CN109320438B - 一种检测氰化物的荧光探针及其合成方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测氰化物的荧光探针及其合成方法和用途，步骤如下：将2‑萘甲醛、丙二腈和氯化锌混合，在密闭条件下加热至融化状态，继续搅拌；反应结束后，冷却至室温，得到粗产物；将粗产物用乙醇水溶液洗涤后抽滤，将得到的滤饼重结晶，干燥，得到所述荧光探针。本发明所合成的探针分子结构简单，原料成本低廉，且合成步骤只有一步，具有较高的产率，便于大规模生产。此外，该荧光探针有很好的实用性，能检测不同食物样品中的氰化物，在食品检测方面有很好的应用前景。

Description

一种检测氰化物的荧光探针及其合成方法和用途
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种基于萘的荧光探针及其制备方法和在检测食品中氰化物方面的应用。
背景技术
众所周知，氰根离子(CN-)是一种剧毒试剂，因而对人体健康有极大的危害。它与金属酶中的铁离子结合从而抑制生物体内的氧化代谢和细胞呼吸等生理过程。然而，生氰作用普遍存在于各种植物中，包括一些重要的粮食作物，例如高粱、杏仁、竹笋、发芽的土豆、白三叶草和木薯等。在生氰植物中，当植物受损后生氰糖苷会通过酶水解从而释放氰化物。人类氰化物中毒主要是因为食用了生的或者是没有经过合理加工的生氰食物，这些食物会导致人体死亡或者永久性神经功能缺损，例如麻痹症。因此，设计出能有效检测食物样品中氰化物含量的方法是非常有必要的。
目前来说，检测氰化物的一些方法包括：质谱法、电化学分析法、离子色谱法、拉曼光谱法、流动注射法、比色法和荧光探针。在这些检测方法中，荧光探针因其选择性好、灵敏度高、响应迅速以及操作技术简单等优点而备受关注。由于氰化物与金属离子(Co2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Zn2+)、H+和硼酸衍生物具有很强的结合能力，许多以此为原理的检测氰化物的小分子荧光探针被开发。除此之外，利用氰化物对一些缺电子双键(C＝C,C＝O,C＝N,C＝S,C＝N+)的亲核加成机理，开发出一系列新型氰化物荧光探针。大多数已报道的荧光探针在检测水样或者生物细胞中的氰化物表现出良好的性能。但是，用以检测食品中氰化物的荧光探针仍然很少。此外，已报道的氰化物荧光探针通常需要复杂的合成步骤。从应用广泛这一前景看来，具有简单的合成工艺的荧光探针备受青睐。因此，开发合成简单、选择性好、灵敏度高的低成本的氰化物荧光探针用于检测食品中的氰化物具有非常重要的意义。
发明内容
针对目前氰化物探针存在的问题和研究现状，本发明提供一种基于萘的荧光探针及其制备方法和应用，所述的这种氰化物荧光探针及其制备方法和应用要解决现有技术中的探针合成路线复杂、成本高、无法快速灵敏地检测食品中的氰化物的技术问题。
本发明提供的氰化物荧光探针的化学式如下：
Figure BDA0001826840400000011
本发明还提供了上述探针的合成方法，以2-萘甲醛和丙二腈为原料，在氯化锌的催化作用下发生Knoevenagel缩合反应所制得。具体包括如下步骤：
(1)将2-萘甲醛(0.500g,3.2mmol)，丙二腈(0.211g,3.2mmol)和氯化锌(0.435g,3.2mmol)混合置于密闭玻璃试管中。加热至融化，搅拌1小时。反应结束后，冷却至室温，得到粗产物。
(2)粗产物用体积分数为5％的乙醇水溶液洗涤后抽滤，滤饼用二氯甲烷和石油醚重结晶，抽滤，干燥，得到相应的荧光探针1。
本发明还提供了上述荧光探针在检测含氰化物样品中的应用。
(1)上述荧光探针用于检测植物中的氰化物。
(2)上述荧光探针在检测溶液中氰化物的过程中，若溶液中含有氰化物，结构式1表示的化合物与CN-反应后生成结构式2的化合物，从而导致荧光发生改变，通过测定反应引起的体系中荧光强度的变化获得CN-的浓度。
Figure BDA0001826840400000021
本发明是一种可用来选择性检测氰化物的荧光探针，以萘为荧光母体，在母体上引入丙二腈作为反应活性中心，探针与氰化物发生亲核加成反应，从而使得产物与反应物之间有明显的荧光变化，实现选择性检测氰化物。
本发明的紫外吸收和荧光发射光谱法检测氰化物的探针的具体特征如下：
本发明的荧光探针在磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)作为溶剂条件下，在紫外光谱中，探针在332nm处有强的紫外吸收峰，并且在279nm有一个肩峰。加入氰化物后，332nm和279nm的吸收峰降低，在278nm有一个新的峰逐渐形成。荧光光谱中，在466nm有一个较强的荧光发射峰，加入CN-后，466nm的荧光发射峰逐渐减弱，在509nm出现新的荧光发射峰，相应地，溶液从蓝色荧光变成绿色荧光。
本发明的有益效果为：所述的探针分子结构简单，原料成本低廉，且合成步骤只有一步，具有较高的产率，便于大规模生产。此外，该荧光探针有很好的实用性，能检测不同食物样品中的氰化物，在食品检测方面有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的荧光探针分子的核磁共振氢谱图；
图2为本发明提供的荧光探针分子的核磁共振碳谱图；
图3为本发明提供的荧光探针分子的质谱图；
图4为本发明提供的荧光探针分子的光谱测试图，测试时探针浓度为20μM，测试溶液条件为磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)，激发波长为297nm；(a)为探针分子对CN-的荧光滴定曲线图；(b)为加入CN-后离子浓度-荧光强度关系曲线；(c)为探针分子(左)及加入CN-(右)后荧光颜色变化；(d)为探针分子对CN-的紫外滴定图；
图5为不同阴离子对荧光探针分子响应的荧光强度。测试时探针浓度为20μM，其他待测离子为80μM，测试溶液条件为磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)；1-15依次为探针+不同阴离子：空白，CN-，F-，Cl-，Br-，I-，HCO3 -，NO3 -，SCN-，CH3COO-，HSO3 -，ClO4 -，glucose，Gly和Cys；插图为探针在不同待测离子溶液中(80μM)荧光颜色变化，a-f分别为探针，探针+CN-，探针+Cl-，探针+SCN-，探针+HSO3 -和探针+Cys；
图6为在不同阴离子共存下荧光探针分子对CN-响应的荧光强度。测试时探针浓度为20μM，CN-浓度为80μM，其他阴离子为80μM，测试溶液条件为磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)；1-14分别为探针+CN-+不同阴离子：空白，F-，Cl-，Br-，I-，HCO3 -，NO3 -，SCN-，CH3COO-，HSO3 -，ClO4 -，glucose，Gly和Cys；
图7为本发明提供的探针分子(20μM)对CN-(80μM)的响应时间；
图8为本发明提供的探针分子(20μM)自身(■)以及加入CN-(80μM)后(●)在不同pH(2.3-10.1)溶液中荧光强度比率值(I509/I466)的变化。测试的激发波长为297nm；
图9为本发明提供的荧光探针对樱桃果肉提取物和樱桃果仁提取物中氰化物的检测。测试时探针浓度为20μM，■代表探针，●代表探针+樱桃果肉提取物，▲代表探针+樱桃果仁提取物。插图为365nm紫外灯照射下的荧光变化；
图10为本发明提供的荧光探针对苦木薯根提取物中内源性氰化物的定性检测。测试时探针浓度为20μM，■代表探针，●代表探针+50μL苦木薯根提取物；
图11为本发明提供的荧光探针，用标准加入法对苦木薯根提取物中内源性氰化物的定量检测，所得的标准曲线图。测试时探针浓度为20μM；
图12为本发明提供的荧光探针制备成试纸，并通过所制备的试纸对苦杏仁提取液中氰化物进行检测。a、b分别为探针试纸及探针试纸浸入5mL含氰化钾的溶液中(100μM)，c-f探针试纸浸入5mL加有不同体积的苦杏仁提取液。图片是在365nm紫外灯照射下进行拍照；
图13为本发明提供的荧光探针用荧光成像法对发芽马铃薯中内源性氰化物的检测。图中a、d、g为蓝色通道的荧光成像，b、e、h为绿色通道的荧光成像，c、f、i为明场。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行描述或做进一步说明。
下列原料及试剂均为市售品。
实施例1(荧光探针的合成)
所述的检测氰化物的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤概括如下：
将2-萘甲醛、丙二腈和氯化锌混合，在密闭条件下加热至融化状态，继续搅拌；反应结束后，冷却至室温，得到粗产物；将粗产物用乙醇水溶液洗涤后抽滤，将得到的滤饼重结晶，干燥，得到所述荧光探针。
具体制备步骤如下：
(1)将2-萘甲醛(0.500g,3.2mmol)、丙二腈(0.211g,3.2mmol)和氯化锌(0.435g,3.2mmol)混合后置于密闭玻璃试管中。加热至融化状态，用磁力搅拌器搅拌1小时，反应物由固体变成黄色液体，停止反应，冷却至室温，得到粗产物。
其中2-萘甲醛、丙二腈和氯化锌的摩尔比为1:1:1，通过薄层色谱TLC来检测反应过程，当薄层色谱TLC检测2-萘甲醛的紫外吸收消失时，即可停止反应；薄层色谱TLC展开剂为二氯甲烷和石油醚，二氯甲烷和石油醚的体积比为3:1；1H NMR(CDCl3,400MHz),δ(ppm):8.28(s,1H),8.08(dd,J＝1.6Hz,8.4Hz,1H),7.95(m,3H),7.90(s,1H),7.68(t,J＝7.2Hz,1H),7.61(t,J＝7.2Hz,1H)；13C NMR(CDCl3,100MHz),δ(ppm):159.7,135.9,134.4,132.6,130.0,129.7,129.6,128.6,128.0,127.8,124.2,114.0,112.9,82.2；
荧光探针分子的1H-NMR谱图如图1，13C-NMR谱图如图2，EI-MS谱图如图3。
(2)粗产物用体积分数为5％的乙醇水溶液洗涤后抽滤，滤饼用二氯甲烷和石油醚重结晶，抽滤，干燥，得到相应的荧光探针(0.55g,产率84.3％)。
本发明的合成路线如下：
Figure BDA0001826840400000041
实施例2(荧光探针对氰化物的光谱测试)
所述的荧光探针在磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)作为溶剂条件下，如图4a所示，自身在466nm有一个较强的荧光发射峰，加入CN-，466nm的峰逐渐减弱，在509nm出现新的荧光发射峰，同时，在482nm处出现的等发射点表明该探针与氰化物的反应是一个清晰的过程。探针与氰化物反应后发生红移，是一个比率型的荧光探针，这就有效地减少了光漂白、探针自身或激发强度变化引起的干扰。未加入氰化物，探针的荧光强度比率值(I509/I466)为0.49。随着氰化物的加入，荧光强度比率值(I509/I466)逐渐增大，当氰化物含量达到80μM(图4b)时荧光强度比率值达到平衡，此时的比率值(I509/I466)为1.66。当CN-浓度为0-60μM，荧光强度比率值(I509/I466)与CN-浓度有很好的线性关系(Y＝0.47749+0.01832X,R2＝0.99779)，这表明该荧光探针能定量检测氰化物，且检测限为0.23μM，低于世界卫生组织(WHO)规定的饮用水中氰化物允许的最高浓度(1.9μM)。此外，加入CN-后荧光由蓝色变成绿色(图4c)。
本发明所述的荧光探针在CN-存在下，紫外发生明显的改变。探针在332nm处有强的紫外吸收峰，并且在279nm有一个肩峰。加入氰化物后，332nm和279nm的吸收峰降低，在278nm有一个新的峰逐渐形成(图4d)。相应地，加入氰化物后探针溶液在可见光照射下由黄色变为无色。
实施例3(荧光探针对氰化物的选择性测试)
室温下，将所述的荧光探针溶于DMF溶液中，配制成5×10-4M的探针母液。将CN-和常见的阴离子(如F-,Cl-,Br-,I-,HCO3 -,NO3 -,SCN-,CH3COO-,HSO3 -,ClO4 -)以及生物分子(如：glucose,Gly,Cys)溶解于水中，配制成1×10–3M的母液。
在5mL的容量瓶中加入0.2mL的探针母液和2.8mL DMF，再分别加入0.4mL的其他离子：CN-，F-，Cl-，Br-，I-，HCO3 -，NO3 -，SCN-，CH3COO-，HSO3 -，ClO4 -，glucose，Gly和Cys，最后用20mM的磷酸缓冲液定容至5mL。待容量瓶中的反应液摇匀静置5min，分别加入石英比色皿中，在荧光光谱仪上在297nm处激发，测量荧光发射光谱。
在5mL的容量瓶中加入0.2mL的探针母液和2.8mL DMF，分别加入0.4mL的其他离子：F-，Cl-，Br-，I-，HCO3 -，NO3 -，SCN-，CH3COO-，HSO3 -，ClO4 -，glucose，Gly和Cys，再逐一加入上述氰化钾母液0.4mL，最后用20mM的磷酸缓冲液定容至5mL。待容量瓶中的反应液摇匀静置5min，分别加入实验比色皿中，在荧光光谱仪上在297nm处激发，测量荧光发射光谱。
结果如图5所示，只有当氰化物加入时，荧光发生改变，并且这种变化在紫外灯下肉眼可见。此外，如图6所示，其他相关阴离子的存在对氰化物的检测没有干扰。这些检测结果证明了该荧光探针对氰化物的检测具有专一性。
实施例4(荧光探针对CN-的响应时间和pH的影响)
在室温下，配制氰化钾水溶液1×10–3M；用磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6,pH 7.4)的混合液在容量瓶中配制探针溶液(20μM)。取该探针溶液(3mL)至于石英比色皿中，并将比色皿放置于荧光光谱仪中。
开启光谱仪的扫描程序，分别记录509nm和466nm下的荧光强度。当到达50s时，用微量注射器将上述氰化钾水溶液(0.24mL)迅速注入比色皿中，继续记录样品随后的荧光发射强度。
实验结果如图7所示，当氰化钾加入时立刻产生荧光变化，并且体系的这种变化在1分钟之内可以达到稳定状态。探针分子对氰化物的快速反应有利于对其进行实时监测。
为检测探针分子在不同pH条件下对氰化物的响应，分别配制了不同pH(2.3，3.2，4.2，5.2，6.2，7.2，8.2，9.2，10.1)的磷酸缓冲液和DMF(v/v 4:6)的混合液。每一个不同pH溶液中加入20μM探针溶液，振荡后检测探针的荧光发射光谱，随后再分别加入80μM氰化钾水溶液，振荡后检测溶液的荧光发射光谱。
如图8所示的实验结果显示，探针分子的荧光强度比率值(I509/I466)在pH＝2.3-10.1范围内变化很小，表明探针在不同pH下是稳定存在的。当溶液的pH值大于6.26，随着氰化物的加入，荧光强度比率值(I509/I466)逐渐增强，这说明了探针在中性或者弱碱性条件下能有效识别氰化物。
实施例5(荧光探针对樱桃果肉提取物和樱桃果仁提取物中氰化物的检测)
室温下，将10g樱桃果肉和樱桃果仁，分别研碎后置于两个密封烧瓶中，室温下放置1小时使氰化物释放。往两个烧瓶中各加入10mL水和50mg氢氧化钠，混合均匀用磁力搅拌器大力搅拌5分钟，将所得的混合物在转速为10000r/min的离心机上离心10分钟。所得上层清液分别为待测试的樱桃果肉提取物和樱桃果仁提取物。
取上述的樱桃果肉提取物和樱桃果仁提取物(0.5mL)，分别加入到含有0.2mL探针母液(5×10-4M)和2.8mLDMF的5mL容量瓶中，加入pH＝7.4的磷酸缓冲液定容至5mL，振荡，放置5分钟后，在荧光光谱仪上通过297nm激发，测量荧光发射光谱。
结果如图9所示，樱桃果肉提取物加入到探针溶液时，荧光光谱没有发生改变，但是随着樱桃果仁提取物的加入，荧光光谱发生明显的变化。并且在365nm紫外灯照射下可以看到由蓝色变成绿色，说明了氰化物主要存在于樱桃果仁中。
实施例6(荧光探针对苦木薯根提取物中内源性氰化物的检测)
苦木薯根提取物的制备方法参照实施例5。
取上述苦木薯根提取物(50μL)加入到含有0.2mL探针溶液(5×10-4M)和2.8mLDMF的5mL容量瓶中，加入pH＝7.4的磷酸缓冲液定容至5mL，振荡，放置5分钟后，在荧光光谱仪上通过297nm激发，测量荧光发射光谱。
实验表明，加入苦木薯根提取物后，探针显示出明显的荧光光谱变化(图10)。因此，探针分子能定性检测苦木薯根提取物中的氰化物。
此外，运用标准加入法进行定量分析，氰化钾(母液5×10-3M)作为标准液。不同体积的氰化钾母液(0,5,10,15,20μL)直接加入到含有10μL苦木薯根提取物、0.2mL探针溶液(5×10-4M)和2.8mLDMF的5mL容量瓶中，加入pH＝7.4的磷酸缓冲液定容至5mL，振荡，放置5分钟后在荧光光谱仪上通过297nm激发，测量荧光发射光谱。通过分析计算得苦木薯根提取物中含有氰化物150.8mg/kg(图11)。结果说明，该荧光探针能定量检测食物样品中的氰化物。
实施例7(荧光探针对苦杏仁提取液中内源性氰化物的试纸检测)
苦杏仁提取物的制备方法参照实施例5。
室温下，将滤纸直接浸泡在含探针分子(0.1M)的DMF溶液中，5分钟后取出，自然晾干，制得试纸。上述得到的试纸分别进一步浸入5mL含有DMF和不同体积(0mL,0.1mL,0.2mL,0.6mL)苦杏仁提取液的混合液中，取出晾干后置于365nm的紫外灯下观察颜色变化。
如图12所示，a、b分别为探针试纸及探针试纸浸入5mL含氰化钾(100μM)的溶液中，c-f分别探针试纸浸入5mL含不同体积的苦杏仁提取液(0mL,0.1mL,0.2mL,0.6mL)的溶液中，在365nm紫外灯照射下，随着苦杏仁提取液体积的增加，试纸的颜色从蓝色逐渐变成绿色(c-f)。结果表明，含有探针分子的试纸能够检测苦杏仁提取液中不同浓度的内源性氰化物，并且这种检测手段不需要依赖精密的仪器，可以直接用于现场实时检测。
实施例8(荧光成像法检测发芽马铃薯中内源性氰化物)
室温下，将发芽的和未发芽的马铃薯清洗干净后切成0.5-1mm厚度的马铃薯切片。马铃薯切片置于含有探针分子(50μM)的DMF培养基中培养30分钟，然后用PBS洗3次。控制实验中，发芽的马铃薯切片预先用100μM AgNO3溶液处理30分钟，之后再加入50μM探针溶液培养30分钟，最后用激光共聚焦荧光显微镜进行荧光成像。
结果如图13所示，图13c、13f、13i为明场中马铃薯切片的植物组织图。未发芽的马铃薯切片在蓝色通道有较强的荧光(图13a)，说明探针能够渗透到马铃薯组织内。然而，在绿色通道(图13b)基本无荧光，表明未发芽的马铃薯中不含有氰化物。但是，发芽的马铃薯切片在绿色通道显示了强的荧光(图13e)，蓝色通道(图13d)几乎没有荧光，结果证明了氰化物只产生于发芽的马铃薯中。控制实验中，用氰化物的抑制剂AgNO3溶液处理过的马铃薯切片中，绿色荧光通道(图13h)只有很微弱的荧光，而蓝色荧光通道(图13g)的荧光比较强，说明AgNO3溶液处理后的马铃薯切片基本不含有氰化物，表明发芽马铃薯的荧光响应确实与氰化物有关。

Claims (5)

1.一种检测氰化物的荧光探针的用途，所述氰化物的荧光探针的结构式为
Figure FDA0002852290730000011
通过如下方法制备：将2-萘甲醛、丙二腈和氯化锌混合，在密闭条件下加热至融化状态，继续搅拌；反应结束后，冷却至室温，得到粗产物；将粗产物用乙醇水溶液洗涤后抽滤，将得到的滤饼重结晶，干燥，得到所述荧光探针；所述2-萘甲醛、丙二腈和氯化锌的摩尔比为1:1:1；所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为5％；所述重结晶使用的溶剂为二氯甲烷和石油醚；其特征在于，所述检测氰化物的荧光探针用于检测植物中的氰化物。
2.如权利要求1所述的一种检测氰化物的荧光探针的用途，其特征在于，所述检测氰化物的荧光探针用于检测樱桃果仁中的氰化物。
3.如权利要求1所述的一种检测氰化物的荧光探针的用途，其特征在于，所述检测氰化物的荧光探针用于检测苦木薯根中的氰化物。
4.如权利要求1所述的一种检测氰化物的荧光探针的用途，其特征在于，所述检测氰化物的荧光探针用于检测苦杏仁中的氰化物。
5.如权利要求1所述的一种检测氰化物的荧光探针的用途，其特征在于，所述检测氰化物的荧光探针用于检测发芽马铃薯中的氰化物。
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