CN109535147B - 一种快速响应的甲醛荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种快速响应的甲醛荧光探针及其制备方法和应用，其属于甲醛快速检测的技术领域。该探针采用香豆素母体，肼基为反应基团与甲醛反应，通过探针的荧光变化实现甲醛的快速检测。甲醛的响应时间低至220 s，在503 nm处荧光强度显著增强。该探针实现了水溶液中甲醛的快速和无损检测，甲醛的检测下限为5×10‑6 mol/L。该探针能抗半胱氨酸、谷胱甘肽、L‑精氨酸、柠檬酸钠、高半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、Ca2+、Na+、Mg2+、K+、过氧化氢的干扰，选择特异性好；该探针应用于食品和纺织品中甲醛含量的快速检测中，各项指标优异，完全达到快速检测要求。探针也可通过共聚焦荧光显微镜检测活细胞中的甲醛，并进行荧光成像。

Description

一种快速响应的甲醛荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种快速响应的甲醛荧光探针及其制备方法和应用，属于甲醛探针的制备技术领域。
背景技术
甲醛是一种致癌物容易产生诱变的污染物。环境中甲醛的主要污染来源是有机合成、化工、合成纤维、染料、木材加工及制漆等行业排放的废水、废气等。而食品中甲醛主要是作为防腐剂非法添加造成的。甲醛是原浆毒物质，能与蛋白质结合，高浓度吸入时出现呼吸道严重的刺激和水肿、眼刺激、头痛。皮肤直接接触甲醛可引起过敏性皮炎、色斑、坏死。高浓度甲醛还是一种基因毒性物质。实验动物在实验室高浓度吸入的情况下，可引起鼻咽肿瘤。长时间接触甲醛可使细胞中的蛋白质凝固变性，抑制一切细胞机能，会阻止人体内的细胞核蛋白的合成，破坏DNA链，抑制细胞分裂及抑制细胞核和细胞浆的合成，而蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此发明一种能快速、方便检测生理环境中的甲醛的方法具有重要的现实意义。
目前甲醛的测定方法有乙酰丙酮比色法、酚试剂比色法、有压电传感器、电化学传感器、石英晶体微天平、气相色谱法、液相色谱法、生物传感器，但是这些方法都具有繁琐的前处理、严苛的实验条件、大型测试仪器等限制，以及存在不能实时提供甲醛的测试信息、破坏检测样品等缺点。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等优点，可以对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测，从而实现实时观察信息的需求。但是目前报道的甲醛探针多数存在着反应时间过长、灵敏性差等问题，例如，论文Angew. Chem. 2016, 128, 3417–3420，Tang等人报道的以萘酰亚胺为荧光母体和肼为识别基团的甲醛荧光探针响应时间为30 min；论文AnalyticaChimica Acta 1033 (2018) 180e184，D. Zhang 等人报道的一例荧光探针对甲醛的响应时间为120 min；论文J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 10890−10893，Aaron Roth报道的一例荧光探针对甲醛的响应时间为180 min；论文J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 10886−10889，Thomas F等人报道的一例荧光探针对甲醛的响应时间为120 min；专利文献CN108219776 A、CN 108440411 A、CN 108148014 A、CN105924394 A、CN 106008342 A报道的甲醛荧光探针的响应时间也都超过30 min。由于甲醛分子间易发生聚合反应，而荧光探针对产生的多聚甲醛没有响应活性，荧光探针对甲醛响应时间过长，使得检测甲醛含量偏小，误差增大。食品具有储存时间短、易变质的特点，生产、加工、运输和销售要求在短时间内完成，需要响应快速的检测方法去监控。因此，发明快速响应、灵敏度高的甲醛荧光探针显得尤为重要。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种能快速检测甲醛的增强型荧光探针，简称探针Coun-FA；并进一步提供了探针Coun-FA的制备方法和应用；以快速、灵敏的检测甲醛含量。
本发明采用以下技术方案：
一种快速响应的甲醛荧光探针，该探针分子式为：C16H11N3O2S，具有如下所示结构：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明的甲醛荧光探针，对甲醛的响应时间为220s左右。所述响应时间为本发明的甲醛荧光探针作用于含有甲醛的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所需时间。
本发明的甲醛荧光探针，能抗半胱氨酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、柠檬酸钠、高半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、Ca2+、Na+、Mg2+、K+、H2O2的干扰，选择特异性好。
一种快速响应的甲醛荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：
1）将27.3mmol 2-羟基-4-硝基苯甲酸置于250mL烧瓶中，用四氢呋喃溶解，冰浴下逐滴加入50mL 1mol/L硼烷四氢呋喃络合物，滴加完之后将反应瓶转移至油浴锅，30℃下搅拌反应20h，反应完全后在冰浴条件下逐滴加入24mL 2N HCl溶液。将反应液倒入水中并用乙酸乙酯萃取，收集有机相，除去有机相中的水和乙酸乙酯，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物1，其中化合物1的结构式如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
。
2)将29.5mmol步骤1）所得化合物1溶于乙酸乙酯，加入236mmol MnO2，加热至回流，搅拌反应6h，冷却至室温，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物2，其中化合物2的结构式如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE006
。
3)将39.9mmol 邻氨基苯硫酚和39.9mmol氰乙酸乙酯混合，120℃下加热搅拌4h，冷却至室温，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物3，其中化合物3的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
4)将6mmol步骤2）所得化合物2溶于甲醇中，再加入7.2mmol步骤3）所得化合物3和100μL哌啶，加热至回流，搅拌反应4h，冷却至室温，抽滤、提纯即得到化合物4，其中化合物4的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
5)将1.5mmol步骤4）所得化合物4溶于乙醇中，再加入10% Pd/C和3mL 80%水合肼，在N2保护下，加热至回流，搅拌反应2h，趁热过滤除去Pd/C，然后除去反应液中的乙醇，得固体化合物，将固体化合物先用1% NaOH溶液碱洗，再用二氯甲烷打浆得到化合物5，其中化合物5的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
。
将0.44mmol步骤5）所得化合物5溶于浓盐酸中，冰浴盐下逐滴滴加1.1mmol亚硝酸钠，搅拌反应1h，重氮化反应得到化合物6，未经纯化直接进行下一步，再逐滴加入1.584mmol用浓盐酸溶解的氯化亚锡溶液，冰浴条件下继续搅拌1h，反应完全后，将反应液倒入水中，用NaOH水溶液调pH至中性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，除去有机相中的水和乙酸乙酯，最后用硅胶层析柱进行纯化即得到探针Coun-FA。其中化合物6的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
。
所述步骤1）中2-羟基-4-硝基苯甲酸与1mol/L硼烷四氢呋喃络合物的摩尔比为1:19，柱层析所用洗脱剂为体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯。
所述步骤2）中化合物1和MnO2的摩尔比为1:8，柱层析分离提纯先用乙酸乙酯作为洗脱剂除去MnO2，旋干乙酸乙酯得到固体化合物，再用洗脱剂体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯。
所述步骤3）中邻氨基苯硫酚与氰乙酸乙酯的摩尔比为1:1，柱层析所用洗脱剂为体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯。
所述步骤4）中化合物4的分离提纯方法为：待反应完毕后将冰水缓慢滴入反应液中，边滴加边搅拌，有大量固体析出，抽滤，除去甲醇和水，再用水淋洗2~3次，最后用甲醇打浆，烘干。
所述步骤6）中化合物5、亚硝酸钠与氯化亚锡的摩尔比为1:2.5:3.6，柱层析分离所用洗脱剂为体积比为40:1的二氯甲烷与甲醇。
上述的甲醛荧光探针的合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE018
Figure DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE024
Coun-FA即为探针。
本发明甲醛探针的应用包括检测水环境中的甲醛、细胞组织中的甲醛并进行荧光成像。
该荧光探针可以利用荧光光谱仪检测水环境中的甲醛；该荧光探针可以利用共聚焦荧光显微镜检测活细胞环境中的甲醛，并进行荧光成像。
上述应用，具体的，包括：
观察加入甲醛荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化，荧光激发波长为432nm。
或者，观察加入甲醛荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。
所述生物环境，可以是活细胞。
所述荧光光谱变化是指：荧光光谱中，503nm处的荧光峰值的变化；如果峰值增强，则说明测试液中含有甲醛。优选的，采用荧光光谱仪对荧光光谱测试。
所述荧光成像图的变化是指：从几乎观察不到荧光到观察到绿色荧光。优选的，采用共聚焦显微镜进行成像。
上述应用，具体的，包括以下步骤：
（1）将探针Coun-FA溶于DMSO，制成探针母液；
（2）将探针母液加入到待测液中；
用荧光光谱仪测试待测液中的荧光光谱，在503 nm处的荧光峰值的变化，如果峰值增强，则说明试液中含有甲醛；其中，荧光光谱仪激发波长为432 nm。
（3）将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜进行成像，使用488 nm的激发器进行，收集505~560nm范围的荧光；观察到细胞由几乎没有荧光变为有明显绿色荧光，则说明探针可以用于对细胞内的甲醛进行检测。
首先，水溶液中的甲醛可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中荧光光谱的变化情况判断溶液中的甲醛含量，从而定量检测；其检测下限为5×10 -6 mol/L。其次，通过检测水萃取溶液中甲醛含量，该探针应用于食品中甲醛含量的快速检测，加标回收率为77-87%，变异系数4-5%；应用于纺织品中甲醛含量的快速检测，与国标检测方法比较的差别率2.9-4.9%。各项检测指标完全达到快速检测要求。另外，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针Coun-FA和甲醛的活细胞进行细胞成像，通过观察绿色通道内荧光信号变化定量检测生物环境的甲醛。利用本发明的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的甲醛时，在220 s左右荧光强度达到最大；具有不损伤检测物的优势，实现了无损检测。
本发明的有益效果为该探针采用香豆素母体，肼基为反应基团与甲醛反应，母体上连接苯并噻唑扩大母体的共轭性，使反应加快产生荧光变化从而实现甲醛的快速检测。具体优点如下：（1）探针对甲醛响应极快，反应220 s左右就可以达到最大荧光强度；（2）本发明实现了水溶液中甲醛的快速和无损检测，甲醛的检测下限为5×10 -6 mol/L；（3）本发明实现了活细胞水平中甲醛浓度的检测；（4）该探针能抗半胱氨酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、柠檬酸钠、高半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、Ca2+、Na+、Mg2+、K+、H2O2的干扰，选择特异性好。
附图说明
图1是实施1化合物Coun-FA的1H NMR图谱。
图2是实施1化合物Coun-FA的13C NMR图谱。
图3是实施1化合物Coun-FA的TOF-MS谱图。
图4是实施例2中探针Coun-FA加入1mmol/L甲醛后，503 nm处荧光强度随时间变化的荧光光谱图。
图5是实施例3中探针Coun-FA加入不同浓度的甲醛后荧光谱图的变化情况：图中，从下至上，甲醛浓度依次为0、5、10、30、40、50、80、100、200、300、400、500 μmol/L。
图6是实施例4中探针Coun-FA加入不同浓度的甲醛后波长503 nm处荧光强度与不同浓度的甲醛线性工作曲线拟合：图中，甲醛浓度为0、5、10、30、40、50、80、100 μmol/L。
图7是实施例5中探针Coun-FA对不同干扰分析物的在503nm处荧光强度的柱状数据图。图中1，空白；2，甲醛；3，天门冬氨酸；4，丙氨酸；5，甲硫氨酸；6，苯丙氨酸；7，L-谷氨酸；8，高半胱氨酸；9，甘氨酸；10，谷胱甘肽；11，L-精氨酸；12，抗坏血酸钠；13，柠檬酸钠；14，Mg2+；15，Na+；16，K+，17，Ca2+；18，H2O2。
图8是实施例6中探针Coun-FA与甲醛响应在HepG2细胞中的荧光成像效果图。图中（a）（d）分别表示激发光为488 nm时0、100 μmol/L甲醛浓度孵化下细胞的双光子共聚焦荧光成像效果图；（b）（e）分别表示0、100 μmol/L甲醛浓度孵化下细胞的明场效果图；（c）（f）分别表示（a）和（b）、（d）和（e）的叠加效果图。
具体实施方式
实施例1
化合物1的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
将5g 2-羟基-4-硝基苯甲酸（分子式为：C7H5NO5）（27.3mmol）溶解于于四氢呋喃中，在冰浴条件下逐滴加入50mL 1mol/L硼烷四氢呋喃络合物，滴加完毕后转移至油浴锅，加热至30℃，搅拌反应20h，反应完毕。反应完毕后，将反应液冷却至室温，再在冰浴条件下逐滴加入24mL 2N HCl溶液，直至反应瓶中无气泡冒出。将反应液倒入水中并用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸镁干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂乙酸乙酯。用体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到4g黄色固体（产率为86.6%），所得固体为化合物1。
化合物2的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
将5g化合物1（分子式为：C7H5NO4）（30.65mmol）溶解于乙酸乙酯中，再加入20gMnO2（230mmol），将反应液加热至80℃左右，回流，搅拌反应6h，反应完毕。反应完毕后，将反应液冷却至室温，先用乙酸乙酯为洗脱剂，用硅胶层析柱第一次纯化除去MnO2,得到固体化合物，再以体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，用硅胶层析柱进行二次纯化，得到3.2g黄色固体（产率为64.7%），所得固体为化合物2。
化合物3的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE030
将5g邻氨基苯硫酚（分子式为：C6H7NS）（39.9mmol）和4.25mL 氰乙酸乙酯（分子式为：C4H5NO2）（39.9mmol）混合，将反应液加热至120℃，回流，搅拌反应4h，反应完毕。反应完毕后，将反应液冷却至室温，以体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到化合物3.9g黄色油状液体（产率为43.7%），所得液体为化合物3。
化合物4的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE032
将1g化合物2（分子式为：C7H5NO4）（5.9mmol）溶解于甲醇中，再加入1.6g化合物3（分子式为：C11H11NO2S）（7.2mmol）和100μL哌啶，将反应液加热至40℃，搅拌反应4h，反应完毕。反应完毕后，将反应液冷却至室温，将冰水缓慢滴入反应液中，边滴加边搅拌，有大量黄色固体析出，通过抽滤除去溶剂（甲醇）和水，再用水淋洗2~3次，最后用甲醇打浆，产品无需进一步过柱纯化，得到1.3g黄色固体（产率为81%），所的固体为化合物4。
化合物5的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
将488mg化合物4（分子式为：C16H8N2O4S）（1.5mmol）溶解于乙醇中，再加入3mL80%水合肼和50mg Pd/C，N2保护，将反应液加热至80℃，回流，搅拌反应2h，反应完毕。反应完毕后趁热过滤除去 Pd/C，通过旋转蒸发仪除去溶剂（乙醇）得到固体化合物，先加入少量的四氢呋喃溶解固体，再加入大量1% NaOH溶液进行碱洗并用乙酸乙酯萃取，最后用二氯甲烷打浆，产品无需进一步过柱纯化，得到190mg黄色固体（产率为42.8%），所得固体为化合物5。
探针Coun-FA的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
将130 mg化合物5（0.442 mmol），溶解于4 mL浓盐酸，冰浴盐，保证重氮化反应温度控制在-5~0℃，逐滴加入76 mg亚硝酸钠（1.1mmol），搅拌反应1 h，重氮化反应完毕，得到化合物6，未经处理直接进行下一步，将301.5 mg氯化亚锡酸性溶液（1.591 mmol，浓盐酸3mL溶解）逐滴加入反应液中，继续冰浴搅拌反应1h，保证还原反应温度控制在0℃左右，反应完毕。反应完毕后，将反应液倒入水中，用 NaOH水溶液调pH至中性，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸镁干燥后，通过旋转蒸发仪除去萃取剂乙酸乙酯得粗产品。以体积比为40:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到36mg红棕色固体（产率为26.3%），所得固体即为探针Coun-FA。1H NMR (400 MHz, DMSO)，δ（ppm）：8.99 (s, 1H),8.48 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.69 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.84 –6.67 (m, 2H), 4.55 (s, 2H)；13C NMR (101 MHz, DMSO)，δ（ppm）：161.77 , 160.80 ,158.01, 157.52, 152.59 , 143.20, 135.76, 131.78, 126.76, 124.92, 122.42,122.19 , 110.70, 110.48, 109.06, 95.02；TOF-MS（ESI positive）理论值[M+H]+310.34，实测值310.0647。
实施例2
探针Coun-FA与甲醛随时间变化的荧光变化
取实施例1制备的探针Coun-FA溶于DMSO中，制成浓度为1.0 mmol/L探针母液(探针Coun-FA的浓度为1.0 mmol/L)；将质量分数为37％的甲醛溶液加入去离子水，配制成甲醛浓度为100 mmol/L的甲醛母液，并稀释至所需浓度。从探针母液中取出30 μL加入到4 mL的离心管当中，加入743 μL浓度为4.0 mmol/L的甲醛溶液，再加入300 μL的PBS缓冲溶液(浓度100 mmol/L，pH = 7.4)和1927 μL去离子水，配制探针浓度为10 μmol/L，甲醛浓度为1.0 mmol/L，含1％DMSO的测试溶液。用432 nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图4可见，随着时间增加，503 nm处的荧光强度先逐渐升高后降低，220 s时荧光强度达到最大值。
实施例3
探针Coun-FA与不同当量甲醛反应的荧光光谱变化
从实施例2中探针母液中取出30 μL加入到4 mL的离心管当中，加入不同当量(0-50 eq)的甲醛母液(所述当量是指甲醛母液中甲醛的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用300 μL的PBS缓冲溶液(浓度100 mmol/L，pH = 7.4)和不同体积的去离子水稀释至3 mL，配制成探针浓度为10 μmol/L，含1％DMSO的测试溶液。反应220 s后用荧光光谱仪测试探针与不同当量甲醛反应液的荧光光谱变化(激发波长为432 nm)，荧光光谱变化情况如图5所示。由图5可见，随着加入甲醛的量逐渐增加，探针Coun-FA溶液在503 nm处的荧光峰值逐渐增强。当荧光强度达到最大值时，探针溶液荧光强度增强4倍。实验结果说明探针Coun-FA可以通过荧光光谱仪检测水溶液中的甲醛。
实施例4
探针Coun-FA与不同当量甲醛反应的线性研究
从实施例2中荧光探针母液中取出30 μL加入到4 mL的离心管当中，加入不同当量(1-10 eq)的甲醛母液(所述当量是指甲醛母液中甲醛的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用300 μL的PBS缓冲溶液(浓度100 mmol/L，pH = 7.4)和不同体积的去离子水稀释至3 mL，配制成探针浓度为10 μmol/L，含1％DMSO的测试溶液。反应220 s后用荧光光谱仪测试探针与不同当量甲醛反应液的荧光光谱变化(激发波长为432 nm) ,并将波长503 nm处的荧光强度与甲醛浓度之间做工作曲线，线性如图6所示。由图6可见，在503 nm处荧光强度与低浓度甲醛（0~100 µmol/L）有着严格的线性关系。线性方程为Y = 1.535 X+ 393.6，R2 = 0.9966，X代表甲醛浓度μmol/L，Y表示波长503 nm处的荧光强度。说明该探针可以用荧光强度来表征甲醛含量，可以用于定量检测细胞内低浓度甲醛。
实施例5
探针Coun-FA对不同干扰分析物的选择性研究
从实施例2中荧光探针母液中取出30 μL加入到4 mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物（干扰物浓度为1.0mmol/L；甲醛浓度为0.6mmol/L）：天门冬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、L-谷氨酸、高半胱氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、抗坏血酸钠、柠檬酸钠、Mg2+、Na+、K+、Ca2+、H2O2，用300 μL PBS缓冲溶液（浓度100 mmol/L，pH = 7.4）和不同体积的去离子水稀释至3 mL，配制成探针浓度为10 μmol/L，含1%DMSO的测试溶液，反应220 s后检测测试液的荧光光谱变化。由图7可以发现，相对于空白测试液，加入钾离子、钠离子、钙离子稍有增强，加入各种氨基酸的测试荧光强度没有明显的变化。然而，加入甲醛的测试液荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针Coun-FA对甲醛具有良好的选择性。
实施例6
探针Coun-FA在HepG2细胞中的荧光成像
从实施例2中荧光探针母液中取出10 μL加入到育有HepG2细胞的培养皿（含1 mL10%FBS培养基）中，探针浓度为10 μmol/L，孵育20 min，作为控制组；在实验组样品中加入100 μmol/L的甲醛，继续孵育10 min，作为实验组，随后用共聚焦显微镜对控制组和实验组分别进行荧光成像，使用488 nm的激发器进行激发，收集505~560 nm范围的荧光，结果如图8所示。在控制组的荧光成像中，几乎观察不到荧光；然而，在实验组中，可以观察到明显的绿色荧光，荧光显著增强。实验结果说明探针Coun-FA可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的甲醛，具有潜在的实际应用价值。
实施例7
探针Coun-FA检测食品中甲醛含量（加标）的研究性实验
样品加标处理方法：称取芹菜（一根）、小油菜（一叶）各 8 份，其中2份做空白对照组（不喷洒甲醛），6份作为实验组。实验组喷洒甲醛浓度为200 mg/L。取20μL甲醛水溶液均匀的喷洒在蔬菜表面，置于阴凉处，室温下待其挥发干（30 min 左右），用PBS缓冲溶液（浓度100 mmol/L，pH = 7.4）反复冲洗，超声20 min，静置，取上层清液，用微型过滤器过滤，作为甲醛萃取液。
荧光快速检测法：向比色皿（含甲醛荧光探针Coun-FA、参比探针等）中加入探针溶剂和甲醛萃取液，反应220 s后，放入angelay-405 A型便携式荧光快速检测仪，利用手机APP读取数据，计算加标回收率，结果如表1所示。由表1可见，甲醛加标回收率基本可以控制在80%~120%之间，但是也存在有个别实验组低于80%的回收率，这很有可能时操作不当或者甲醛同业过快的由蔬菜表面渗入蔬菜内部，导致过低的回收率。
表1 探针Coun-FA检测食品中甲醛含量的加标回收率（%）
Figure DEST_PATH_IMAGE038
实施例8
探针Coun-FA检测纺织品中游离甲醛含量的研究性实验
纺织品布样处理办法：按国标GB2912.1-2009，秤取样布1.00 g，剪碎，浸泡在100mL纯水中，40 oC下摇晃1.0 h，过滤，作为甲醛萃取液。
紫外可见吸收检测方法：按国标GB2912-82（树脂整理织物释放甲醛测定方法），乙酰丙酮试剂与待测液（或空白液）混合，在40 oC下水浴加热30 min，然后取出静置30 min；用721G分光光度计测其在415 nm波长处的吸光度，记录为A，空白液测试数据记录为A0，用A-A0数值在甲醛标准溶液工作曲线上查得对应的ppm值，即布样中甲醛的含量。
荧光快速检测法：向比色皿（含甲醛荧光探针Coun-FA、参比探针等）加入探针溶剂和甲醛萃取液，反应220s后，放入angelay-405 A型便携式荧光快速检测仪，利用手机APP读取数据。并与紫外可见吸收测得的数值进行对比，结果如表2所示。差别率=（紫外可见吸收方法的含量-荧光快速检测方法的含量）/紫外可见吸收方法的含量。由表2可见，两种方法对同一样品的测试结果相差不大，差别率都控制在5%以内，可以认为采用荧光探针Coun-FA测试纺织品中游离甲醛含量是可行的。
表2 Coun-FA检测纺织品中游离甲醛含量与国标法测试的对比数据（mg/kg）
Figure DEST_PATH_IMAGE040
。

Claims (9)

1.一种快速响应的甲醛荧光探针，其特征在于，该探针分子式为C16H11N3O2S，具体结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的一种快速响应的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
将27.3mmol 2-羟基-4-硝基苯甲酸置于250mL烧瓶中，用四氢呋喃溶解，冰浴下逐滴加入50mL 1mol/L硼烷四氢呋喃络合物，滴加完之后将反应瓶转移至油浴锅，30℃下搅拌反应20h，反应完全后在冰浴条件下逐滴加入24mL 2M HCl溶液；将反应液倒入水中并用乙酸乙酯萃取，收集有机相，除去有机相中的水和乙酸乙酯，最后用硅胶层析柱进行纯化得到化合物1，其中化合物1的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
将29.5mmol步骤1）所得化合物1溶于乙酸乙酯，加入236mmol MnO2，加热至回流，搅拌反应6h，冷却至室温，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物2，其中化合物2的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将39.9mmol 邻氨基苯硫酚和39.9mmol氰乙酸乙酯混合，120℃下加热搅拌4h，冷却至室温，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物3，其中化合物3的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
将6mmol步骤2）所得化合物2溶于甲醇中，再加入7.2mmol步骤3）所得化合物3和100μL哌啶，加热至回流，搅拌反应4h，冷却至室温，抽滤、提纯即得到化合物4，其中化合物4的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将1.5mmol步骤4）所得化合物4溶于乙醇中，再加入10% Pd/C和3mL 80%水合肼，在N2保护下，加热至回流，搅拌反应2h，趁热过滤除去Pd/C，然后除去反应液中的乙醇，得固体化合物，将固体化合物先用1% NaOH溶液碱洗，再用二氯甲烷打浆得到化合物5，其中化合物5的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
将0.44mmol步骤5）所得化合物5溶于浓盐酸中，冰浴盐下逐滴滴加1.1mmol亚硝酸钠，搅拌反应1h，重氮化反应得到化合物6；未经纯化直接进行下一步，再逐滴加入1.584mmol用浓盐酸溶解的氯化亚锡溶液，冰浴条件下继续搅拌1h，反应完全后，将反应液倒入水中，用NaOH水溶液调pH至中性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，除去有机相中的水和乙酸乙酯，最后用硅胶层析柱进行纯化即得到探针Coun-FA，其中化合物6的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
3.根据权利要求2所述的一种快速响应的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中2-羟基-4-硝基苯甲酸与1mol/L硼烷四氢呋喃络合物的摩尔比为1:1.8，柱层析所用洗脱剂为体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯。
4.根据权利要求2所述的一种快速响应的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中化合物1和MnO2的摩尔比为1:8，柱层析分离提纯先用乙酸乙酯作为洗脱剂除去MnO2，旋干乙酸乙酯得到固体化合物，再用洗脱剂体积比为3:1的石油醚与乙酸乙酯。
5.根据权利要求2所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中邻氨基苯硫酚与氰乙酸乙酯的摩尔比为1:1，柱层析所用洗脱剂为体积比为10:1的石油醚与乙酸乙酯。
6.根据权利要求2所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中化合物4的分离提纯方法为：待反应完毕后将冰水缓慢滴入反应液中，边滴加边搅拌，有大量固体析出，抽滤，除去甲醇和水，再用水淋洗2~3次，最后用甲醇打浆，烘干。
7.根据权利要求2所述的甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中化合物5、亚硝酸钠与氯化亚锡二水化合物的摩尔比为1:2.5:3.6，柱层析所用洗脱剂为体积比为40:1的二氯甲烷与甲醇。
8.根据权利要求1所述的一种快速响应的甲醛荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：该探针用于检测水环境中的甲醛，可间接快速检测食品和纺织中甲醛、以及细胞组织中的甲醛并进行荧光成像。
9.根据权利要求8所述的一种快速响应的甲醛荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于，在检测过程中该探针其能抗半胱氨酸、谷胱甘肽、L-精氨酸、柠檬酸钠、高半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、Ca2+、Na+、Mg2+、K+、H2O2的干扰。
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