CN106632212A - 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针 - Google Patents

一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针 Download PDF

Info

Publication number
CN106632212A
CN106632212A CN201611174916.4A CN201611174916A CN106632212A CN 106632212 A CN106632212 A CN 106632212A CN 201611174916 A CN201611174916 A CN 201611174916A CN 106632212 A CN106632212 A CN 106632212A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cysteine
fluorescence
fluorescence probe
formula
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611174916.4A
Other languages
English (en)
Inventor
林伟英
董宝利
王超
孔秀琪
宋学真
张楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201611174916.4A priority Critical patent/CN106632212A/zh
Publication of CN106632212A publication Critical patent/CN106632212A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Abstract

本发明公开了一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针，该荧光探针为罗丹明染料衍生物，其化学结构通式如式（）所示。本发明的荧光探针易于制备成本低廉，且具有高特异性，可快速检测细胞内半胱氨酸，检测过程基本不受其他组分的干扰，具有广阔的应用前景；。

Description

一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针
技术领域
本发明涉及一种用于检测细胞内半胱氨酸的新型荧光探针，属于分析化学技术领域。
背景技术
半胱氨酸（Cys）是一种生物体内常见的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基的氨基酸。半胱氨酸除主要分布在肝、脾、肾中外，还大量积聚在人体表面包括皮肤、粘膜等，在生物体内具有强化生物体自身的防卫能力、调整生物体的防御机构生理功能。例如具有抱合作用，实验证明半胱氨酸对甲醛、氯仿、铅、镉、氯甲汞、河豚毒等有毒物质具有一定的解毒作用，并可以有效地预防和治疗放射性伤害。半胱氨酸可在皮肤蛋白的角蛋白生成中维持重要的琉基酶的活性，维持皮肤的正常代谢，以及调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。此外，半胱氨酸可改善炎症、过敏引起的琉基酶活性降低，减缓炎症和过敏的皮肤症状，并具有防止生物体衰老的功能。但是，生物体内半胱氨酸浓度异常时，经常会导致造血功能下降、生长缓慢等。血浆中的半胱氨酸含量较高时，会损害内皮细胞和诱导血管损伤。因此，检测生物体内的半胱氨酸含量具有很重要的意义。
相比于传统的电化学方法，荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，并且对生物样品基本没有损伤，已广泛用于各种生物体内的小分子检测。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，能够实时快速检测生物体内半胱氨酸的荧光探针具有重要的意义。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种新型检测细胞内半胱氨酸的荧光探针。
本发明提供的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针为罗丹明衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（ ）所示，其中丙烯酸酯部分为半胱氨酸的响应位点：
式（）
本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物(1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到深红色的产物即为本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针。
式（Ⅱ）
本发明所述的荧光探针可应用于细胞内半胱氨酸的检测评价。该探针作为细胞内半胱氨酸的特异性探针，在半胱氨酸存在的环境下，可以将丙烯酸酯水解为羟基，生成具有高荧光发射能力的荧光物质，通过检测不同的荧光强度来测定细胞内的半胱氨酸。
具体测定方法为：室温条件下，配制5 μM荧光探针乙醇溶液，加入到具有不同浓度的半胱氨酸溶液系中，测定溶液荧光强度作为半胱氨酸浓度的评价指标。
本发明所述的荧光探针在半胱氨酸存在的条件下，罗丹明衍生物染料部分的丙烯酸酯水解为羟基，此时荧光探针可以发射罗丹明衍生物染料的红色荧光（峰值约为630nm）。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为580 nm，在590~700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。
荧光探针在生物成像应用研究的主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。在此基础上，应用本发明所述的荧光探针对活细胞内的半胱氨酸进行快速检测。
本发明的有益效果为：
本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针具有高特异性，在进行相应半胱氨酸检测过程中基本不受其他组分的干扰，可用于活细胞内半胱氨酸的实时测定，具有广阔的应用前景。
本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（590~700 nm），可以实现对细胞中的半胱氨酸快速准确检测的目的。
附图说明
图1是荧光探针的1H NMR图谱。
图2是荧光探针在不同浓度半胱氨酸条件下的荧光光谱。
图3是荧光探针与半胱氨酸浓度的线性关系数据。
图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。
图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。
A图：只加10 μM探针的细胞明场照片；B图：只加10 μM探针的细胞红色通道荧光照片；C图：A图和B图的叠加照片；D图：加入10 μM探针和50 μM半胱氨酸的细胞明场照片；E图：加入10 μM探针和1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）的细胞红色通道荧光照片；F图：D图和E图的叠加照片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。
实施例1
本发明所述检测癌细胞内半胱氨酸的荧光探针的制备
将式（Ⅱ）所示的化合物（1 mmol）、(1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇 = 15:1 ) 纯化，得到深红色产物，即为本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针，产率43%。
上述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针的1H NMR图谱见图1。
实施例2
本发明所述荧光探针在不同半胱氨酸浓度下的荧光光谱
采用半胱氨酸在水溶液中供应半胱氨酸。预先准备10份5mL的 5 μM探针缓冲溶液，含5%甲醇，所加入的半胱氨酸浓度为0到150 μM。然后进行荧光检测（λEx = 580 nm）；计算各体系中荧光强度；通过分析630 nm处的荧光强度与半胱氨酸浓度的关系，评估该探针对半胱氨酸的响应性能（见图2和图3）。图2表明，随着半胱氨酸浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强。图3表明，当硫化钠浓度在40~200 μM范围内，溶液的荧光强度和半胱氨酸的浓度呈较好的线性关系，可采用公式Y = 23.7 * X – 95.1表示，其中Y为630 nm出的荧光强度，X为半胱氨酸的浓度。
实施例3
荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱
预先准备10份5mL的 5 μM探针缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为200 μM的Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、Cys、GSH、NaNO2、VC等小分子的PBS溶液。然后进行荧光检测（λEx= 580 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。从图中看出，当然探针溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、VC等小分子时，只有半胱氨酸可以导致溶液产生显著的荧光，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对半胱氨酸有响应，而基本不受其他小分子的干扰。
实施例4
荧光探针在活细胞中的成像应用
将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5% CO2和20% O2的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针(10 μM)注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。加入1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）溶液，继续培养30 min。之后用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，进行荧光成像。
结果见图5。从A、B和C图中看出，只加入探针时，细胞有红色荧光；从D、E和F图中看出， 1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）之后，再加入10 μM探针，细胞无明显的荧光产生，这表示该探针可用于检测癌细胞中的半胱氨酸。

Claims (2)

1.一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示：
式（）。
2.根据权利要求1所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，由以下方法制备而成：将式（Ⅱ）所示的化合物 1mmol、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺2mmol、1-羟基苯并三氮唑1.5mmol、三乙胺2.2mmol和N,N-二甲基甲酰胺 5mL，加入到50mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干，将所得固体进行柱层析纯化，得到深红色的产物即为所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针；
式（Ⅱ）。
CN201611174916.4A 2016-12-19 2016-12-19 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针 Pending CN106632212A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611174916.4A CN106632212A (zh) 2016-12-19 2016-12-19 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611174916.4A CN106632212A (zh) 2016-12-19 2016-12-19 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106632212A true CN106632212A (zh) 2017-05-10

Family

ID=58823825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611174916.4A Pending CN106632212A (zh) 2016-12-19 2016-12-19 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106632212A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107098881A (zh) * 2017-04-05 2017-08-29 济南大学 一种超灵敏高选择性次氯酸比色荧光探针
CN109232505A (zh) * 2018-10-12 2019-01-18 陕西工业职业技术学院 一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用
CN109336915A (zh) * 2018-10-11 2019-02-15 贺州学院 一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法和应用
CN110156695A (zh) * 2019-05-16 2019-08-23 济南大学 一种检测半胱氨酸的荧光探针及其应用
CN110563689A (zh) * 2019-08-27 2019-12-13 山西大学 一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103755672A (zh) * 2014-01-26 2014-04-30 大连理工常熟研究院有限公司 一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用
CN103773361A (zh) * 2014-02-25 2014-05-07 山东大学 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用
CN104356681A (zh) * 2014-11-21 2015-02-18 天津理工大学 一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用
CN105001853A (zh) * 2015-06-05 2015-10-28 天津理工大学 一种罗丹明类染料荧光分子探针及其制备方法和应用
WO2016098889A1 (ja) * 2014-12-18 2016-06-23 和光純薬工業株式会社 消光剤
CN106220650A (zh) * 2016-05-13 2016-12-14 南京理工大学 一种基于罗丹明B的Cys荧光传感器、制备方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103755672A (zh) * 2014-01-26 2014-04-30 大连理工常熟研究院有限公司 一种用于识别半胱氨酸的特异性荧光探针及其应用
CN103773361A (zh) * 2014-02-25 2014-05-07 山东大学 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用
CN104356681A (zh) * 2014-11-21 2015-02-18 天津理工大学 一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用
WO2016098889A1 (ja) * 2014-12-18 2016-06-23 和光純薬工業株式会社 消光剤
CN105001853A (zh) * 2015-06-05 2015-10-28 天津理工大学 一种罗丹明类染料荧光分子探针及其制备方法和应用
CN106220650A (zh) * 2016-05-13 2016-12-14 南京理工大学 一种基于罗丹明B的Cys荧光传感器、制备方法及应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107098881A (zh) * 2017-04-05 2017-08-29 济南大学 一种超灵敏高选择性次氯酸比色荧光探针
CN109336915A (zh) * 2018-10-11 2019-02-15 贺州学院 一种半胱氨酸荧光探针及其制备方法和应用
CN109232505A (zh) * 2018-10-12 2019-01-18 陕西工业职业技术学院 一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用
CN110156695A (zh) * 2019-05-16 2019-08-23 济南大学 一种检测半胱氨酸的荧光探针及其应用
CN110563689A (zh) * 2019-08-27 2019-12-13 山西大学 一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用
CN110563689B (zh) * 2019-08-27 2022-12-30 山西大学 一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. A colorimetric and ratiometric fluorescent probe for hydrazine and its application in living cells with low dark toxicity
CN106632212A (zh) 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针
Zhou et al. A naphthalimide-indole fused chromophore-based fluorescent probe for instantaneous detection of thiophenol with a red emission and a large Stokes shift
CN105524612B (zh) 一种异佛尔酮类荧光探针及其制备与应用
CN108129459B (zh) 一种用于检测二氧化硫的新型荧光探针及其应用
Li et al. A near-infrared fluorescent probe for Cu2+ in living cells based on coordination effect
CN106083888B (zh) 一种检测癌细胞内硫化氢的荧光探针
CN108982447B (zh) 一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用
Peng et al. A novel fluorescent probe for selective detection of hydrogen sulfide in living cells
CN105712964B (zh) 一种基于香豆酰肼的硫醇荧光探针的制备方法及应用
Liu et al. A phthalimide-based fluorescent probe for thiol detection with a large Stokes shift
CN112939957B (zh) 一种苯并吲哚衍生物In-XY1及其合成方法和应用
CN109535147A (zh) 一种快速响应的甲醛荧光探针及其制备方法和应用
CN109651249A (zh) 一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用
CN109867611A (zh) 一种用于红酒和活体内硫化氢检测的水溶性双光子硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
Yang et al. Fluorescent probe for Cu 2+ and the secondary application of the resultant complex to detect cysteine
CN108398409B (zh) 一种荧光比率检测次氯酸根的方法
CN111285833A (zh) 一种检测onoo-的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用
Zhu et al. A two-photon off-on fluorescence probe for imaging thiols in live cells and tissues
Xu et al. A fast-responsive two-photon fluorescent turn-on probe for nitroreductase and its bioimaging application in living tissues
Liu et al. Oxidized-morpholine dressing ratiometric fluorescent probe for specifically visualizing the intracellular glutathione
CN107286151B (zh) 一种基于咔唑的双光子荧光探针及其制备方法和用途
Pan et al. Dual-response near-infrared fluorescent probe for detecting cyanide and mitochondrial viscosity and its application in bioimaging
CN110092773A (zh) 一种氧杂蒽类衍生物及其制备方法和应用
CN106518855A (zh) 一种以半川菁及黄酮醇为荧光团的二氧化硫衍生物比例荧光探针及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170510