CN109232505A - 一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用，荧光探针的结构式为：该荧光探针通过半胱氨酸夺取希夫碱络合物中的铜离子，希夫碱结构容易发生水解反应，从而引起化学结构和光谱性质的变化，就能够高选择性定量检测半胱氨酸，该荧光探针与Cu2+的络合形成的a‑Cu(II)络合物可以排除其他硫醇如高半胱氨酸、谷胱甘肽的干扰专一性检测半胱氨酸，对半胱氨酸有极强的选择性，抗干扰性能强，且该探针a‑Cu(II)络合物还具有良好的生物相容性，在活体细胞中仍具有检测Cys的潜力，可以在生物体内快速、高选择性地检测半胱氨酸；其合成方法简单，易操作实施。

Description

一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用。
背景技术
硫醇是生物体内重要的活性硫物种之一。细胞内的常见硫醇化合物包括半胱氨酸(Cys)，高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，它们具有重要的生物学意义。其中，半胱氨酸是构成生命体各个组织的重要分子，是细胞生长中不可或缺的重要物质。其缺乏症包括发育迟缓、毛发枯黄、水肿、嗜睡、肝损伤、肌无力、体重下降、皮肤病变和体质变差等。由于半胱氨酸在生命体中有重要作用，研究对其高选择性、高灵敏度、快速的检测方法就显得尤为重要。
荧光探针具有高选择性、高灵敏度、快速响应、易于制备等优点，不仅可以用于环境检测，也可以用于体内检测，关于荧光探针的报导已成为化学探针设计中的热点。文献报导的硫醇类荧光探针大多是基于硫醇催化的迈克尔加成，醛基环化，二硫化物和磺胺类化合物的裂解反应和探针-Cu(II)络合物的脱金属反应进行的。其中，以金属络合物检测小分子是构建小分子荧光探针的一种重要途径。金属络合物作为一个整体，既是分子接收器也是信号报告器。小分子对金属具有极强的络合作用，会从络合物中夺出金属并与其组成小分子-金属络合物，引起光谱信号的改变。这种方法克服了小分子的水合作用，使检测可以在水溶液体系中进行。
目前，已有通过硫醇夺取络合物中的金属引起的荧光增强作为一个组合系统用于检测硫醇，但是普遍选择性不佳，且不能定量测量硫醇。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用，该荧光探针通过半胱氨酸夺取希夫碱络合物中的铜离子，希夫碱结构容易发生水解反应，从而引起化学结构和光谱性质的变化，就能够高选择性定量检测半胱氨酸，该荧光探针与Cu2+的络合形成的a-Cu(II)络合物可以排除其他硫醇如高半胱氨酸、谷胱甘肽的干扰专一性检测半胱氨酸，对半胱氨酸有极强的选择性，抗干扰性能强，且该探针a-Cu(II)络合物还具有良好的生物相容性，在活体细胞中仍具有检测Cys的潜力，可以在生物体内快速、高选择性地检测半胱氨酸；其合成方法简单，易操作实施。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种快速检测半胱氨酸的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：
优选的，所述荧光探针包括以下原料：间二乙胺基苯酚、邻苯二甲酸酐、甲苯、2，4-二羟基苯甲醛、甲磺酸、水、邻氨基苯酚和乙醇。
优选的，所述荧光探针包括以下重量份的原料：间二乙胺基苯酚8-8.5份、邻苯二甲酸酐9-10份、甲苯30-40份、2，4-二羟基苯甲醛0.060-0.072份、甲磺酸3-7份、水15-25份、邻氨基苯酚0.05-0.06份和乙醇8-12份。
进一步优选的，所述荧光探针包括以下重量份的原料：间二乙胺基苯酚8.25份、邻苯二甲酸酐9.5份、甲苯35份、2，4-二羟基苯甲醛0.066份、甲磺酸5份、水20份、邻氨基苯酚0.0546份和乙醇10份。
(二)一种快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
步骤1，将间二乙胺基苯酚、邻苯二甲酸酐、甲苯混合，升温反应，得紫红色固体；对所述紫红色固体进行抽滤、洗涤、重结晶，得淡粉色固体化合物1；
步骤2，将所述淡粉色固体化合物1与2，4-二羟基苯甲醛、甲磺酸混合，反应，冷却至室温，得冷却液；向所述冷却液中加入水，并调节pH至7.5-8.5，得紫红色固体；对所述紫红色固体进行抽滤、纯化，得淡粉色固体化合物2；
步骤3，将所述淡粉色固体化合物2与邻氨基苯酚、乙醇混合，回流反应，冷却至室温，抽滤、纯化，得深紫色固体荧光探针。
优选的，步骤1中，所述升温反应为先升温至80℃反应10h，再升温至90℃反应5h，接着升温至100℃反应2h，最后升温至110℃反应1h。
优选的，步骤1中，所述抽滤的压力为33-66KPa，抽滤的时间为3-5min。
优选的，步骤1中，所述洗涤采用甲醇进行洗涤。
优选的，步骤1中，所述重结晶采用正丁醇进行重结晶。
优选的，步骤2中，所述反应的温度为85-95℃，反应的时间为0.8-1.2h。
优选的，步骤2中，所述水的温度为0℃。
优选的，步骤2中，所述调节pH采用质量分数为25-28％的氨水调节。
优选的，步骤2中，所述抽滤的压力为33-66KPa，抽滤的时间为3-5min。
优选的，步骤2中，所述纯化采用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂进行柱层析洗脱纯化。
优选的，步骤3中，所述回流反应的温度为80-85℃，回流反应的时间为4.5-5.5h。
优选的，步骤3中，所述抽滤的压力为33-66KPa，抽滤的时间为3-5min。
优选的，步骤3中，所述纯化采用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂进行柱层析洗脱纯化。
(三)一种快速检测半胱氨酸的荧光探针在定量检测半胱氨酸中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过半胱氨酸夺取希夫碱络合物中的铜离子，希夫碱结构容易发生水解反应，从而引起化学结构和光谱性质的变化，就能够高选择性定量检测半胱氨酸。荧光探针a以淡粉色固体化合物2为荧光团，以希夫碱为识别基团。淡粉色固体化合物2是罗丹明与荧光素杂化荧光团，兼具二者的特点，能够改善原有荧光团的性质使其发射波长位于可见光区，淡粉色固体化合物2再与邻氨基苯酚发生加成-消去反应生成希夫碱结构的荧光探针a。荧光探针a提供希夫碱氮原子和酚羟基与铜离子络合，引起荧光猝灭并锁定希夫碱结构防止水解反应的进行。而半胱氨酸可以自a-Cu(II)络合物中将铜离子夺出，恢复探针原有的希夫碱结构，希夫碱易于发生水解反应，水解生成荧光团2，就达到了检测半胱氨酸的目的。
(2)本发明还通过1HNMR、高分辨质谱、水解速率曲线和Cu2+引起的荧光猝灭图谱证明预测的荧光探针a脱络合-水解机理的正确性。
(3)本发明通过设计对比化合物b，结果表明，没有了酚羟基，即使加入铜离子和其他金属离子，化合物b也不会发生荧光猝灭，并在水溶液中水解为半罗丹明半荧光素荧光团，荧光增强，证明酚羟基在络合铜离子中的具有重要作用。
(4)本发明确定了探针a-Cu(II)络合物检测Cys的最佳pH为7.4，能在15min内快速、实时检测Cys，且可以排除其他硫醇如高半胱氨酸、谷胱甘肽的干扰专一性检测半胱氨酸，对半胱氨酸有极强的选择性，抗干扰性能强。而且该探针a-Cu(II)络合物还具有良好的生物相容性，在活体细胞中仍具有检测Cys的潜力，可以在生物体内快速、高选择性地检测半胱氨酸。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为核磁共振图谱；其中，图1-1为淡粉色固体化合物1的氢谱图；图1-2为淡粉色固体化合物2的氢谱图；图1-3为淡粉色固体化合物2的碳谱图；图1-4为淡粉色固体化合物2的电喷雾离子化-高分辨质谱图；图1-5为淡粉色固体化合物2的傅立叶变换红外光谱图；图1-6为荧光探针a的氢谱图；图1-7为荧光探针a的碳谱图；图1-8为荧光探针a的电喷雾离子化-高分辨质谱图；图1-9为荧光探针a的傅立叶变换红外光谱图；图1-10为化合物b的氢谱图；图1-11为化合物b的碳谱图；图1-12为化合物b的电喷雾离子化-高分辨质谱图；图1-13为化合物b的傅立叶变换红外光谱图；
图2为荧光探针a的设计及识别机理；
图3为荧光探针a的核磁滴定图；
图4为a-Cu2+和水解产物的HRMS图谱；
图5为荧光探针a和化合物b的水解速率曲线；其中，图(a)为荧光探针a的水解速率曲线，横坐标为时间，单位min；纵坐标为荧光强度；图(b)为化合物b的水解速率曲线，横坐标为时间，单位min；纵坐标为荧光强度；
图6为荧光探针a对不同浓度Cu2+的谱图；其中，图(a)为荧光探针a对不同浓度Cu2+的荧光谱图，[Cu2+]分别是0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.4μM，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为荧光强度；图(b)为荧光探针a对不同浓度Cu2+的紫外图谱，[Cu2 +]分别是0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0μM，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度；
图7为pH对Cys检测的影响曲线，其中，横坐标为pH，纵坐标为560nm处的荧光强度；其中，检测时a-Cu(II)络合物的浓度为2μM，半胱氨酸的浓度为300μM；
图8为时间对Cys检测的影响曲线，其中，检测时a-Cu(II)络合物的浓度为2μM；半胱氨酸(Cys)的浓度为三角点为300μM，圆点为100μM，方点为40μM；
图9为浓度为2μM的a-Cu(II)络合物对不同种类氨基酸的选择性光谱图和抗干扰性柱状图；其中，图(a)为a-Cu(II)络合物对不同种类氨基酸(500μM)的选择性光谱图，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为荧光强度；图(b)为a-Cu(II)络合物对不同种类氨基酸(500μM)的抗干扰性柱状图，其中，实心为探针a-Cu(II)+不同氨基酸，斜线为探针a-Cu(II)+不同氨基酸+Cys，横坐标为不同的氨基酸，分别为1:空白/Cys,2:Gly,3:Glu,4:Asp,5:Met,6:Tyr,7:Ala,8:Leu,9:Ile,10:Thr,11:Ser,12:Pro,13:Arg,14:His,15:Trp,16:Lys,17:Val,18:Phe,19:Hcy,20:GSH，纵坐标为560nm处的荧光强度；
图10为浓度为2μM的探针a-Cu(II)络合物对不同浓度Cys的谱图；其中，图(a)为a-Cu(II)络合物对不同浓度Cys的荧光谱图，[Cys]自下至上分别是0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,150,180,200,250,300,350,400,450,500μM，横坐标为为波长，单位为nm，纵坐标为荧光高度；图(b)为a-Cu(II)络合物对不同浓度Cys的紫外谱图，[Cys]自下至上分别是0,20,40,60,80,100,250,500μM，横坐标为为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度；
图11为探针a-Cu(II)络合物定量检测半胱氨酸的曲线图；其中，横坐标为半胱氨酸的浓度，单位为μM；纵坐标为560nm处的荧光强度；
图12为探针a-Cu(II)络合物对MCF-7细胞毒性测试图，其中，横坐标为探针浓度，单位为μM；纵坐标为细胞存活率，单位为％；
图13为探针a-Cu(II)络合物的细胞共聚焦图像，其中，图(a)为明场；图(b)为用a-Cu(II)(20μM)和NEM(1mM)培养的细胞荧光图像(λex＝488nm)；图(c)为用a-Cu(II)(20μM)培养的细胞荧光图像(λex＝488nm)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
一种快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
步骤1，合成淡粉色固体化合物1
向100mL圆底烧瓶中加入间二乙胺基苯酚8.25g(0.05mol)、邻苯二甲酸酐9.5g(0.064mol)、甲苯35mL，先升温至80℃反应10h，再升温至90℃反应5h，接着升温至100℃反应2h，最后升温至110℃反应1h，析出紫红色固体，接着在室温、压力为50KPa条件下抽滤4min，并采用分析纯甲醇洗涤滤饼，最后采用分析纯正丁醇重结晶，得到淡粉色固体化合物1，产量为12.3g，产率为79％，M.P.200-202℃。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δppm1.083(t，J＝12.0Hz，6H)，3.369(q，J＝12.0Hz，4H)，6.078(s，1H)，6.170(d，J＝8.0Hz，1H)，6.786(d，J＝8.0Hz，1H)，7.368(d，J＝8.0Hz，1H)，7.620(m，2H)，7.967(d，J＝8.0Hz，1H)，12.592(s，1H)，13.108(s，1H)；具体图谱如图1-1所示。
步骤2，合成淡粉色固体化合物2
向25mL圆底烧瓶中加入0.15g(0.48mmol)的淡粉色固体化合物1、2，4-二羟基苯甲醛0.066g(0.48mmol)和甲磺酸5mL，保持90℃反应1h，将反应液冷却至室温，倾入20mL0℃的冰水中，用质量分数为26.5％的氨水调节pH至8，析出大量紫红色固体，在室温、压力为50KPa条件下抽滤4min并收集滤饼，经过柱层析纯化(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝300:1，v:v)，得到淡粉色固体化合物2，产量为0.023g，产率为31％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δppm1.18(t，J＝16.8Hz，6H)，3.37(q，J＝16.8Hz，4H)，6.39(d，J＝8.4Hz，1H)，6.48(s，1H)，6.57(d，J＝8.8Hz，1H)，6.80(s，1H)，7.01(s，1H)，7.22(d，J＝7.4Hz，1H)，7.68(m，2H)，8.05(d，J＝7.2Hz，1H)，9.57(s，1H)，11.19(s，1H)，如图谱1-2所示；13CNMR(CDCl3，100MHz)：δppm12.38，44.45，82.99，97.67，104.37，108.86，113.24，117.80，123.86，125.07，125.92，126.94，128.72，129.83，135.07，135.49，149.71，152.19，152.47，157.83，162.91，169.28，194.62，如图谱1-3所示；ESI-HRMS：[M+1]+m/z416.1483，calcdforC25H22NO5416.1492，如图谱1-4所示；FT-IR(KBr，cm-1)：3672，1750，1625，1521，1405，875，801，697，如图谱1-5所示。
步骤3，合成深紫色固体荧光探针a
向25mL圆底烧瓶中加入0.1371g(0.33mmol)淡粉色固体化合物2，邻氨基苯酚0.0546g(0.5mmol)和乙醇10mL，在温度为82.5℃条件下回流反应5h，TLC监控反应，冷却至室温后在压力为50KPa条件下抽滤4min，得紫红色固体，硅胶柱提纯(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝50:1，v:v)得到深紫色固体荧光探针a，产量为0.1344g，产率为81％；其中，具体的深紫色固体荧光探针a的合成工艺如式(1)所示。1HNMR(DMSO-d6，400MHz):δppm1.10(t，J＝8.0Hz，6H)，1.25(q，J＝8.0Hz，4H)，5.76(s，1H)，6.47(s，2H)，6.79(s，2H)，6.93(d，J＝8.0Hz，1H)，7.12(m，2H)，7.33(m，2H)，7.77(m，2H)，8.01(d，J＝8.0Hz，1H)，8.87(s，1H)，9.57(s，1H)，11.19(s，1H)，如图谱1-6所示；13CNMR(DMSO-d6，100MHz)：δppm12.93，44.47，96.79，103.73，105.00，109.17，117.26，119.48，124.60，125.12，126.88，128.03，128.60，129.06，129.76，130.29，133.59，134.27，134.70，136.07，140.50，149.77，151.57，152.42，153.91，154.75，160.67，169.27，199.07，如图谱1-7所示；ESI-HRMS：[M+1]+m/z507.1908，calcdforC31H27N2O5507.1914，如图谱1-8所示；FT-IR(KBr，cm-1):3417，3060，2971，2919，2895，1760，1691，1585，1467，1344，1137，1076，931，879，825，752，如图谱1-9所示。
同时，为了证明酚羟基在络合铜离子中的重要作用，还设计了对比化合物粉红色固体b，粉红色固体化合物b的具体合成工艺如式(1)所示，包括以下步骤：
步骤1-2：同深紫色固体荧光探针a合成工艺中的步骤1-2；
步骤3：向25mL圆底烧瓶中加入化合物2 0.1371g(0.33mmol)，苯胺0.0316g(0.5mmol)，乙醇10mL，回流反应5h，TLC监控反应，冷却后抽滤得到粉红色固体化合物b，产量为0.1194g，产率为75％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δppm1.18(t，J＝8.0Hz，6H)，3.37(q，J＝8.0Hz，4H)，6.38(s，1H)，6.48(s，1H)，6.57(d，J＝12.0Hz，1H)，6.84(d，J＝8.0Hz，2H)，7.25(m，4H)，7.37(m，2H)，7.65(m，2H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，8.37(s，1H)，13.66(s，1H)，如图谱1-10所示；13CNMR(CDCl3，100MHz)：δppm12.25，44.14，83.80，97.82，104.16，104.93，108.62，111.80，116.44，121.09，121.40，124.03，124.96，126.93，127.18，128.82，129.19，129.36，129.61，133.09，134.93，147.97，149.70，152.62，153.08，155.23，161.28，162.85，169.55，如图谱1-11所示；ESI-HRMS：[M+1]+m/z491.1943，calcdforC31H27N2O4491.1965，如图谱1-12所示；FT-IR(KBr，cm-1)：3401，3060，2964，2908，2856，1754，1623，1560，1494，1434，1334，1008，966，871，808，761，696，如图谱1-13所示。
实施例2
一种快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
步骤1，合成淡粉色固体化合物1
向100mL圆底烧瓶中加入间二乙胺基苯酚8.0g、邻苯二甲酸酐9.0g、甲苯30mL，先升温至80℃反应10h，再升温至90℃反应5h，接着升温至100℃反应2h，最后升温至110℃反应1h，析出紫红色固体，接着在室温、压力为33KPa条件下抽滤5min，并采用分析纯甲醇洗涤滤饼，最后采用分析纯正丁醇重结晶，得到淡粉色固体化合物1。
步骤2，合成淡粉色固体化合物2
向25mL圆底烧瓶中加入0.15g的淡粉色固体化合物1、2，4-二羟基苯甲醛0.060g和甲磺酸3mL，保持85℃反应1.2h，将反应液冷却至室温，倾入25mL0℃的冰水中，用质量分数为28％的氨水调节pH至8.5，析出大量紫红色固体，在室温、压力为33KPa条件下抽滤5min并收集滤饼，经过柱层析纯化(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝300:1，v:v)，得到淡粉色固体化合物2。
步骤3，合成深紫色固体荧光探针a
向25mL圆底烧瓶中加入0.1371g淡粉色固体化合物2，邻氨基苯酚0.06g和乙醇8mL，在温度为85℃条件下回流反应4.5h，TLC监控反应，冷却至室温后在压力为33KPa条件下抽滤5min，得紫红色固体，硅胶柱提纯(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝50:1，v:v)得到深紫色固体荧光探针a。
实施例3
一种快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
步骤1，合成淡粉色固体化合物1
向100mL圆底烧瓶中加入间二乙胺基苯酚8.5g、邻苯二甲酸酐10.0g、甲苯40mL，先升温至80℃反应10h，再升温至90℃反应5h，接着升温至100℃反应2h，最后升温至110℃反应1h，析出紫红色固体，接着在室温、压力为66KPa条件下抽滤3min，并采用分析纯甲醇洗涤滤饼，最后采用分析纯正丁醇重结晶，得到淡粉色固体化合物1。
步骤2，合成淡粉色固体化合物2
向25mL圆底烧瓶中加入0.15g的淡粉色固体化合物1、2，4-二羟基苯甲醛0.072g和甲磺酸7mL，保持95℃反应0.8h，将反应液冷却至室温，倾入15mL0℃的冰水中，用质量分数为25％的氨水调节pH至7.5，析出大量紫红色固体，在室温、压力为66KPa条件下抽滤3min并收集滤饼，经过柱层析纯化(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝300:1，v:v)，得到淡粉色固体化合物2。
步骤3，合成深紫色固体荧光探针a
向25mL圆底烧瓶中加入0.1371g淡粉色固体化合物2，邻氨基苯酚0.06g和乙醇12mL，在温度为80℃条件下回流反应5.5h，TLC监控反应，冷却至室温后在压力为66KPa条件下抽滤3min，得紫红色固体，硅胶柱提纯(洗脱剂:CH2Cl2:CH3OH＝50:1，v:v)得到深紫色固体荧光探针a。
本发明的深紫色固体荧光探针用于检测半胱氨酸的检测方法及其设计与识别机理为：
1、检测方法
1)MCF-7乳腺癌细胞的培养
选用融合度90％以上的MCF-7细胞，使用0.25％的胰蛋白酶酶解，转移酶解分散的细胞到96孔板中，每孔约5000细胞密度，37℃、5％CO2环境中培养过夜。接下来，向96孔板中加入20μM a-Cu(II)，同样的条件下，再培养24h。然后，滴加10μLMTT(1mg/ml)至每一孔，再培养4h。最后，向其中加入150μLDMSO。使用酶标仪在488nm光照下，进行分析。
2)分析实验方法
分别称取0.0253g荧光探针a和0.0246g化合物b，以二甲基亚砜(DMSO)溶解乙醇定容于50mL容量瓶中配成1×10-3M的储备溶液。称取0.5071g荧光探针a、0.0150g CuCl2，加入乙醇10mL，室温下搅拌10min，收集生成的深紫色固体，即为a-Cu(II)络合物，称取a-Cu(II)络合物0.2840g以DMSO溶解乙醇定容于50mL容量瓶中配成1×10-3M的储备溶液。各种金属盐和氨基酸用蒸馏水溶解定容于25mL容量瓶中配成储备溶液待用。将探针溶液和待测离子溶液在DMF-缓冲溶液(tris-HCl，1.0mM，pH＝7.4，1:1，v:v)中稀释到合适浓度定容于10mL比色管中。室温下反应20min后进行紫外、荧光光谱的测量。荧光探针a的激发波长设置为540nm，发射波长为570nm，激发和发射狭缝宽度分别设置为2.5nm和5nm。化合物b的激发波长设置为570nm，发射波长为510nm，激发和发射狭缝宽度分别设置为2.5nm和5nm。探针a-Cu(II)络合物的激发波长设置为530nm，发射波长555nm，激发和发射狭缝宽度分别设置为2.5nm和5nm。
2、荧光探针a的设计与识别机理如图2所示。
由图2可知，荧光探针a以半罗丹明半荧光素为荧光团、希夫碱结构的C＝N双键为识别基团，通过氮原子和氧原子与铜离子(Cu2+)络合，则能保持结构稳定防止水解，而Cu2+络合又能引起荧光猝灭，就能够达到检测Cu2+的目的(图2路径a)。而其它金属离子(Mn+)不会与荧光探针a发生络合，随即发生水解反应生成半罗丹明半荧光素荧光团(图2路径b)。半胱氨酸(Cys)可以自a-Cu(II)络合物中将Cu2+夺出，恢复探针原有的希夫碱结构(图2路径c)，希夫碱易于发生水解反应，水解生成半罗丹明半荧光素荧光团，荧光增强，波长蓝移，即达到了检测Cys的目的(图2路径d)。
为了证明荧光探针a中酚羟基对Cu2+的络合作用，还设计合成了化合物b，化合物b的具体合成途径如实施例1所示。结果表明，没有了酚羟基，即使加入铜离子和其他金属离子，化合物b也不会发生荧光猝灭，并在水溶液中水解为半罗丹明半荧光素荧光团，荧光增强(图3路径e)，表明酚羟基在络合铜离子中的具有重要作用。
本发明还通过1HNMR、高分辨质谱、水解速率曲线和Cu2+引起的荧光猝灭图谱证明预测的脱络合-水解机理的正确性，具体如下：
1)如图3所示的核磁滴定谱图(DMSO-d6-D2O,1:1v:v)中，荧光探针a与Cu2+络合后，位于9.78ppm处的Ha信号峰消失，表示荧光探针a的酚羟基Ha已经用于和Cu2+络合。而水解产物则是芳环质子区和醛基质子有所区别，由于水解反应的进行，邻氨基苯酚脱离探针，共轭体系变小，芳环质子向高场移动，且质子个数减少，同时在10.5ppm处出现代表着醛基质子的Hb。
2)如图4所示的高分辨质谱中，在568.1103和416.1560处出峰分别表示着a-Cu(II)络合物和水解产物化合物2的生成，与预测的机理一致。
3)如图5(a)所示荧光探针a的水解速率曲线，荧光探针a未加入Cu2+时，随时间增长逐渐水解生成荧光团，荧光强度逐渐增强，加入Cu2+后，希夫碱结构被Cu2+络合锁定，水解过程被抑制，荧光强度基本不随时间发生变化。如图5(b)所示化合物b的水解速率曲线，化合物b没有酚羟基可以络合Cu2+，因此无论Cu2+存在与否，化合物b都会发生水解反应，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强。
3)如图6所示的荧光探针a对不同浓度Cu2+的荧光和紫外图谱，荧光探针a本身在570nm处有荧光发射波长，很明显这是半罗丹明半荧光素荧光团与苯环共轭的特征发射，加入Cu2+之后，由于络合作用荧光强度逐渐降低，发生了荧光猝灭，并且在加入1.0equiv.的Cu2+后这种猝灭就基本稳定。荧光探针a的紫外光谱也说明了a-Cu(II)络合物的生成，空白探针的紫外吸收峰位于560nm，随着铜离子浓度增大，吸收峰逐渐蓝移至540nm，并且在550nm处有明显的等吸收点，表示有新物种a-Cu(II)络合物生成。
探针a-Cu(II)络合物检测Cys的光谱性质研究
1)pH对检测效果的影响
pH对Cys检测的影响曲线如图7所示，pH的选择对检测效果有重要影响，由图7可以看出，a-Cu(II)络合物在弱酸性至碱性条件下的荧光强度都很微弱，加入Cys后，由于水解反应的发生和强荧光团的生成，荧光强度明显增强，而且在中性至碱性条件下荧光增强比较明显。因为Cys是生命体内重要的氨基酸，为了模拟细胞内检测条件，本发明选择pH7.4作为检测条件。
2)动力学研究
时间对Cys检测的影响曲线如图8所示，随着时间增长，Cys自a-Cu(II)络合物中夺出Cu2+，希夫碱水解反应进行逐渐完全，生成强荧光化合物，荧光强度逐渐增强。而各种浓度的Cys都可以使反应在15min内几乎进行完全，表明该探针a-Cu(II)可以快速、实时检测Cys。
3)选择性研究
Cys可以自a-Cu(II)络合物中将铜离子夺出，恢复探针原有的希夫碱结构，希夫碱易于发生水解反应，水解生成强荧光物质半罗丹明半荧光素，由于这种脱络合-水解过程的进行，a-Cu(II)络合物对Cys有极强的选择性，为专一性检测生物体内常见硫醇提供了一种新的思路和方法。图9为浓度为2μM的a-Cu(II)络合物对不同种类氨基酸的选择性光谱图和抗干扰性柱状图，由图9(a)可知，探针a-Cu(II)只有对Cys才有明显的光谱变化，对其他氨基酸没有明显变化，甚至对硫醇类氨基酸高半胱氨酸和谷胱甘肽也没有响应，因此，该探针a-Cu(II)对Cys具有高度选择性。由图9(b)可知，在其他干扰种类出现的情况下，探针a-Cu(II)仍然可以检测Cys，表明探针还有很好的抗干扰性能。
4)Cys浓度对探针光谱性质的影响
半胱氨酸可以自a-Cu(II)络合物中将Cu2+夺出，恢复探针a原来的希夫碱结构，希夫碱易于发生水解反应，水解生成强荧光化合物从而产生荧光信号和颜色变化。检测过程中探针a的溶液呈红色，发出橙色荧光，与Cu2+络合后，溶液变为深紫色，荧光猝灭，Cys引起的水解反应会产生半罗丹明半荧光素荧光团，溶液呈粉色并发出粉色荧光，其光谱变化如图10所示。由图10(a)的a-Cu(II)络合物对不同浓度Cys的荧光谱图可知，a-Cu(II)络合物在570nm处有荧光发射波长，随着Cys的浓度增加，荧光强度逐渐增强，且蓝移至555nm，说明共轭体系缩小，验证了预测的机理。由图10(b)可知，探针，a-Cu(II)络合物的紫外可见吸收光谱在540nm处有吸收峰，随着Cys浓度逐渐增强，吸收光谱逐渐增强且峰位蓝移至530nm，这与荧光变化的结果一致。
探针a-Cu(II)络合物定量检测半胱氨酸的曲线图如图11所示，荧光滴定的结果表明a-Cu(II)络合物可以在100μM以内定量检测半胱氨酸，线性方程可以记作F＝a+b×[Cys]，其中，a为171.52，b为2.723，F为560nm处的荧光强度，[cys]为半胱氨酸的浓度，回归系数R2为0.9952，检出限为0.38μM。
生物实验
为了将探针a-Cu(II)络合物用于活体细胞检测，首先测试其细胞毒性，选择乳腺癌细胞(MCF-7)作为测试对象，测试结果如图12所示。由图12可知，未处理的细胞被认为存活率为100％。当a-Cu(II)浓度为5μM时，96％以上的细胞仍然保持存活。即使a-Cu(II)浓度提升至50μM，仍然有91％的细胞保持存活。从以上结果可以看出，即使培养了24h，探针a-Cu(II)对MCF-7的细胞毒性仍然很低，即探针a-Cu(II)具有良好的生物相容性。
接下来研究了a-Cu(II)在MCF-7细胞中检测Cys的能力。如图13(b)(c)所示，用a-Cu(II)和1mM NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺)共同培养的细胞荧光非常微弱，这是由于NEM能够选择性的与Cys结合，不能与Cys结合的a-Cu(II)保持荧光猝灭，而用a-Cu(II)培养的MCF-7细胞呈现浅粉色的荧光图像，即a-Cu(II)具备在活体细胞中检测Cys的能力。这说明了探针a-Cu(II)具有在活体细胞中检测Cys的潜力。
本发明以半罗丹明半荧光素为荧光团，以希夫碱为识别基团，设计、合成了荧光探针a以检测半胱氨酸。荧光探针a与铜离子络合后，荧光猝灭，半胱氨酸与铜离子的结合能力更强，可以从络合物中夺出铜离子恢复希夫碱结构，随即发生水解反应生成荧光团，引起荧光强度增强且波长蓝移。由于这种脱络合-水解过程的进行，该探针a-Cu(II)对半胱氨酸具有高度选择性，甚至可以排除高半胱氨酸和谷胱甘肽的干扰，能够专一性检测生物体内的半胱氨酸。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种快速检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：
2.根据权利要求1所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括以下原料：间二乙胺基苯酚、邻苯二甲酸酐、甲苯、2，4-二羟基苯甲醛、甲磺酸、水、邻氨基苯酚和乙醇。
3.根据权利要求2所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括以下重量份的原料：间二乙胺基苯酚8-8.5份、邻苯二甲酸酐9-10份、甲苯30-40份、2，4-二羟基苯甲醛0.060-0.072份、甲磺酸3-7份、水15-25份、邻氨基苯酚0.05-0.06份和乙醇8-12份。
4.根据权利要求3所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括以下重量份的原料：间二乙胺基苯酚8.25份、邻苯二甲酸酐9.5份、甲苯35份、2，4-二羟基苯甲醛0.066份、甲磺酸5份、水20份、邻氨基苯酚0.0546份和乙醇10份。
5.一种快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将间二乙胺基苯酚、邻苯二甲酸酐、甲苯混合，升温反应，得紫红色固体；对所述紫红色固体进行抽滤、洗涤、重结晶，得淡粉色固体化合物1；
步骤2，将所述淡粉色固体化合物1与2，4-二羟基苯甲醛、甲磺酸混合，反应，冷却至室温，得冷却液；向所述冷却液中加入水，并调节pH至7.5-8.5，得紫红色固体；对所述紫红色固体进行抽滤、纯化，得淡粉色固体化合物2；
步骤3，将所述淡粉色固体化合物2与邻氨基苯酚、乙醇混合，回流反应，冷却至室温，抽滤、纯化，得深紫色固体荧光探针。
6.根据权利要求5所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤1中，所述升温反应为先升温至80℃反应10h，再升温至90℃反应5h，接着升温至100℃反应2h，最后升温至110℃反应1h。
7.根据权利要求5所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤1中，所述洗涤采用甲醇进行洗涤；所述重结晶采用正丁醇进行重结晶。
8.根据权利要求5所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤2中，所述反应的温度为85-95℃，反应的时间为0.8-1.2h；所述调节pH采用质量分数为25-28％的氨水调节。
9.根据权利要求5所述的快速检测半胱氨酸的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤3中，所述回流反应的温度为80-85℃，回流反应的时间为4.5-5.5h。
10.一种快速检测半胱氨酸的荧光探针在定量检测半胱氨酸中的应用。
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