶液，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和正丁基锂的摩尔比为0.8~1.2：2~3，搅拌0.5~2小时后，注入N-甲酰吗啉和四氢呋喃组成的溶液，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和N-甲酰吗啉的摩尔比为0.8~1.2：2.5~4，反应0.5~2小时后，缓慢升至室温，搅拌反应5~16小时，向溶液中加入稀盐酸酸化，使得溶液的pH在1~5之间，搅拌20~60分钟，静置分层，分出有机相，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥、抽滤、滤饼用二氯甲烷洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，柱层析分离，得N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪。

进一步的，在所述的制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤中，在另外一个反应容器中，依次加入化合物N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪、吡啶及丙二腈，所述的N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪、吡啶及丙二腈的摩尔体积比为0.2~0.3 mmol：12~18 ml：0.8~1.2 mmol，加热回流1~3小时，自然降温后，加入水，水的体积为吡啶体积的1.5~3倍，所得混合物用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，柱层析分离，得到相应的荧光探针。

上述荧光探针（含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物）的合成路线如下所示：

本发明还提供了上述荧光探针在检测氰根离子中的应用。

进一步的，上述荧光探针用于检测水体、土壤或生物体系中的氰根离子。

进一步的，在上述的荧光探针在检测溶液中氰根离子的过程时，若溶液中含有氰根离子，通式I表示的化合物与CN^-反应后生成具有通式II结构的化合物，

通式II

从而导致荧光强度的改变，通过测定反应引起的体系中荧光强度的变化获得氰根离子的浓度。

本发明采用的N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪为市售的化合物，也可以采用文献常规的方法制备，在此不再赘述。

本发明是一种可用于选择性检测氰根离子的荧光探针，以吩噻嗪衍生物为荧光母体，在吩噻嗪母体上引入丙二腈结构作为与氰根离子反应的活性中心，利用反应物和产物之间的荧光差别，实时高选择性地检测氰根离子。

本发明可以在纯有机溶液（如：四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇）或相应的有机-水混合溶液中高选择性地与氰根离子作用，作用后荧光完全猝灭，是一类优良的荧光探针。

相对于现有的检测氰根离子的荧光探针而言，本发明所提供的含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物具有合成比较简单、合成步骤较少、而且原料成本低廉和易于大规模的商业化生产等优点。

本发明所述的荧光探针，可应用于检测氰根离子，该荧光探针可与氰根离子反应生成具有通式II结构的化合物，从而导致荧光改变。

本发明所述的荧光探针，可对CN^-进行定性或定量检测。将浓度呈梯度变化的CN^-水溶液分别加入通式I的溶液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度，然后以CN^-的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强度从图中读出待测溶液中CN^-的含量。

本发明所述的荧光探针在CN^-存在下荧光发生明显改变，可以用于高选择性、高灵敏性地检测CN^-。本发明的荧光探针PTZ，在488 nm激发，702 nm发射，对氰根离子具有很高的选择性和灵敏度，相应速度快，检测最低氰根离子浓度达67 nmol∙L^-1，并可定量检测氰根离子。

本发明所述的荧光探针在细胞内时，在CN^-存在下使得细胞荧光显像发生明显改变，细胞内的荧光会完全淬灭，即可根据荧光变化检测细胞内是否存在CN^-。本发明对于环境保护、生物体内氰化物检测等均具有重要意义。

附图说明

图1是本发明提供的荧光探针PTZ检测CN^-的原理示意图；

图2是实施例2中，10 μmol∙L^-1荧光探针PTZ在加入不同浓度CN^-后荧光发射光谱图，从上到下，CN^-浓度依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 μmol∙L^-1，溶液体系为二甲基亚砜-水混合溶液（体积比为9：1），横坐标为波长，纵坐标为荧光强度值；

图3是实施例2中，氰根离子的浓度的标准曲线图，即10 μmol∙L^-1荧光探针PTZ，反应后在702 nm处荧光强度数值与氰根离子浓度（0-14 μmol∙L^-1）的线性关系；横坐标为氰根离子浓度，纵坐标为荧光探针在702 nm处荧光强度数值；

图4是实施例3中，10 μmol∙L^-1荧光探针PTZ对CN^-的选择性示意图，CN^-浓度为22 μmol∙L^-1，其它阴离子（F^-，Cl^-，Br^-，I^-，NO₂ ^-，NO₃ ^-，OAc^-，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，HCO₃ ^-，CO₃ ^2-，SCN^-，S^2-，SO₄ ^-）浓度为200 μmol∙L^-1，溶液体系为二甲基亚砜-水混合溶液（体积比为9：1），纵坐标为荧光强度猝灭比率(I₀-I)/I₀（I和I₀分别表示是否存在阴离子时PTZ在702 nm处的荧光强度数值）。

图5是实施例4中，10 μmol∙L^-1荧光探针PTZ检测人类神经母细胞瘤细胞（HeLa cells）中CN^-的示意图，CN^-浓度为20 μmol∙L^-1，细胞培养基为RPMI-1640和二甲基亚砜混合溶液（体积比为9：1），（a）、（b）、（c）分别为荧光探针PTZ在人类神经母细胞瘤细胞中的荧光图像、明场图像以及叠加图像，（d）、（e）、（f）分别为CN^-存在下荧光探针PTZ在人类神经母细胞瘤细胞中的荧光图像、明场图像以及叠加图像，激发波长为488 nm，图像收集波长区间为650-750 nm。

图6是本发明合成的荧光探针PTZ核磁共振氢谱。

图7是本发明合成的荧光探针PTZ核磁共振碳谱。

图8是本发明合成的荧光探针PTZ高分辨率质谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。

下列实施例中所说的室温是：25-28 ℃；所用原料及试剂均为市售品。

实施例1（探针的合成）：

（1）化合物IV-1的合成

在50 mL史莱克管中，加入化合物III-1（469 mg，1.0 mmol），氩气保护下，注入干燥四氢呋喃（20 mL），置于-78 ℃搅拌，注入正丁基锂的正己烷溶液（2.5 mol∙L^-1，0.96 mL，2.4 mmol）。搅拌1小时后，注入N-甲酰吗啉（344 mg，3.0 mmol）和四氢呋喃（5 mL）组成的溶液。反应1小时后，缓慢升至室温，搅拌反应12小时。向溶液中加入稀盐酸（10 mL，1 mol∙L^-1）酸化，搅拌45分钟。静置分层，分出有机相，水相用二氯甲烷（20 mL×3）萃取，合并有机相，饱和食盐水（20 mL）洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤饼用二氯甲烷（20 mL×2）洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，以硅胶为固定相，石油醚：二氯甲烷=1：1（v/v）为洗脱剂柱层析分离，得213 mg黄色粉末状固体IV-1，产率58%。

¹H NMR (400 MHz，CDCl₃) δ (ppm)：0.86 (t，3H，J 6.6 Hz，-CH₃)，1.25-1.34 (m，8H，-CH₂-)，1.41-1.46 (m，2H，-CH₂-)，1.78-1.85 (m，2H，-CH₂-)，3.92 (t，2H，J 7.2 Hz，N-CH₂-)，6.94 (d，2H，J 8.4 Hz，Ar-H)，7.55 (s，2H，Ar-H)，7.65 (d，2H，J 8.4 Hz，Ar-H)，9.81 (s，2H，-CHO). ¹³C NMR (100 MHz，CDCl₃) δ (ppm)：14.0，22.6，26.6，26.7，29.0，29.1，31.7，48.5，115.6，124.5，128.4，130.1，132.0，148.9，189.8. HR-ESIMS m/z：[M+H]⁺ calcd. for C₂₂H₂₆NO₂S，368.1684；found，368.1682.

（2）探针PTZ的合成

在25 mL单口烧瓶中，依次加入化合物IV-1（100 mg，0.27 mmol）、吡啶（15 mL）及丙二腈（66 mg，1.0 mmol），加热回流2小时。自然降温后，加入水（30 mL），所得混合物用二氯甲烷（20 mL×2）萃取。有机相用饱和食盐水（20 mL×2）洗涤，无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，滤饼用二氯甲烷（10 mL）洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，以硅胶为固定相，石油醚：二氯甲烷=1：1（v/v）为洗脱剂柱层析分离，得99 mg紫红色固体PTZ，产率79%。

¹H NMR (400 MHz，DMSO-d₆ ) δ (ppm)：0.76 (t，3H，J 6.8 Hz，-CH₃)，1.14-1.17 (m，8H，-CH₂-)，1.27-1.32 (m，2H，-CH₂-)，1.58-1.65 (m，2H，-CH₂-)，3.91 (t，2H，J 6.8 Hz，N-CH₂-)，7.21 (d，2H，J 8.8 Hz，Ar-H)，7.58 (s，2H，Ar-H)，7.78 (dd，2H，J 8.8 1.6 Hz，Ar-H)，8.21 (s，2H，=CH-). ¹³C NMR (100 MHz，CDCl₃) δ (ppm)：13.1，21.6，25.5，25.7，28.0，28.1，30.6，47.7，78.8，112.0，113.1，114.9，123.0，125.6，128.6，130.2，147.0，156.0. HR-EIMS m/z：[M]⁺ calcd. for C₂₈H₂₅N₅S，463.1831；found，463.1832.

实施例2（探针PTZ荧光检测氰根离子）：

将上述所得的分子探针溶解于二甲基亚砜-水混合溶液（体积比为9：1）中，配置成10 μmol∙L^-1的探针溶液。将2.5 mL探针溶液加入到1 cm×1 cm×4 cm的带塞比色皿中，然后用微量注射器分别加入不同浓度的CN^-（钠盐）后均匀混合2分钟，测试其荧光发射光谱，λ_ex = 488 nm，结果如图2所示。随着CN^-的不断加入，溶液的红色荧光逐渐猝灭。PTZ对CN^-的检测限为67 nmol∙L^-1，说明探针对CN^-具有很高的检测灵敏度。

图3表示在PTZ的浓度为10 μmol∙L^-1的二甲基亚砜-水混合溶液（体积比为9：1）条件下，工作液在702 nm处的荧光强度数值F与加入的CN^-的浓度（0-14 μmol∙L^-1）呈良好的线性关系。工作曲线方程为：F = 191590.721 [CN^-] (μmol∙L^-1) – 11910.225，R = 0.994。由此可见，探针能实现在该浓度范围内对CN^-的定量检测，而且溶液的颜色发生显著变化，由红色变为浅红色，说明该探针也适用于裸眼检测。

实施例3（探针PTZ对CN^-的选择性）：

将上述所得的分子探针溶解于二甲基亚砜-水混合溶液（体积比为9：1）中，配置成10 μmol∙L^-1的探针溶液。每次将2.5 mL探针溶液加入到1 cm×1 cm×4 cm的带塞比色皿中，然后用微量注射器分别加入22 μmol∙L^-1 CN^-（钠盐）和200 μmol∙L^-1常见阴离子（钠盐或钾盐），如：F^-，Cl^-，Br^-，I^-，NO₂ ^-，NO₃ ^-，OAc^-，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，HCO₃ ^-，CO₃ ^2-，SCN^-，S^2-，SO₄ ^-。均匀混合2分钟后，测试其荧光发射光谱，λ_ex = 488 nm。以荧光强度猝灭比率(I₀-I)/I₀（I和I₀分别表示是否存在阴离子时PTZ在702 nm处的荧光强度数值）为纵坐标作图，结果如图4所示。图4表明PTZ对CN^-具有很好的选择性，体系荧光完全猝灭。在同样的测试条件下，相比于CN^-，其它阴离子导致的荧光猝灭基本可以忽略。在相应的阴离子体系中分别加入22 μmol∙L^-1 CN^-，体系荧光则完全淬灭，说明相关阴离子的存在对CN^-的检测不构成影响。

实施例4（探针PTZ对细胞内CN^-的检测）：

将上述所得的分子探针溶解于含有10 μmol∙L^-1人类神经母细胞瘤细胞（HeLa cells）的RPMI-1640和二甲基亚砜混合溶液（体积比为9：1）中，配置成10 μmol∙L^-1的探针培养基，并于37 ℃下培养30分钟后，成像（荧光、明场、叠加图像）。将探针PTZ溶解于含有10 μmol∙L^-1人类神经母细胞瘤细胞（HeLa cells）和20 μmol∙L^-1四丁基氰化铵的RPMI-1640和二甲基亚砜混合溶液（体积比为9：1）中，配置成10 μmol∙L^-1的探针培养基，并于37 ℃下培养30分钟后，成像（荧光、明场、叠加图像）。图5表明PTZ可以有效地检测细胞内的CN^-，当细胞内存在CN^-时，细胞内的荧光完全淬灭，说明该探针可以适用于细胞体内的氰根离子检测。

Claims (9)

1.一种荧光探针，其特征在于：其结构式如通式I所示，

通式I

其中，R为C₇～C₁₂烷基。

2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：R为C₈～C₁₀烷基。

3.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于： R为C₈烷基。

4.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（a）一个制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤，在所述的制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤中，在氩气保护和存在条件下，将正丁基锂注入低温条件下的N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪的干燥四氢呋喃溶液中，反应1-3小时，再滴加N-甲酰吗啉，反应1-3小时后升至室温反应3-12小时，得到N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪；

（b）一个制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤，在所述的制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤中，以吡啶为溶剂，将N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪与丙二腈在回流条件下反应1-8小时，得到相应的荧光探针。

5.如权利要求4所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述的制备N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪的步骤中，在一个反应容器中，加入N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪，氩气保护下，注入干燥四氢呋喃，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和四氢呋喃的摩尔体积比为0.8~1.2 mmol：18~30 mL，置于-100~-60℃的条件下搅拌，注入正丁基锂的正己烷溶液，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和正丁基锂的摩尔比为0.8~1.2：2~3，搅拌0.5~2小时后，注入N-甲酰吗啉和四氢呋喃组成的溶液，N-烷基取代的3，7-二溴吩噻嗪和N-甲酰吗啉的摩尔比为0.8~1.2：2.5~4，反应0.5~2小时后，缓慢升至室温，搅拌反应5~16小时，向溶液中加入盐酸酸化，使得溶液的pH在1~5之间，搅拌20~60分钟，静置分层，分出有机相，水相用有机溶剂萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥、抽滤、滤饼用二氯甲烷洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，柱层析分离，得N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪。

6.如权利要求4所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述的制备含丙二腈基团的吩噻嗪衍生物的步骤中，在另外一个反应容器中，依次加入化合物N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪、吡啶及丙二腈，所述的N-烷基取代的3，7-二甲酰基吩噻嗪、吡啶及丙二腈的摩尔体积比为0.2~0.3 mmol：12~18 mL：0.8~1.2 mmol，加热回流1~3小时，降温，加入水，水的体积为吡啶体积的1.5~3倍，所得混合物用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤后，将滤液与洗涤液合并，真空浓缩后，柱层析分离，得到相应的荧光探针。

7.权利要求1所述荧光探针在检测氰根离子中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：用于检测水体、土壤或生物体系中的氰根离子。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在权利要求1所述的荧光探针在检测溶液中氰根离子的过程时，若溶液中含有氰根离子，通式I表示的化合物与CN^-反应后生成具有通式II结构的化合物，

通式II

从而导致荧光强度的改变，通过测定反应引起的体系中荧光强度的变化获得氰根离子的浓度。