CN102344449B - 并杂环萘酰亚胺及其制备方法与应用 - Google Patents
并杂环萘酰亚胺及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种并杂环萘酰亚胺及其制备方法与应用。本发明提供的化合物的制备方法，包括如下步骤：1)将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和N-R1化合物在溶剂A中反应，得到化合物B；2)将步骤1)得到的化合物B、1，2，4-3-氮唑、K2CO3在溶剂B中反应，收集反应液，即得到式(I)所示的化合物。本发明的实验证明，本发明制备一种化合物，其可作为用于监测pH的萘酰亚胺类荧光分子探针，在水溶液中pH5.5-7.5的范围内，能够很灵敏的监测生理条件下pH的细微变化，具有窄的响应范围。
Description
技术领域
本发明涉及荧光染料，尤其涉及一种并杂环萘酰亚胺及其制备方法与应用。
背景技术
l，8-萘酰亚胺是合成荧光探针的优秀的前体，具有很好的光稳定性，高的荧光量子产率，荧光发射波长适中以及斯托克斯位移大等特点，被广泛的应用在很多领域，通过在N-及4-位进行修饰可以设计合成出不同效果的荧光分子探针。
随着各种天然的和合成的荧光探针的应用以及新型的仪器如显微镜、流式细胞仪等的出现，使荧光分析方法在生命科学中得到了广泛的应用。检测生物体系相关物质的微环境变化也就随之成为了一个重要的研究领域。其中pH在生理和病变过程起着重要的判断依据，基于pH的荧光探针不断涌现，其中有不少被成功的商品化应用于生物分析化学、细胞生物学(测量细胞内pH)以及医学(调控血液中的pH和pCO2)等领域。但是大部分荧光分子探针对pH的响应是基于荧光强度的增加或降低，其检测的准确性易受探针浓度变化以及光源和检测器波动的影响，在复杂体系中还可能受到非靶标分子和环境等其他因素变化的影响。另外大多数pH探针都存在检测范围很宽的问题。比率荧光探针通过测量二个不同发射波长处的荧光强度的比率变化来避免这些问题。一些测量pH的比率荧光分子探针已有报道，并且被制成不同的pH荧光探针材料。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种化合物。
本发明提供的化合物，其结构式如下式(I)所示：
其中R1选自H、碳原子总数为1-25的烷基、碳原子总数为1-25且含N、O或S的烷基、含有取代基的碳原子总数为1-25的烷基、碳原子总数为3-16的环烷基、碳原子总数为4-10含N、O或S的杂环基、含有取代基的碳原子总数为4-10的芳基中的任意一种；
所述含有取代基的碳原子总数为4-10的芳基中的取代基选自碳原子总数为1-4的烷基、全氟烷基、氨基、卤素、氰基、硝基、羧基、羟基和碳原子总数为1-4的烷氧基中的至少一种，
所述含有取代基的碳原子总数为1-25的烷基，其中的取代基选自氨基、卤素、氰基、硝基、羰基、羟基、巯基、磺酸基或羧基；
R2、R3、R4、R5或R6均选自H、碳原子总数为1-25的烷基、碳原子总数为1-25且链中含N、O或S的烷基、碳原子总数为4-10含N、O或S的杂环基、含有取代基的碳原子总数为4-10的芳基、碳原子总数为1-25的烷氧基、羟基、羧基、磺酸基、卤素、氨基、氰基和硝基中的任意一种；
其中，所述含有取代基的碳原子总数为4-10的芳基中的取代基选自碳原子总数为1-4的烷基、全氟烷基、卤素、碳原子总数为1-4的烷基和碳原子总数为1-4的烷氧基中的至少一种，
所述芳基具体为苯基或取代苯基，所述取代苯基中的取代基选自碳原子总数为1-4的烷基、全氟烷基、卤素、氨基、氰基、羧基、磺酸基和硝基中的一种；
所述卤素具体为氟、氯、溴或碘。
R1选自(CH2)2OH、碳原子总数为4的烷基或(CH2)5COOH；
R2，R3，R4，R5或R6均选自H。
本发明的另一个目的是提供所述化合物的制备方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将4-溴-1，8-萘二甲酸酐衍生物和NH2-R1化合物在溶剂A中反应，得到化合物B；
2)将步骤1)得到的化合物B、1，2，4-3-氮唑、K2CO3在溶剂B中反应，收集反应液，即得到式(I)所示的化合物。
步骤1)中，所述溶剂A为无水乙醇。
所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐、所述NH2-R1化合物和所述溶剂A的配比为(1.5-2)g∶440ul∶(120-160)ml或(1.5-2)g∶0.74mg∶100ml；
所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐、所述NH2-R1化合物和所述溶剂A的配比具体为2g∶440ul∶160ml、1.5g∶440ul∶120ml或1.5g∶0.74mg∶100ml；
所述反应的温度为70℃-90℃，所述反应的温度具体为70℃、80℃或90℃；所述反应的时间为0.5h-5h；所述反应的时间具体为0.5h、2h、3h或5h；
步骤2)中，所述溶剂B为DMSO，
所述化合物B、1，2，4-3-氮唑、K2CO3和所述溶剂B的配比为(0.8-1.37)g∶(0.3-0.6)g∶(0.3-0.7)g∶(10-20)ml，所述化合物B、1，2，4-3-氮唑、K2CO3和所述溶剂B的配比具体为1.04g∶0.36g∶0.473g∶15ml、1.17g∶0.37g∶0.661g∶15ml或1.37g∶0.37g∶0.661g∶15ml；
所述反应的温度为110℃-160℃，所述反应的温度具体为110℃、150℃或160℃；所述反应的时间为12h-24h，所述反应的时间具体为12h、18h或24h。
步骤2)中，在所述收集反应液后还包括如下步骤：将所述反应液去除溶剂收集产物、所述产物进行硅胶柱层析分离，收集洗脱液、干燥，得到式(I)所示的化合物。
所述硅胶柱层析采用的洗脱缓冲液为CH2Cl2和MeOH的混合液，所述CH2Cl2和所述MeOH的体积比为(20-30)∶1；所述CH2Cl2和所述MeOH的体积比具体为25∶1；
所述洗脱缓冲液的速度为2-5ml/min，述洗脱缓冲液的速度具体为3ml/min，所述洗脱缓冲液的量为20-60倍柱体积，所述洗脱缓冲液的量具体为60倍柱体积；
所述收集洗脱液为收集第10-40个柱体积的洗脱液。
所述NH2-R1化合物为乙醇胺、正丁胺或氨基己酸；
所述DMSO为干燥除氧的DMSO(试剂用刚烘烤过的分子筛加入到分析纯的DMSO中，放置1-2天，使用前用氮气除氧半个小时以上)。
所述的化合物在检测待测溶液的pH中的应用也是本发明保护的范围；
或所述化合物作为检测待测溶液pH变化的比率荧光探针的应用也是本发明保护的范围。
所述pH为小范围变化的pH在5.5-7.5之间。
本发明的实验证明，本发明制备一种化合物，其可作为用于监测pH的萘酰亚胺类荧光分子探针，在水溶液中pH 5.5-7.5的范围内由于萘并杂环上N-H的离去有比色和比率的响应，吸收由440nm红移至480nm，荧光发射由480nm红移至510nm，能够很灵敏的监测生理条件下pH的细微变化，具有窄的响应范围，pKa＝6.36，在pH 5.5-7.5范围内响应，特异性强，灵敏度高，该荧光探针分子激发和发射光谱均在可见区，荧光量子产率高(量子产率Φf＝1.06，pH 4.29；Φf＝0.53，pH＝7.26)，化学/光稳定性好，且该探针分子不受生物体内金属离子以及生物小分子，蛋白等的影响。
该化合物保持了4-氨基取代的1，8-萘酰亚胺荧光团光稳定性好，荧光量子产率高等的优点，其氮杂环形成的并环结构具有了对pH值响应的性能。萘并杂环上的N-H随着酸碱的变化可逆的失去质子或结合质子，从而引起其吸收和荧光发射光谱的变化，变化范围为5.5-7.5，其酸式和碱式均具有强荧光，是一类很好的在生理环境中检测pH变化的比率探针分子。该衍生物结构简单，在生物系统和环境系统中有着潜在的应用价值。
附图说明
图1为探针分子ENNA紫外-可见吸收光谱与pH变化的关系
图2为探针分子ENNA荧光强度与pH的变化关系
图3为荧光探针分子ENNA的光化学稳定性
图4为生物体内共存分子对荧光探针分子的干扰性检测
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面通过实验具体说明并杂环萘酰亚胺(ENNA、BNNA、HNNA)的合成方法。
下述实施例中如无体积百分含量限定，乙醇即为无水乙醇。
实施例1、并杂环萘酰亚胺(ENNA)的合成
并杂环萘酰亚胺(ENNA)(R1为-(CH2)2OH，R2，R3，R4，R5或R6均为H)，化学的名称为：N-羟乙基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺合成路线如下：
1、N-羟乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B1)的合成
在250ml的单口圆底瓶中加入2g(7.22mmol)4-溴-1，8-萘二甲酸酐(A)，加入160ml乙醇加热至回流。加热搅拌片刻后，冷却至50℃，慢慢滴入440μl乙醇胺(7.3mmol)的5ml乙醇溶液，滴完升温至回流，混浊的溶液一下子变澄清，继续回流1h后反应结束，冷却有固体析出，抽滤，固体用水、乙醇分别洗三次，干燥，得到化合物B(灰白色固体B)，称重2.03g，收率88.1％，上述回流的温度为70℃、回流反应的时间为2h。4-溴-1，8-萘二甲酸酐、乙醇胺和无水乙醇的配比具体为2g∶440ul∶160ml；
化合物B1：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.65(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，2H)，8.56(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，8.40(d，J＝9Hz，1H)，7.84(dd，J＝7.5Hz，3Hz，1H)，4.42(t，J＝6Hz，2H)，3.98(t，J＝6Hz，2H)，2.09(s，1H)；13CNMR(CDCl3，75.5MHz，)δ162.94，162.89，132.45，131.45，131.28，130.84，129.68，128.95，128.72，128.24，122.80，122.03，57.69，41.94；MS(ESI)：m/z 320.1(M+).
由上可知，上述化合物B结构正确，为N-羟乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺
2、N-羟乙基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺(ENNA)的合成
在25ml单口瓶茄型瓶中加入1.04g(3.26mmol)由上述1得到的N-乙醇胺-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B)、1，2，4-3-氮唑0.36g(4.29mmol)，碳酸钾0.473g(3.43mmol)，在混合物中加入15ml干燥脱气的DMSO溶剂，磁力搅拌均匀后，慢慢加热到110℃，溶液颜色由灰白变为粉红最后变为红褐色。反应温度为110℃，反应12个小时反应完全，油泵抽干溶剂，硅胶色谱柱(柱子使用欣维尔玻璃仪器有限公司的层析柱，货号C184216，硅胶购自青岛海洋化工厂，目录号4561，160-200目。装柱高度为100mm。)提纯(洗脱缓冲液为CH2Cl2和MeOH的混合液，CH2Cl2/MeOH，25∶1，V/V；洗脱缓冲液的速度为3ml/min，所述洗脱缓冲液的量为30倍柱体积，所述收集洗脱液为收集第10-40个柱体积的洗脱液)，得到红色的固体，称重321mg，收率30.7％，得到化合物ENNA。
化合物ENNA为：1H NMR(DMSO，300MHz)δ8.37(d，J＝9Hz，1H)，8.22(s，1H)，8.11(d，J＝9Hz，1H)，7.33(d，J＝6Hz，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，4.18(t，J＝7.5Hz，2H)，3.55(t，J＝7.5Hz，2H)；13C NMR(DMSO，75.5MHz，)δ163.21，162.67，155.62，154.62，154.27，139.71，133.71，132.70，132.24，113.69，113.27，111.28，103.33，101.45，58.22，41.38.MS(ESI)：m/z 320.1，(M-H)-.HRMS(ESI)：m/z Calcd.for(M-)，320.0785，found，320.0789，Calcd forC16H10N5O3
由上可知，上述化合物ENNA结构正确，为式I所示化合物。
实施例2、并杂环萘酰亚胺(BNNA)的合成
并杂环BNNA(R1为-(CH2)3CH3，R2，R3，R4，R5或R6均为H)化学名称：N-丁基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺，合成路线如下：
1、N-丁基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B2)的合成
在250ml的单口圆底瓶中加入1.5g(5.42mmol)4-溴-1，8-萘二甲酸酐(A)，加入120ml乙醇加热至回流。加热搅拌片刻后，冷却至50℃，慢慢滴入400μl正丁胺(5.6mmol)的5ml乙醇溶液，滴完升温至回流，混浊的溶液一下子变澄清，颜色加深，变为橙色，继续回流40min后反应结束，加水析出沉淀，抽滤，固体用水、乙醇分别洗三次，干燥，得到化合物B2(灰色固体B2)，称重1.65g，收率81.1％，上述回流的温度为80℃、回流反应的时间为3h。4-溴-1，8-萘二甲酸酐、正丁胺和乙醇的配比具体为1.5g∶440ul∶120ml。
化合物B2：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.66(d，J＝6.0Hz，1H)，8.57(dd，J＝9.0Hz，0.6Hz，1H)，8.42(d，J＝6Hz，1H)，8.05(dd，J＝9.0Hz，0.6Hz，1H)，7.88-7.82(m，2H)，4.18(t，J＝7.5Hz，2H)，1.74-1.67(m，2H)，1.49-1.41(m，2H)，0.95(t，J＝4.5Hz，3H)；13C NMR(CDCl3，75.5MHz，)δ160.94，160.94，132.45，131.45，131.28，130.84，129.68，128.95，128.72，128.24，122.80，122.03，40.2，30.4，19.8，14.5；MS(ESI)：m/z 332.0(M+H)+.
2、N-丁基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺(BNNA)的合成
在25ml单口瓶茄型瓶中加入1.17g(3.52mmol)由上述1得到的N-丁基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B2)、1，2，4-3-氮唑0.37g(4.43mmol)，碳酸钾0.661g(4.43mmol)，在混合物中加入15ml干燥脱气的DMSO溶剂，磁力搅拌均匀后，慢慢加热到150℃，溶液颜色由灰白变为粉红最后变为红褐色。反应的温度为150℃，反应18个小时反应完全，油泵抽干溶剂，硅胶色谱柱(同上)提纯(CH2Cl2/MeOH，20∶1，V/V)，得到橙红色的固体，称重395mg，收率33.8％，得到化合物BNNA。
化合物BNNA为：1H NMR(DMSO，300MHz)δ8.39(d，J＝9Hz，1H)，8.24(s，1H)，7.93(d，J＝9Hz，1H)，7.22(d，J＝6Hz，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，4.18(t，J＝7.5Hz，2H)，1.74-1.67(m，2H)，1.49-1.41(m，2H)，0.95(t，J＝4.5Hz，3H)；13C NMR(DMSO，75.5MHz，)δ163.21，162.67，155.62，154.62，154.27，139.71，133.71，132.70，132.24，113.69，113.27，111.28，103.33，101.45，42.2，31.6，20.1，15.5.MS(ESI)：m/z 332.1，(M-H)-.HRMS(ESI)：m/z Calcd.for(M-H)-，332.0625，found，332.0629，Calcd for C18H15N5O2
3.N-丁基-4-丁胺基-1，8-萘酰亚胺(标准物)合成：
将100mg(0.302mmol)的化合物B2加入到5ml乙二醇单甲醚中，磁力搅拌下滴加入130μl(1.8mmol)正丁胺，回流1h后反应结束，TLC跟踪。放置过夜，析出沉淀，过滤，所得固体用CH2Cl2溶解经硅胶过柱分离提纯(CH2Cl2/MeOH，30∶1，V/V)，得到黄色的固体(纯度98％)，称重79.3mg，收率85％.
标准物：1H NMR(DMSO，300MHz)δ8.71(d，J＝9.0Hz，1H)，8.43(d，J＝6.0Hz，1H)，8.26(d，J＝9.0Hz，1H)，7.74(t，J＝6.0Hz，-NH-，1H)，7.67(t，J＝9.0Hz，1H)，6.78(d，J＝9.0Hz，1H)，4.01(t，J＝7.5Hz，2H)，3.39(t，J ＝6.0Hz，2H)，1.74-1.67(m，2H)，1.65-1.54(m，2H)，1.50-1.42(m，2H)，1.40-1.30(m，2H)，0.98-0.89(m，6H)；13C NMR(DMSO，75.5MHz，)δ150.65，150.65，134.25，130.60，129.42，128.55，124.17，121.85，120.09，107.46，103.74，42.55，29.94，29.81，19.81，13.75，13.72；MS(ESI)：m/z 325.0(M+H)+.
实施例3、并杂环萘酰亚胺(HNNA)的合成
并杂环HNNA(R1为-(CH2)5COOH，R2，R3，R4，R5或R6均为H)：N-己酸基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺合成路线如下：
1、N-己酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B3)的合成
在250ml的单口圆底瓶中加入1.5g(5.42mmol)4-溴-1，8-萘二甲酸酐(A)，和0.74mg 6-氨基己酸(5.6mmol)再加入100ml乙醇，加热至回流状态，当反应溶液由最初的乳白色浑浊液变为棕色的清澈液时反应结束，冷却，加水析出沉淀，抽滤，固体用水、乙醇分别洗三次，干燥，得到化合物B3(灰白色固体B3)，称重1.08g，收率50.9％，上述回流的温度为90℃、回流反应的时间为5h。4-溴-1，8-萘二甲酸酐、所述6-氨基己酸和乙醇的配比具体为2g∶440ul∶160ml、1.5g∶440ul∶120ml或1.5g∶0.74mg∶100ml；
化合物B2：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.65(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，2H)，8.56(dd，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，8.40(d，J＝9Hz，1H)，7.84(dd，J＝7.5Hz，3Hz，1H)，4.10(t，J＝7.2Hz，2H)；2.32(t，J＝7.6Hz，2H)；1.71(m，4H)；1.45(m，2H)；13C NMR(CDCl3，75.5MHz，)178.5，163.60，163.58，133.23，132.04，131.23，131.09，130.65，130.22，129.01，128.06，123.11，122.25，40.24，33.68，27.64，26.48，24.33；MS(ESI)：m/z 390.1(M+H)+.
2、N-己酸基-4H-1，2，4-三氮唑(1，5-a)二氮杂环-1，8-萘酰亚胺(HNNA)的合成
在25ml单口瓶茄型瓶中加入1.37g(3.52mmol)由上述1得到的N-己酸基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(B3)、1，2，4-3-氮唑0.37g(4.43mmol)，碳酸钾0.661g(4.43mmol)，在混合物中加入15ml干燥脱气的DMSO溶剂，磁力搅拌均匀后，慢慢加热到160℃，溶液颜色由灰白变为粉红最后变为红褐色。反应24个小时反应完全，油泵抽干溶剂，硅胶色谱柱提纯(CH2Cl2/MeOH，30∶1，V/V)，得到橙红色的固体，称重389mg，收率28.2％，得到化合物HNNA。
化合物HNNA为：1H NMR(DMSO，300MHz)δ8.37(d，J＝9Hz，1H)，8.22(s，1H)，8.11(d，J＝9Hz，1H)，7.33(d，J＝6Hz，1H)，6.89(d，J＝9Hz，1H)，4.10(t，J＝7.2Hz，2H)；2.32(t，J＝7.6Hz，2H)；1.71(m，4H)；1.45(m，2H)；13C NMR(DMSO，75.5MHz，)δ178.5，163.60，163.58，158.3，158.6，133.23，132.04，131.23，131.09，130.65，130.22，129.01，128.06，123.11，122.25，40.24，33.68，27.64，26.48，24.33.MS(ESI)：m/z 390.3，(M-H)-.HRMS(ESI)：m/z Calcd.for(M-H)-，390.0739，found，390.0742，Calcd for C20H17N5O4。
实施例4、ENNA、BNNA、HNNA的应用
1、ENNA、BNNA、HNNA的吸收光谱对pH的响应：
使用由实施例1得到的化合物ENNA评价其吸收光谱对pH的响应，具体如下：
配制ENNA(10mM)DMSO的母液，取2μL稀释到200μL不同pH的50mM的HEPES(N-羟乙基-1-哌嗪乙烷磺酸钠盐，购自百灵威科技有限公司，产品编号：21500.，溶剂为水。)/乙醇(4∶1体积比)中，浓度为100μM，分别扫描300-500nm区间的吸收光谱，测试结果显示于图1中，其中荧光探针分子ENNA的浓度是0.1mM，在pH 2.88，3.68，4.19，4.58，4.85，5.33，6.02，6.28，6.35，6.49，6.56，6.67，6.90，7.23，8.28，9.44，10.91的HEPES缓冲液/乙醇(4∶1)的溶液中进行测试的。图(A)对这些数据用origin8.0拟合得到的曲线(出峰处箭头的方向和图旁边的标注的上下顺序一致)。横坐标为波长(nm)，纵坐标吸光度。图(B)是对吸收比(A480nm/A440nm)的数据点进行Sigmoidal拟合得到的一条曲线。横坐标为pH，纵坐标为吸收比值。从图1中可以看出其吸收光谱随pH增加发生红移，在pH 5.5-7.5区间颜色由黄变红，吸收比(A480nm/A440nm)在pH 5.5-7.5区间随pH值升高线性上升，pH 5.5吸收比(A480nm/A440nm)为0.4557，pH 7.5吸收比(A480nm/A440nm)为2.2583。
采用上述方法检测化合物BNNA和HNNA，结果与化合物ENNA无显著差异，具体如下：
BNNA在pH 5.5吸收比(A480nm/A440nm)为0.4209，pH 7.5吸收比(A480nm/A440nm)为2.2833；
HNNA在pH 5.5吸收比(A480nm/A440nm)为0.4347，pH 7.5吸收比(A480nm/A440nm)为2.2434。
2、ENNA、BNNA、HNNA的荧光光谱对pH的响应
使用由实施例1得到的化合物ENNA评价其荧光光谱对pH响应，具体如下：
配制ENNA(1mM)DMSO的母液，取1μL稀释到1mL不同pH的50mM的HEPES/乙醇(4∶1)中，浓度为1μM，以455nm激发，分别扫描470-600nm区间的荧光光谱，测试结果显示于图2中，其中荧光探针分子ENNA的浓度是1uM，在pH 2.88，3.68，4.19，4.58，4.85，5.33，6.02，6.28，6.35，6.49，6.56，6.67，6.90，7.23，8.28，9.44，10.91的HEPES缓冲液/乙醇(4∶1)的溶液中进行测试的。其中图(A)对这些数据用origin8.0拟合得到的曲线(出峰处箭头的方向和图旁边的标注的上下顺序一致)。横坐标为波长(nm)，纵坐标荧光强度，激发波长为455nm。图(B)是对荧光强度比值(I480nm/I510nm)的数据点进行Sigmoidal拟合得到的一条曲线。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度比。
pH 5.2荧光强度比(I480nm/I510nm)为1.225，pH 7.4荧光强度比(I480nm/I510nm)为0.1284。
从图2中可以看出发射光谱随pH增加发生了红移，在pH 5.2-7.4区间荧光由蓝色变为绿色，荧光强度比值(I480nm/I510nm)随pH值升高而线性降低。根据480nm发射处荧光降低的数据通过Sigmoidal拟合可以计算出此探针的pKa＝6.36；
红移说明可以通过光谱变化监测这个区间的pH变化。
采用上述方法检测化合物BNNA和HNNA，结果与化合物ENNA无显著差异，具体如下：
BNNA在pH 5.2荧光强度比(I480nm/I510nm)为1.123，pH 7.4荧光强度比(I480nm/I510nm)为0.1075，此探针的pKa＝6.25；
HNNA在pH 5.2荧光强度比(I480nm/I510nm)为1.205，pH 7.4荧光强度比(I480nm/I510nm)为0.1103，此探针的pKa＝6.28。
3、探针ENNA、BNNA、HNNA的光化学稳定性。
使用由实施例1得到的化合物ENNA评价其光化学稳定性，具体如下：
配制ENNA(1mM)DMSO的母液，取1μL稀释到1mL三个不同pH 6.11，6.57，7.26的20mM的HEPES缓冲液(N-羟乙基-1-哌嗪乙烷磺酸钠盐，出售公司：百灵威科技有限公司，产品编号：21500.，溶剂为水。)中，浓度为1μM，分别扫其480nm激发，510nm发射的时间动力学荧光强度，光照测试时间1h，测试结果显示于图3中，其中探针ENNA分子的浓度是1uM，横坐标为时间(S)，纵坐标为在480nm激发，510nm发射处荧光强度，选择在pH 6.11，6.57，7.26的20mM的HEPES缓冲溶液中测量。
从图可以看出该探针分子随着时间的增加，荧光强度基本上是不变的，说明在光照，空气，溶液中是稳定的。
采用上述方法检测化合物BNNA和HNNA，结果与化合物ENNA无显著差异。
4、探针ENNA、BNNA、HNNA在生理条件下对pH选择性。
使用由实施例1得到的化合物ENNA评价其在生理条件下对pH稳定性，具体如下：
在三个不同pH 5.33，6.25，7.67的20mM的HEPES缓冲液中，分别测生理环境中的金属离子，小分子，蛋白对ENNA的荧光强度的影响，具体方法是先配制一定高浓度的以下(1-18)离子或分子的母液，在加入探针分子的1mlHEPES缓冲溶液中滴入离子或分子的母液，使离子或分子在缓冲液中的浓度为以下描述的值，其中探针浓度为1uM，测试结果显示于图4中，横坐标1，钠离子(来源于NaCl，溶于水)，150mM)；2，钾离子(来源于KCl，溶于水，150mM)；3，钙离子(来源于CaCl2，溶于水)，0.5mM)；4，镁离子(来源于MaCl2，溶于水，0.5mM)；5，锌离子(来源于ZnCl2，溶于水，0.5mM)；6，亚铁离子(来源于FeCl2，溶于水，0.5mM)；7，三价铁离子(来源于FeCl3，溶于水，0.5mM)，8；铜离子(来源于CuCl2，溶于水，0.5mM)；9，葡萄糖(购自百灵威科技有限公司，产品目录号67649，150μM)；10，果糖(购自百灵威科技有限公司，产品目录号390637，150μM)；11，D-核糖(购自百灵威科技有限公司，产品目录号370578，150μM)；12，D-核苷(购自百灵威科技有限公司，产品目录号479882，150μM)；13，精氨酸(购自北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号，34345，150μM)；14，赖氨酸(购自北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号，32429，150μM)；15，色氨酸(购自北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号25345，150μM)；16，酪氨酸(购自北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号，76587，150μM)；17，牛血清蛋白(购自百灵威科技有限公司，产品目录号109636，150μM))，纵坐标为荧光强度。其中探针分子的浓度为1uM，在三个不同pH的HEPES缓冲液中，pH 5.33(Ex＝440nm，Em＝480nm)，pH 6.25(Ex＝455nm，Em＝510nm)，pH 7.67(Ex＝480nm，Em＝510nm)，从图可以看出ENNA不会受生理环境中的其它因素的影响。
采用上述方法检测化合物BNNA和HNNA，结果与化合物ENNA无显著差异。
5、探针ENNA、BNNA、HNNA的荧光量子产率
使用由实施例1得到的化合物ENNA评价其荧光量子产率，具体如下：
配制ENNA(1mM)DMSO的母液，取一定量的母液稀释到1mL二个不同pH 4.29，7.26的20mM的HEPES缓冲液中，使其430nm处吸收值在0.02-0.05之间。标准物是N-丁基-4-丁胺基-1，8-萘酰亚胺(由实施例2得到)，在乙醇中，荧光量子产率Φf＝0.81，配制一定浓度的DMSO。
分别扫这三个溶液430nm激发，440-650nm区间的荧光光谱，测试结果显示于下表1所示，
表1为探针分子ENNA的荧光量子产率计算
| 样品 | Aex430nm | F(面积) | nD | Φf |
| PH4.29 | 0.035 | 50434.498 | 1.333 | 1.06 |
| PH7.26 | 0.023 | 16537.913 | 1.333 | 0.53 |
| 标准物 | 0.031 | 32834.631 | 1.362 | 0.81 |
从表中可以看出ENNA的荧光量子产率很高且酸碱式不一样，Φf＝1.06，pH＝4.29；Φf＝0.53，pH＝7.26。
采用上述方法检测化合物BNNA和HNNA，结果如下：
BNNA的荧光量子产率如下表2：
表2为探针分子BNNA的荧光量子产率计算
| 样品 | Aex430nm | F(面积) | nD | Φf |
| PH4.29 | 0.033 | 46920.911 | 1.333 | 0.93 |
| PH7.26 | 0.020 | 15532.837 | 1.333 | 0.49 |
| 标准物 | 0.031 | 32834.631 | 1.362 | 0.81 |
HNNA的荧光量子产率如下表3：
表3为探针分子HNNA的荧光量子产率计算
| 样品 | Aex430nm | F(面积) | nD | Φf |
| PH4.29 | 0.032 | 43296.482 | 1.333 | 0.89 |
| PH7.26 | 0.025 | 16032.087 | 1.333 | 0.45 |
| 标准物 | 0.031 | 32834.631 | 1.362 | 0.081 |
从表中可以看出BNNA和HNNA的荧光量子产率均很高。
Claims (10)
1.一种化合物，其结构式如下式（I）所示：
其中R1选自H、碳原子总数为1-25的烷基、碳原子总数为1-25且含N、O或S的烷基、含有取代基的碳原子总数为1-25的烷基和碳原子总数为3-16的环烷基；
所述含有取代基的碳原子总数为1-25的烷基中的取代基选自氨基、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、磺酸基或羧基；
R2，R3，R4，R5或R6均选自H。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R1选自(CH2)2OH、碳原子总数为4的烷基和(CH2)5COOH。
3.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
1）将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和NH2-R1化合物在溶剂A中反应，得到化合物B；R1与权利要求1或2中对于式（I）所示化合物中R1的定义相同；
2）将步骤1）得到的化合物B、3-氨基-1,2,4-三氮唑、K2CO3在溶剂B中反应，收集反应液，即得到式（I）所示的化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述溶剂A为无水乙醇，
所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐、所述NH2-R1化合物和所述溶剂A的配比为（1.5-2）g:440ul:（120-160）ml或（1.5-2）g:0.74mg:100ml；
所述反应的温度为70℃-90℃；所述反应的时间为0.5h-5h；
步骤2）中，所述溶剂B为DMSO，
所述化合物B、3-氨基-1,2,4-三氮唑、K2CO3和所述溶剂B的配比为（0.8-1.37）g：（0.3-0.6）g：（0.3-0.7）g：（10-20）ml；
所述反应的温度为110℃-160℃；所述反应的时间为12h-24h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐、所述NH2-R1化合物和所述溶剂A的配比为2g:440ul:160ml、1.5g：440ul:120ml或1.5g:0.74mg:100ml；所述反应的温度为70℃、80℃或90℃；所述反应的时间为0.5h、2h、3h或5h；
步骤2）中，所述化合物B、3-氨基-1,2,4-三氮唑、K2CO3和所述溶剂B的配比为1.04g:0.36g:0.473g:15ml、1.17g:0.37g:0.661g:15ml或1.37g:0.37g:0.661g:15ml；所述反应的温度为110℃、150℃或160℃；所述反应的时间为12h、18h或24h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤2）中，在所述收集反应液后还包括如下步骤：将所述反应液去除溶剂收集产物、所述产物进行硅胶柱层析分离，收集洗脱液、干燥，得到式（I）所示的化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述硅胶柱层析采用的洗脱缓冲液为CH2Cl2和MeOH的混合液，所述CH2Cl2和所述MeOH的体积比为20:1-30:1；
所述洗脱缓冲液的速度为2-5ml/min，所述洗脱缓冲液的量为20-60倍柱体积，
所述收集洗脱液为收集第10-40个柱体积的洗脱液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述CH2Cl2和所述MeOH的体积比为25:1；所述洗脱缓冲液的速度为3ml/min；所述洗脱缓冲液的量为60倍柱体积。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述NH2-R1化合物为乙醇胺、正丁胺或氨基己酸。
10.权利要求1或2所述的化合物在检测待测溶液的pH中的应用；
或权利要求1或2所述的化合物作为检测待测溶液pH变化的比率荧光探针的应用。
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