CN107603269B - 一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用。具体而言，本发明提供一种萘酰亚胺荧光团，其具有如下通式I所示的结构，式中各基团如文中所述。本发明的化合物水溶性好，水溶液中荧光量子产率高；可用于双光子成像，并可用于对活细胞的共定位成像。

Description

一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于精细化工领域，具体涉及一类基于萘酰亚胺的荧光染料、其制备方法及应用。

背景技术

荧光分析由于灵敏度高、操作方便等优点，近年来逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，已广泛应用于环境监测、荧光免疫分析、细胞染色等。荧光分析技术中常用的荧光染料包括香豆素类、菁染料类、氟硼吡咯类、稠环芳烃类、呫吨类、萘酰亚胺类等。

对应用于荧光分析与荧光成像的染料而言，通常要求其能够在水溶液中保持稳定的光学性质，对环境因素溶剂如极性、pH、温度等不敏感，特别是对于细胞染色染料，必须具有较高的荧光亮度。

与共振型染料不同，萘酰亚胺类染料与香豆素类染料类似，同属于分子内电荷转移型染料。其吸收与发射光谱相较于共振型染料的宽，强度高，斯托克斯位移大，且光稳定性好，结构简单易于修饰；由于该类荧光团具有大的刚性平面结构，能很好地嵌入DNA碱基对之间，破坏DNA结构，从而起到杀灭癌细胞的作用。然而，由于萘酰亚胺类染料具有溶剂化效应，在极性溶剂特别是水溶液中易发生荧光淬灭，大大限制了其在生物、医疗领域方面的应用。

一般而言，构建新荧光团的方法有四种：1)延长已知荧光母核结构的共轭链，红移发射波长，减少生物损伤及背景干扰；2)引入强吸电子或给电子基团，增强体系推拉-电子效应；3)刚性化母核结构，以减少非辐射能量损失；4)将已知荧光团的部分结构共价连接，组装成新荧光团。然而，以第一种方法构建的荧光团虽然能大大延长发射波长，减小生物体内自荧光的干扰，但是一般分子较大，水溶性不好；且共轭长链刚性不足，分子内振动剧烈造成能量损失，荧光较弱，合成也较复杂。以上这些缺陷也大大限制了这类荧光团在生物体系内的应用。

因此，以其他方法构建合成方法简单、吸收及发射强度高，水溶性好的小分子荧光染料在荧光探针领域内具有重要的意义。

发明内容

本发明设计合成了一类可用于生物体内检测的、水溶性好且荧光强度大的荧光团，建立了一种改善萘酰亚胺染料水溶性并提高其水溶液中荧光量子产率的新方法。

本发明第一方面提供一类萘酰亚胺荧光团，其为下式I化合物：

式中：

n为0-16整数；且当n为0时，R₁为-[(CH₂)_p-O]_q-H，其中，p为1-6的整数，q为1－4的整数；当n为1-16的整数时，R₁选自氢、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、磺酸基和生物靶向基团；

R₂选自-(CH₂)_r-或-(CH₂R)_s-CH₂-；其中，r和s各自独立选自1到5的整数，R独立选自N、O、S及Se；

X和Y各自独立选自N、O、S及Se，且X和Y中至少一个是N；

R₃和R₄各自不存在，或独立选自-R₅NHR₆、-R₅OR₆、-R₅SR₆、-R₅SO₃H或-R₅COOH；

R₅选自C_1-16亚烷基；

R₆选自H、氨基保护基、羟基保护基和巯基保护基。

在一个或多个实施方案中，所述生物靶向基团选自吗啉环、三苯基膦、叶酸和IRGD。

在一个或多个实施方案中，n为0，p为1-3，q为1-3。

在一个或多个实施方案中，n为0，p为2，q为2。

在一个或多个实施方案中，n为2-6的整数，R₁为氢或吗啉环；优选地，所述吗啉环经由其环氮原子与所述-(CH₂)_n-基团连接。

在一个或多个实施方案中，n为3-5的整数，R₁为H。

在一个或多个实施方案中，n为2-4的整数，R₁为吗啉环；优选地，所述吗啉环经由其环氮原子与所述-(CH₂)_n-基团连接。

在一个或多个实施方案中，R₂为-CH₂CH₂-。

在一个或多个实施方案中，X为N，Y为O，R₃为-R₅OR₆，R₄不存在；或者X为O，Y为N，R₃不存在，R₄为-R₅OR₆；其中，R₅为C_1-3亚烷基，R₆为H。

在一个或多个实施方案中，X和Y均为N，R₃和R₄独立选自-R₅OR₆，其中R₅为C_1-3亚烷基，R₆为H。

在一个或多个实施方案中，式I化合物选自：

本发明第二方面提供了一种改造萘酰亚胺以提高萘酰亚胺衍生的化合物的荧光量子产率的方法，所述方法包括在萘酰亚胺4-、5-位上同时引入给电子基团，并与萘环母体并环形成一个刚性、非平面结构，从而提高所述化合物的荧光量子产率。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在所述刚性、非平面结构上引入杂原子，和/或在刚性、非平面结构上引入不同修饰基团，从而提高所述化合物的水溶性。

在一个或多个实施方案中，所述杂原子选自N、O、S和Se。

在一个或多个实施方案中，所述修饰基团选自-[(CH₂)_p-O]_q-H、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基，其中，p和q如本文所述；

在一个或多个实施方案中，所述修饰基团在萘酰亚胺的环氮原子上引入。

在一个或多个实施方案中，改造所得的化合物如本发明式I所示。

本发明第三方面提供式I化合物在制备荧光探针(探针分子)中的应用，在细胞中的单光子、双光子成像中的应用，在细胞染色中的应用，以及在亚细胞器定位中的应用。

本发明第四方面提供前述式I化合物在环境监测、荧光免疫分析和细胞染色中的应用。

本发明还提供式I化合物的制备方法，

所述方法包括：

(1)使下式M3与H₂N-(CH₂)_n-R₁反应，生成式M4化合物；和

(2)使式M4与R₃-X-R₂-Y-R₄反应，从而制备得到式I化合物；

式I、M3和M4中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所述。

在一个或多个实施方案中，化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。

在一个或多个实施方案中，步骤(1)的反应温度为0-150℃，优选0-80℃，更优选20-80℃，最佳40-75℃。

在一个或多个实施方案中，通过在乙醇中回流而进行步骤(1)的反应。

在一个或多个实施方案中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。

在一个或多个实施方案中，步骤(2)的反应温度为0-300℃，优选0-200℃，更优选100-200℃，最佳100-150℃。

在一个或多个实施方案中，通过在乙二醇单甲醚中回流而进行步骤(2)的反应。

在一个或多个实施方案中，化合物M3通过以下方法制备得到：在溶剂冰醋酸中，在氧化剂的存在下使下式M2化合物发生反应，从而制备得到化合物M3：

在一个或多个实施方案中，所述氧化剂选自过氧化氢，高锰酸钾，重铬酸钾和重铬酸钠；优选重铬酸钠。

在一个或多个实施方案中，化合物M2和氧化剂的摩尔比为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。

在一个或多个实施方案中，制备M3的反应在0-100℃，优选0-80℃，更优选20-80℃，最佳30-68℃的温度下进行。

在一个或多个实施方案中，使硝化剂与化合物M1反应，从而制备得到化合物M2：

在一个或多个实施方案中，所述硝化剂是硝酸。

在一个或多个实施方案中，将发烟硝酸和冰醋酸的混合液恒压滴入化合物M1的冰醋酸溶液中，然后搅拌制备得到M2。

在一个或多个实施方案中，M1和硝化剂(如硝酸)的摩尔比为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。

在一个或多个实施方案中，搅拌温度为0-100℃，优选0-80℃，更优选0-50℃，最佳0-30℃。

在一个或多个实施方案中，通过使化合物M0与卤化剂反应而制备化合物M1：

在一个或多个实施方案中，所述卤化剂是溴化剂，优选是N-溴代丁二酰亚胺(NBS)。

在一个或多个实施方案中，制备化合物M1的反应在无水DMF中进行。

在一个或多个实施方案中，化合物M0和卤化剂(如溴化剂)的摩尔比为0.1-1000:1，优选0.5-100：1，更优选0.5-10:1，最佳1-2:1。

在某些实施方案中，本发明制备式I化合物的方法包括以下步骤：

(a)苊的卤代及硝化，制得4,5位取代的苊；

(b)4,5位取代苊的氧化，得到萘酰亚胺；

(c)萘酰亚胺环氮原子的取代；和

(d)步骤(3)产物在卤代和硝化位置的成环。

附图说明

图1为化合物FM3的吸收和发射光谱。其中a为化合物FM3在不同溶液中的吸收光谱；b为化合物FM3在不同溶液中的发射光谱。以最高Abs为基准，a中各曲线从上到下依次对应于水、PBS、Tris-HCl、EtOH、THF和CH₃CN；以最大荧光强度为基准，b中各曲线从上到下依次对应于EtOH、THF、CH₃CN、PBS、水和Tris-HCl。

图2是FM2的单晶结构图。其中，a和b是晶体结构图；c晶胞堆积图。

图3是DM1的单晶结构图。其中，a和b是晶体结构图；c晶胞堆积图。

图4为新型荧光团FM1、FM2和FM3不同浓度对细胞的毒性。

图5是FM0、FM1、FM2和FM3在活细胞中的单光子及双光子细胞成像。

图6是FM0、FM1、FM2和FM3的吸收截面图。

图7是FM3对细胞溶酶体的共定位成像。a、溶酶体染色：FM3；b、溶酶体染色：lyso-tracker red；c、a和b的合图；d、明场图；e、FM3和lyso-tracker red强度相关曲线；f、活性氧在细胞强度分布。

具体实施方式

本文中，烷基或烷基链可含有1-16碳原子，例如1-6个碳原子、1-3个碳原子、1-4个碳原子、2-4个碳原子、2-8个原子等。烷基或烷基链可以为直连和支链。亚烷基指-(CH₂)_a-，a为1－16的整数。亚烷基的例子包括但不先于亚甲基、亚乙基等。

本文中，酰基指“烷基-C(O)-”，烷氧基指“烷基-O-”，烷基的定义如前文所述。

“保护基”在文中指一种原子基团，当连接至分子中的反应性官能团时，遮蔽、减少或防止官能基团的反应性。典型地，保护基如需要可在合成期间选择性除去。保护基的例子可见Greene和Wuts的《有机化学中的保护基》(第3版,1999，约翰维斯父子出版社，纽约)和Harrison等人的《合成有机方法之大纲》(第1-8册，1971-1996，约翰维斯父子出版社，纽约)。

代表性的氨基保护基包括但不限于甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲基、三甲基甲硅烷基(“TMS”)、三苯甲基、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“TES”)等。

羟基的保护主要有醚保护和酯保护。羟基的保护醚包括但不限于硅醚(如三甲基硅醚)、甲基醚、烯丙基醚、苄基醚、烷氧甲基醚、三甲基硅乙基甲基醚等；羟基的酯类保护基包括但不限于t-BuCO，PhCO，MeCO，ClCH₂CO等。

巯基的保护通常经由硫醚、硫缩醛和硫醇酯事先。巯基的常见保护基包括但不限于苄基、三苯甲基或叔丁基硫醚等。

本文中，“生物靶向基团”指能靶向或定位感兴趣的目标的基团。这类基团包括但不限于溶酶体定位基吗啉、线粒体定位基三苯基磷和IRGD等。应理解，靶向基团与本发明式I中亚烷基的连接方式应不影响到靶向基团自身所具备的靶向功能。通常，R₁可通过氨基和羧基缩合或氨基烷基的方式与所述亚烷基相连。

本发明提供了一种改造萘酰亚胺以提高萘酰亚胺衍生的化合物的荧光量子产率的方法，所述方法包括在萘酰亚胺4-、5-位上同时引入给电子基团，并与萘环母体并环形成一个刚性、非平面结构，从而提高所述化合物的荧光量子产率。

本文中，“给电子基团”也称为“供电子基团”，通常指当该基团取代苯环上的氢后，导致苯环上电子密度相对原来升高的基团。合适的给电子基团包括但不限于烷基、氨基、羟基、烷氧基等。

在某些实施方案中，所形成的刚性、非平面环通常可含有6个以上环原子，例如6－10个环原子、6－8个环原子、6－7个环原子等。

在进一步的实施方案中，本发明还包括在所述刚性、非平面结构中引入杂原子，和/或在所述刚性、非平面结构上引入不同修饰基团，从而提高所述化合物的水溶性。杂原子可选自N、O、S和Se。修饰基团可选自-[(CH₂)_p-O]_q-H、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基，其中，p和q如本文所述。在某些实施方案中，修饰基团在萘酰亚胺的环氮原子上引入。优选地，当修饰基团为羟基、氨基、巯基、醛基、羧基或磺酸基时，可通过亚烷基连接臂-(CH₂)_n-将这些修饰基团与所述刚性、非平面结构连接，其中，n如本文所定义。在某些实施方案中，改造所得的化合物如本发明式I所示。

本发明改造萘酰亚胺的方法既增强了整个共轭体系的推拉电子效应，使得所得荧光团结构进一步刚性化，增强了共平面性及π电子的流动性，减少了非辐射性能量损失，又可以在刚性、非平面结构上修饰不同基团来提高荧光团的水溶性。

本发明的式I化合物是一种荧光团，可用于制备荧光探针。式I化合物中，n为0-16整数，例如0-10、0-8、0-6、0-4、1-8、1-6、1-4、2-6、3-5、2-4不等。R₁为-[(CH₂)_p-O]_q-H，其中，p为1-6的整数，q为1－4的整数；或R₁选自氢、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、磺酸基和生物靶向基团。

优选地，当n为0时，R₁为-[(CH₂)_p-O]_q-H，其中，p为1、2、3、4、5或6，q为1、2、3或4；当n为1-16的整数时，R₁选自氢、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、磺酸基和生物靶向基团。

优选地，n为0，p为1-3，q为1-3。在某些实施方案中，n为0，p为2，q为2。或者，优选地，n为2、3、4、5或6，R₁为氢或生物靶向基团。优选地，生物靶向基团为吗啉环、三苯基膦、叶酸和IRGD。在某些实施方案中，n为3、4或5，R₁为H；在其它实施方案中，n为2、3或4，R₁为吗啉环。优选地，吗啉环经由其环氮原子与所述-(CH₂)_n-基团连接。

式I中，r优选为1-4的整数。在某些实施方案中，r为2或3。在优选的实施方案中，R₂为-(CH₂)_r-，r优选为1、2、3或4的整数。在某些实施方案中，R₂为-(CH₂R)_s-CH₂-，其中，s为1、2或3，R优选为N或O。

式I中，X和Y优选各自独立为N和O。在优选的实施方案中，X和Y中至少一个是N。应理解的是，本发明所有化合物应符合键价理论。因此，当X和Y中的某一个或两个是O、S或Se时，相应的，式I结构中与之相连的R₃或R₄应不存在。

在某些优选的实施方案中，X为N、Y为O，或X为O、Y为N；更进一步优选地，R₂是-(CH₂)_r-，r为2或3。

式I中，R₃和R₄各自不存在，或独立选自-R₅NHR₆、-R₅OR₆、-R₅SR₆、-R₅SO₃H或-R₅COOH。优选地，R₃和R₄各自独立为-R₅OR₆。

R₅优选为C_1-6亚烷基，更优选为C_1-3亚烷基。

在某些实施方案中，R₃和R₄各自独立为-R₅OR₆，R₅优选为C_1-3亚烷基，R₆H。

应理解的是，上述各实施方案或各优选方案之间可任意组合。因此，例如，在某些优选实施方案中，X为N，Y为O，R₃为-R₅OR₆，R₄不存在；或者X为O，Y为N，R₃不存在，R₄为-R₅OR₆；其中，R₅为C_1-3亚烷基，R₆为H。在其它优选实施方案中，X和Y均为N，R₃和R₄独立选自-R₅OR₆，其中R₅为C_1-3亚烷基，R₆为H。在这些优选实施方案中，或在其它优选实施方案中，R₂是-(CH₂)_r-，r为2或3；以及n为0，p为1-3，q为1-3，或n为0，p为2，q为2，或者，n为2-6的整数，R₁为氢或生物靶向基团如吗啉环、三苯基膦、叶酸和IRGD，例如n为3-5的整数，R₁为H，或n为2-4的整数，R₁为吗啉环。

式I化合物可由苊作为起始原料制备得到。式I化合物的制备通常包括：苊的卤代及硝化，4,5位取代苊的氧化得到的萘酰亚胺，萘酰亚胺的取代及成环。式I化合物的制备流程可如下所示：

可通过使化合物M0与卤化剂反应而制备化合物M1。卤化剂可以本领域常用的各种卤化剂。在某些实施方案中，卤化剂是溴化剂，优选是N-溴代丁二酰亚胺(NBS)。制备化合物M1的反应在无水有机溶剂如(无水DMF)中进行。化合物M0和卤化剂(如溴化剂)的摩尔比可为0.1-1000:1，优选0.5-100：1，更优选0.5-10:1，最佳1-2:1。

可使硝化剂与化合物M1反应，从而制备得到化合物M2。可使用本领域周知的硝化剂。在某些实施方案中，硝化剂是硝酸。反应可在无水有机溶剂中进行。在某些实施方案中，将发烟硝酸和无水有机溶剂(如冰醋酸)的混合液恒压滴入化合物M1的冰醋酸溶液中，然后搅拌制备得到M2。M1和硝化剂(如硝酸)的摩尔比可以为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。通过搅拌硝化剂与化合物M1的混合物而制备M2。搅拌温度可为0-100℃，优选0-80℃，更优选0-50℃，最佳0-30℃。

可在无水有机溶剂如(冰醋酸)中，在氧化剂的存在下使下式M2化合物发生反应，从而制备得到化合物M3。氧化剂可选自过氧化氢，高锰酸钾，重铬酸钾和重铬酸钠；优选重铬酸钠。在某些实施方案中，化合物M2和氧化剂的摩尔比可为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。制备M3的反应可在0-100℃，优选0-80℃，更优选20-80℃，最佳30-68℃的温度下进行。

萘酰亚胺酸酐的取代包括使化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁进行反应。反应可在有机溶剂(如乙醇)中回流而进行。M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比可为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。反应温度可为0-150℃，优选0-80℃，更优选20-80℃，最佳40-75℃。

萘酰亚胺酸酐的成环包括使化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄在有机溶剂(如乙二醇单甲醚)中回流而实现。在某些实施方案中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比可为0.1-1000:1，优选0.2-100：1，更优选0.2-10:1，最佳0.2-5:1。反应温度可为0-300℃，优选0-200℃，更优选100-200℃，最佳100-150℃。

以上反应可在有水有机溶剂中或无水有机溶剂溶剂中进行。优选无水有机溶剂。适用于上述反应的有机溶剂包括但不局限于二氯甲烷，冰醋酸，乙二醇单甲醚，乙腈，二甲基甲酰胺(DMF)等。

可采用本领域常规的方法提纯式I化合物。

本发明也提供式I化合物的组合物，该组合物可以是一种染料，用于在细胞中的单光子、双光子成像，细胞染色，以及在亚细胞器定位。组合物中还可含有生物相容的溶剂，包括但不限于水、PBS、Tris-HCl等。

在某些实施方案中，可采用荧光共聚焦显微镜使用本发明的式I化合物或其组合物来研究细胞亚细胞器。在这些实施方案中，可利用单标(例如，使用本发明式I所示的分子探针)、双标(例如，使用本发明式I所示的探针分子和溶酶体探针或线粒体探针进行双标)、三标进行亚细胞器定位(例如，使用本发明式I所示的探针分子、溶酶体探针和线粒体探针进行三标)，从而达到亚细胞器的标记检测。

合适的溶酶体探针和线粒体探针均可从市售途径获得，例如可使用lyso-trackerred(DND-99)(溶酶体探针)、Red CMXRos(线粒体红色荧光探针)。这些探针用量可根据实际情况而定。当然，也可根据实际情况选择适当的其它探针来实施本发明的检测和定位/检测。

因此，本发明也提供式I化合物在制备荧光探针或荧光染料中的应用，以及式I化合物在细胞中的单光子、双光子成像中的应用，在细胞染色中的应用，以及在亚细胞器定位中的应用。在某些实施方案中，所述应用是在活细胞中的共定位成像。本发明还提供式I化合物在环境监测和荧光免疫分析中的应用。

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在更好理解本发明内容。因此，本发明的保护范围不受所举之例的限制。实施中所用到的试剂，除非特殊说明，否者都是从市场上直接购得的，其均依常规方法使用

实施例1：化合物FM1的合成

M1：将苊(3.10g,20.1mmol)分批加入20mL无水DMF中，将用10mL DMF溶解的NBS(3.60g,20.3mmol)溶液恒压滴入苊的DMF溶液中，保持速度在1滴/秒，温度控制在室温。搅拌过夜后，倒入冰水中，过滤，水洗，得到淡黄色固体。乙醇重结晶，得淡黄色固体2.39g，收率51.0％。熔点：55.5-56.6℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(d,J＝7.6Hz,1H),7.53(t,J＝7.2Hz,1H),7.31(d,J＝6.8Hz,1H),7.12(d,J＝7.2Hz,1H),3.41(t,J＝7.2Hz,2H),3.32(t,J＝7.2Hz,2H)。

M2：在500mL两口烧瓶中将M1(22.78g,97.7mmol)溶于150mL冰醋酸中，温度控制在10-15℃。将21mL发烟硝酸和41mL冰醋酸的混合溶液恒压滴入5-溴苊的冰醋酸溶液中，缓慢滴加，约30min内滴加完毕。搅拌10h后抽滤，冰醋酸重结晶得深黄色针状晶体15.91g，收率58.50％。熔点：154.2-154.3℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.83(d,J＝7.2Hz,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(d,J＝7.6Hz,1H),7.26(t,J＝4.0Hz,1H),3.39-3.45(m,4H)。

M3：将Na₂Cr₂O₇·2H₂O(35g,117.2mmol)溶入140mL冰醋酸中，搅拌均匀。分批加入M2(14.18g,51.0mmol)后，加热至回流，溶液呈墨绿色。反应过夜，倒入冰水中，搅拌后静置，水洗至无绿色为止，少量冰醋酸洗，得到红棕色粉末。熔点：295.5-295.7℃。

M4-1：在25mL的单口圆底烧瓶中加入M3(0.1g,0.3mmol)，加入10mL乙醇加热至回流。片刻后冷却到50℃，慢慢滴加入用5mL乙醇溶解的正丁胺(0.0227g,0.31mmol)，反应液颜色加深，变为红色；继续回流40min后反应结束。旋转蒸发除去溶剂，用CH₂Cl₂溶解，粗品硅胶柱分离，乙醇重结晶，得白色针状晶体51mg，收率49.2％。熔点：175.4-176.2℃，文献值：175.8-176.2℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.40(d,J＝6.8Hz,1H),8.39(d,J＝7.6Hz,1H),4.03(t,J＝7.6Hz,2H),1.62(m,2H),1.36(m,2H),0.92(t,J＝7.6Hz,3H)。HRMS(EI)C₁₆H₁₃N₂O₄Br[M]⁺理论值378.0038，实测值378.0042。

FM1：称取M4-1(377mg,1mmol)和二乙醇胺(1.7mL,17.66mmol)于25mL圆底烧瓶中，加入3.4mL乙二醇单甲醚溶解，搅拌回流7h。TLC跟踪至原料反应完全，冷却至室温，将反应液倒入25mL去离子水中，乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发除去溶剂，粗品硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝50/1，v/v)得黄色固体103mg，收率29.1％。熔点：175.4-175.5℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.33(d,J＝6.4Hz,1H),8.21(d,J＝7.2Hz,1H),7.10(d,J＝6.4Hz,1H),7.02(d,J＝7.2Hz,1H),4.96(t,J＝4.0Hz,1H),4.64(t,J＝3.8Hz,2H),3.99(t,J＝6.0Hz,2H),3.85(t,J＝3.8Hz,2H),3.78-3.74(m,4H),1.60-1.54(m,2H),1.36-1.28(m,2H),0.91(t,J＝6.0Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ163.13,162.80,161.55,153.74,132.88,132.85,115.79,115.18,114.69,109.36,108.40,73.78,57.73,55.28,54.36,38.81,29.74,19.79,13.73。HRMS(ESI)C₂₀H₂₂N₂O₄([M+H])⁺理论值355.1658,实测值355.1653。C₂₀H₂₂N₂O₄(354.40)理论值(％):C 67.78,H 6.26,N 7.90,实测值C 67.73,H6.15,N 7.92。

实施例2：化合物FM2的合成

M4-2：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(M3，2.00g,6.2mmol)、2-(2-氨基乙氧基)乙醇(616μL,6.2mmol)溶于20mL乙醇中，回流10h，TLC跟踪至反应完全，待反应液冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝200:1，v/v)，乙醇重结晶，得乳白色粉末固体835mg，收率33.0％。熔点：176.4-176.9℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.71(d,J＝4.0Hz,1H),8.52(d,J＝4.0Hz,1H),8.21(d,J＝4.0Hz,1H),7.93(d,J＝4.0Hz,1H),4.44(t,J＝5.6Hz,2H),3.86(t,J＝5.6Hz,2H),3.67-3.69(m,2H),3.63-3.65(m,2H),2.08(s,1H)。HRMS(ESI)C₁₆H₁₄N₂O₆Br[M+H]⁺理论值409.0035,实测值409.0029。

FM2：称取化合物M4-2(200mg,0.488mmol)和二乙醇胺(472μL,4.88mmol)于25mL的圆底烧瓶中，加入3.5mL乙二醇单甲醚溶解，搅拌回流7h，TLC跟踪至反应完全，待反应液恢复至室温，旋转蒸发除去溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝200:1，v/v)，得深黄色固体102mg，收率54.3％。熔点：108.4-109.0℃。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.48(d,J＝8.4Hz,1H),8.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.12(d,J＝8.0Hz,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),4.65(t,J＝5.0Hz,2H),4.41(t,J＝5.6Hz,2H),4.02(t,J＝5.2Hz,2H),3.81-3.85(m,6H),3.67-3.69(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃-CD₃OD):δ164.74,164.60,161.81,153.96,133.76,133.71,133.31,116.56,115.89,115.76,110.75,108.62,73.74,72.42,68.57,61.36,58.80,55.63,55.17,39.44。HRMS(ESI)C₂₀H₂₃N₂O₆[M+H]⁺理论值387.1556,实测值387.1547。

实施例3：化合物FM3的合成

M4-3：称取化合物M3(2.00g,6.21mmol)和2-氨乙基吗啉(808mg,6.21mmol)于250mL的圆底烧瓶中，加入100mL无水乙醇溶解，加热至50℃，继续搅拌反应8h，TLC跟踪至反应完全。待反应液冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝200:1，v/v)，得乳白色粉末固体1.05g，收率38.9％。熔点:200.7～201.1℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.70(d,J＝7.6Hz,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.93(d,J＝7.6Hz,1H),4.33(t,J＝6.2Hz,2H),3.65(br,4H),2.70(t,J＝6.2Hz,2H),2.57(br,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ162.82,162.06,151.28,135.98,132.33,131.23,130.57,125.69,124.17,123.56,122.41,121.21,66.98,55.92,53.79,37.65。HRMS(ESI)C₁₈H₁₇N₃O₅Br[M+H]⁺理论值434.0352,实测值434.0344。

FM3：称取化合物M4-3(100mg,0.230mmol)和二乙醇胺(221μL,2.30mmol)于25mL的圆底烧瓶中，加入2.5mL乙二醇单甲醚溶解，搅拌回流7h，TLC跟踪至反应完全，待反应液冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝200:1，v/v)，得深黄色固体56mg，收率58.9％。熔点:213.2-215.7℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.33(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝8.8Hz,1H),7.11(d,J＝8.0Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),4.98(br,1H),4.65(t,J＝4.6Hz,2H),4.13(t,J＝7.0Hz,2H),3.85(t,J＝4.6Hz,2H),3.75(br,4H),3.53(br,4H),2.54(m,2H),2.45(bs,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ163.13,162.76,161.60,153.78,132.91,115.80,115.08,114.63,109.25,108.40,73.78,66.17,57.73,55.71,55.28,54.35,53.36,36.28。HRMS(ESI)C₂₂H₂₆N₃O₅[M+H]⁺理论值412.1872,实测值412.1881。

实施例4：化合物DM1的合成

DM1：称取N,N’-双(2-羟乙基)乙二胺(196mg,1.33mmol)及碳酸钾(366mg,2.65mmol)于25mL单口圆底烧瓶中，加2mL乙二醇单甲醚溶解，50℃下搅拌反应0.5h；再加入化合物M4-1(100mg,0.265mmol)，加热至回流反应7h，TLC跟踪至反应完全。待反应液恢复至室温，旋转蒸发除去溶剂，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:1，v/v)，得深黄色固体36mg，收率35.3％。熔点：91.0-92.9℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.30(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(d,J＝8.4Hz,2H),4.08(t,J＝7.4Hz,2H),3.85(t,J＝4.4Hz,4H),3.63(s,8H),3.54(s,2H),1.61-1.69(m,2H),1.36-1.45(s,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃-CD₃OD):δ164.81,155.21,132.99,132.90,119.82,112.69,111.59,58.73,56.78,55.68,40.09,30.41,20.57,14.01。HRMS(ESI)C₂₂H₂₈N₃O₄[M+H]⁺理论值398.2080,实测值398.2068。

实施例5：化合物DM2的合成

DM2：称取N,N’-双(2-羟乙基)乙二胺(272mg,1.83mmol)及碳酸钾(507mg,3.67mmol)于25mL单口圆底烧瓶中，加2mL乙二醇单甲醚溶解，50℃下搅拌反应0.5h；再加入化合物M4-2(150mg,0.367mmol)，加热至回流反应7h，TLC跟踪至反应完全。待反应液恢复至室温，旋转蒸发除去溶剂，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:1，v/v)，得深黄色固体38mg，收率24.1％。熔点：252.9-253.5℃。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.16(d,J＝8.8Hz,2H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H),4.87(t,J＝5.2Hz,2H),4.57(s,1H),4.17(t,J＝6.6Hz,2H),3.74-3.70(m,8H),3.60-3.57(m,6H),3.45(s,4H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ163.04,154.92,132.98,132.16,114.82,110.06,109.51,72.04,67.14,60.16,57.73,55.59,55.14,38.07。HRMS(ESI)C₂₂H₂₈N₃O₆[M+H]⁺理论值430.1978,实测值430.1973。

实施例6：化合物DM3的合成

DM3：取N,N’-双(2-羟乙基)乙二胺(903mg,6.09mmol)及碳酸钾(1.68g,12.2mmol)于25mL单口圆底烧瓶中，加5mL乙二醇单甲醚溶解，50℃下搅拌反应0.5h；再加入化合物M4-1(529mg,1.22mmol)，加热至回流反应7h，TLC跟踪至反应完全。待反应液恢复至室温，旋转蒸发除去溶剂，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:1，v/v)，得深黄色固体78mg，收率14.1％。熔点：178,4-178.6℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃-CD₃OD):δ8.35(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),4.31(t,J＝7.0Hz,2H),3.86(t,J＝4.0Hz,4H),3.73-3.66(m,12H),2.71(t,J＝6.8Hz,2H),2.65(br,4H).¹³CNMR(100MHz,CDCl₃-CD₃OD):δ164.47,155.10,132.89,132.69,119.65,112.32,111.40,66.70,58.48,56.57,56.06,55.48,53.58,36.54。HRMS(ESI)C₂₄H₃₁N₄O₅[M+H]⁺理论值455.2294,实测值455.2292。

实施例7：目标荧光团光谱性能的测试

(1)紫外与荧光光谱测定

取一定量荧光分子母液，分别加入到不同纯化水、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、无水乙醇、无水乙腈、四氢呋喃这六种溶剂中，各自配成待测液，测定化合物FM0、FM1、FM2、FM3、DM1、DM2和DM3在不同极性、不同粘稠度溶剂体系中的吸收、发射性质。

(2)摩尔消光系数测定

取一定量荧光团母液于纯化水、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、无水乙醇、无水乙腈、四氢呋喃这六种溶剂中，分别配置成不同溶度的测试液，测定化合物FM0、FM1、FM2、FM3、DM1、DM2和DM3在不同溶剂不同浓度下的吸光度，并将三种浓度下的计算所得摩尔消光系数的平均值确定为荧光分子在相应溶剂中的摩尔消光系数。摩尔消光系数的计算公式如下：

ε＝A/bc(Beer-Lambert定律)

其中，ε为摩尔消光系数，A为吸光度，b为吸收层厚度(这里指比色皿宽度，即1cm)，c为测试液浓度。该公式仅在低浓度下适用。

(3)pH滴定

用微量移液枪滴加HCl或NaOH水溶液于纯水中以调节pH值，收集各个pH值(2～12)下的纯水备用。然后取荧光团母液和一定量特定pH值下的纯水于比色皿中，以此测定各个pH值下化合物FM0、FM1、FM2、FM3、DM1、DM2和DM3的吸收发射光谱。每个pH值下的吸收发射谱分别测三组，求平均值。

(4)荧光量子产率测定

以已知量子产率的荧光素(Φ_f＝0.79，0.1M NaOH水溶液)为标准品来测试化合物FM0、FM1、FM2、FM3、DM1、DM2和DM3的荧光量子产率，平行实验重复测三次求平均值。待测品荧光量子产率计算公式如下：

其中，为荧光量子产率，Grad代表吸光度与荧光峰面积之间拟合直线的斜率，n指溶剂折光系数。

测试结果显示在下表1和2中。另外，图1为FM3的吸收和发射光谱。其中a为化合物FM3在不同溶液中的吸收光谱；b为化合物FM3在不同溶液中的发射光谱。

表1：FM0、FM1、FM2和FM3在所选六种溶剂体系中的光谱数据

^*FM0为N-丁基-4-丁氨基-1,8-萘酰亚胺，在本实施例中为对照化合物。

表2：DM1、DM2和DM3在所选六种溶剂体系中的光谱数据

^*FM0为N-丁基-4-丁氨基-1,8-萘酰亚胺，在本实施例中为对照化合物。

实施例8：单晶的培养

为了进一步确证该类新型荧光团母核结构，对化合物FM2和DM1进行了单晶培养，具体方法如下：称取目标化合物两份，均在加热状态下滴加二氯甲烷将其恰好完全溶解，用滤膜过滤后转移至洁净的透明广口瓶内；其中一份盖上瓶盖后使其自然挥发结晶，另外一份则用滴管沿着瓶壁慢慢加入乙醚，使覆盖在上面的乙醚体积是下层二氯甲烷体积的2倍，然后盖上瓶盖并用封口膜进行严格的密封；将两份溶液均放在安静避光位置静养，两周后，溶有化合物FM2和DM1的自然挥发的瓶壁上慢慢附上一些颗粒状黄色透明晶体，母液未完全挥发干，将其送往上海有机化学研究所做X-射线单晶衍射测试，见图2和图3。

实施例9

(1)细胞毒性实验

先将不同浓度的FM1、FM2和FM3加入到微滴定板上培养的单层细胞中温育，撤去FM1、FM2和FM3，每日换液至2-3个PDT，然后再次更换培养液并在每个孔中加入MTT。于暗处温育4h，然后撤除培养基和MTT。将不溶于水的MTT—甲臜结晶溶于DMSO中，加入缓冲液调节最终的pH，在ELISA读板仪上记录吸光值，结果见图4。

(2)细胞内单光子与双光子荧光成像

在装有乳腺癌细胞(MCF-7)的三个玻璃培养皿中分别加入以下化合物进行培育：FM1(1μΜ，10min)，FM2(2μΜ，20min)，FM3(2μΜ，20min)；用PBS缓冲液洗涤细胞三次，将残留在培养基中的荧光染料洗去。用单光子及双光子显微镜分别用405nm和820nm激发光照射，收集470-570nm或者520-560nm通道的荧光，对用上述三个化合物培育过的细胞成像，见图5。

(3)双光子吸收截面

选择一种双光子吸收截面已知的有机染料(例如商业激光染料罗丹明6G，罗丹明B等)作为标准样品，然后选取合适的溶剂，将标准样品和待测样品分别配成浓度为c₁和c₂的溶液。吸收截面计算公式如下：

F＝KΦNδL²/2

其中，Φ表示荧光量子产率，N＝N_Ac表示样品的荧光团数密度，δ表示样品的双光子吸收截面，L表示样品的通光长度，K是一个无量纲常数，结果见图6。

(4)细胞染色的溶酶体共定位

在装有乳腺癌细胞(MCF-7)的玻璃培养皿中加入化合物(2μΜ)，于37℃下培育15min后加入市售溶酶体定位探针(DND-99，0.25μΜ)共同培育5min，用PBS缓冲液洗涤细胞三次，将残留在培养基中的荧光染料洗去，在单光子显微镜下分别用405nm和559nm的激发光照射，收集化合物和DND-99的细胞染色图，结果见图7。

虽然以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出各种合适的修改和变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

Claims (31)

1.一种萘酰亚胺荧光团，具有如下通式I所示的结构：

式中：

n为0-16整数；且当n为0时，R₁为-[(CH₂)_p-O]_q-H，其中，p为1-6的整数，q为1－4的整数；当n为1-16的整数时，R₁选自氢、羟基、氨基、巯基、醛基、羧基、磺酸基和生物靶向基团；

R₂选自-(CH₂)_r-或-(CH₂R)_s-CH₂-；其中，r和s各自独立选自1到5的整数，R独立选自N、O、S及Se；

X和Y各自独立选自N、O、S及Se，且X和Y中至少一个是N；

R₃和R₄各自不存在，或独立选自-R₅NHR₆、-R₅OR₆、-R₅SR₆、-R₅SO₃H或-R₅COOH；

R₅选自C_1-16亚烷基；和

R₆选自H、氨基保护基、羟基保护基和巯基保护基。

2.如权利要求1所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，所述生物靶向基团选自吗啉环、三苯基膦、叶酸和IRGD。

3.如权利要求1所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，

(1)n为0，p为1-3，q为1-3；或

(2)n为2-6的整数，R₁为氢或吗啉环。

4.如权利要求1所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，

(1)n为0，p为2，q为2；或

(2)n为3-5的整数，R₁为H；或

(3)n为2-4的整数，R₁为吗啉环。

5.如权利要求1-4中任一项所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，

(1)R₂选自-(CH₂)_r-，r为2-4的整数；和/或

(2)X为N，Y为O，R₃为-R₅OR₆，R₄不存在；或者X为O，Y为N，R₃不存在，R₄为-R₅OR₆；或X和Y均为N，R₃和R₄独立选自-R₅OR₆，其中R₅为C_1-3亚烷基，R₆为H。

6.如权利要求5所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，R₂为-CH₂CH₂-。

7.如权利要求1所述的萘酰亚胺荧光团，其特征在于，所述萘酰亚胺荧光团选自：

8.权利要求1－7中任一项所述的萘酰亚胺荧光团在制备荧光探针中的应用，在细胞中的单光子、双光子成像中的应用，在细胞染色中的应用，在亚细胞器定位中的应用，以及在环境监测和荧光免疫分析中的应用。

9.式I所示的萘酰亚胺荧光团的制备方法，

所述方法包括：

(1)使下式M3与H₂N-(CH₂)_n-R₁反应，生成式M4化合物；和

(2)使M4与R₃-X-R₂-Y-R₄反应，从而制备得到式I所示的萘酰亚胺荧光团；

式I、M3和M4中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如权利要求1－7中任一项所述。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比为0.1-1000:1；反应温度为0-150℃；

步骤(2)中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比为0.1-1000:1；反应温度为0-300℃；和

在有机溶剂的存在下进行步骤(1)和(2)的反应。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比为0.2-100:1；反应温度为0-80℃；

步骤(2)中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比为0.2-100:1；反应温度为0-200℃；和

在有机溶剂的存在下进行步骤(1)和(2)的反应。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比为0.2-10:1；反应温度为20-80℃；

步骤(2)中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比为0.2-10:1；反应温度为100-200℃；和

在有机溶剂的存在下进行步骤(1)和(2)的反应。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，化合物M3和H₂N-(CH₂)_n-R₁的摩尔比为0.2-5:1；反应温度为40-75℃；

步骤(2)中，化合物M4和R₃-X-R₂-Y-R₄的摩尔比为0.2-5:1；反应温度为100-150℃；和

在有机溶剂的存在下进行步骤(1)和(2)的反应。

14.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其特征在于，

化合物M3通过以下方法制备得到：在溶剂中，在氧化剂的存在下使下式M2化合物发生反应，从而制备得到化合物M3：

其中，所述氧化剂选自过氧化氢，高锰酸钾，重铬酸钾和重铬酸钠；化合物M2和氧化剂的摩尔比为0.1-1000:1；温度为0-100℃。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为重铬酸钠。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，化合物M2和氧化剂的摩尔比为0.2-100:1；温度为0-80℃。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，化合物M2和氧化剂的摩尔比为0.2-10:1；温度为20-80℃。

18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，化合物M2和氧化剂的摩尔比为0.2-5:1；温度为30-68℃。

19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，

化合物M2通过以下方法制备得到：使硝化剂与化合物M1反应，从而制备得到化合物M2：

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述硝化剂为硝酸。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，将发烟硝酸和冰醋酸的混合液恒压滴入化合物M1的冰醋酸溶液中，然后搅拌制备得到M2；M1和硝化剂的摩尔比为0.1-1000:1；温度为0-100℃。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，M1和硝化剂的摩尔比为0.2-100:1；温度为0-80℃。

23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，M1和硝化剂的摩尔比为0.2-10:1；温度为0-50℃。

24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，M1和硝化剂的摩尔比为0.2-5:1；温度为0-30℃。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，

化合物M1通过以下方法制备得到：通过使化合物M0与卤化剂反应而制备化合物M1：

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述卤化剂是溴化剂；反应在无水DMF中进行；化合物M0和卤化剂的摩尔比为0.1-1000:1。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述卤化剂是N-溴代丁二酰亚胺。

28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，化合物M0和卤化剂的摩尔比为0.5-100:1。

29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，化合物M0和卤化剂的摩尔比为0.5-10:1。

30.如权利要求26所述的方法，其特征在于，化合物M0和卤化剂的摩尔比为1-2:1。

31.权利要求1－7中任一项所述的式I所示的萘酰亚胺荧光团的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)苊的卤代及硝化，制得4,5位取代的苊；

(b)4,5位取代苊的氧化，得到萘酰亚胺；

(c)萘酰亚胺环氮原子的取代；和

(d)步骤(c )产物在卤代和硝化位置的成环。