CN111334077B - 一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 - Google Patents

一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法，该荧光染料是通过在萘酰亚胺4,5‑位引入不同刚性结构设计合成的一系列高亮度、高稳定性488nm激发的荧光染料，其结构式如(1)所示；与现有商业488nm染料FITC、Alexa488等相比此系列染料光稳定性更高，对pH、黏度、温度、极性等微环境均不敏感，能够在复杂环境中保持荧光信号的准确性。此类染料在不同溶剂中荧光半峰宽更窄(<30nm),不同溶剂中荧光量子产率均大于0.80(水中
Figure DDA0001910631380000012
)，摩尔消光系数大于4×104M‑1cm‑1。本项目发明的488nm系列染料易于衍生，在荧光成像、荧光标记等领域有较好的应用前景。

Description

一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法
技术领域
本发明属于荧光染料领域，具体涉及一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及合其成方法。
背景技术
荧光成像技术已经被广泛应用于生命科学中众多基本生理过程的监测，且随着高分辨技术的发展，荧光成像技术可以提供纳米尺度及单分子水平的分辨率。而这一技术的实现建立在快速、灵敏、可信及稳定的荧光信号反馈。其中，荧光信号拥有的独特的参数因子严重影响成像的方式的选择与成像结果的质量，如：激发(λex)和发射波长(λem)，强度，荧光寿命和发射向异性等。荧光强度和荧光稳定性是决定成像质量、荧光检测准确性等最重要的因素。
目前，应用最广泛的荧光染料为488nm系列的染料，荧光强度高是这类染料的突出特点。但是，其中FITC是荧光素类染料，发光形式是一种带有负电荷的荧光团，此形态对pH极其敏感，容易被氧化，且这种负电荷形式的细胞渗透性很差，严重影响其对活细胞内靶标分子的标记。而Alexa 488是罗丹明类染料，带有稳定的正离子，且具有良好细胞渗透性。但是Alexa 488受到碱性环境的影响，同时正离子的形式使其容易非特异性标记至线粒体。然而，不带电荷的中性荧光染料通常为极性敏感型荧光染料，在标记中常常伴有巨大的波长变化，会造成荧光信号读取的巨大误差。因此，488nm激发的荧光染料仍然不能满足荧光成像与检测的需求，染料的稳定性、环境不敏感性仍需要进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及合其成方法。
一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，该系列染料荧光量子产率在不同溶剂中达到0.80以上，对pH、极性、温度、黏度等微环境均不敏感。
一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，该方法具有操作简单、提纯容易等优点。
本发明提供了一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，该荧光染料以萘酰亚胺为荧光团，通过4,5-位刚性结构的调节使萘酰亚胺的荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，同时，萘酰亚胺由环境敏感型染料转变为环境不敏感型荧光染料，在不同极性环境中荧光波长及峰型保持不变。
一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，该系列荧光染料具有如下结：
Figure BDA0001910631360000021
其中，R1为H、C1-16烷基、(CH2CH2O)nH,(CH2)nSO3H等；
R2为
Figure BDA0001910631360000022
中的一种；
R3，R4各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOMe。
一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，此系列荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910631360000031
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，脂肪胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：石油醚＝1:6-4:1或二氯甲烷：甲醇＝1:0～0.01(体积比)为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺。
其中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与脂肪胺质量比为1-4:1；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与乙醇的质量与体积比为1:10-50(g：mL)。
(2)染料N-丁基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪胺。将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50～400:1(体积比)为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-丁基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
其中，N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪胺的质量比为1:1-4；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与乙二醇甲醚的质量与体积比为4-50:1(mg：mL)。
上述一系列488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料荧光量子产率高，在水中荧光量子产率达到0.80以上，对pH、黏度、极性等微环境均不敏感。
一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料在荧光分析中的应用。
本发明具有以下特点：
本发明涉及的染料拥有合成原料低价、方法简单且便于功能化、修饰等优点。
本发明涉及的染料在不同有机溶剂中吸收波长在488nm左右，荧光发射波长在495nm左右。
本发明涉及的染料在不同溶剂中荧光量子产率均大于0.80，水中荧光量子产率位0.81。该系列染料对pH、温度、黏度、极性等微环境均不敏感，在不同环境中能够保持高的荧光亮度，荧光信号更为准确。
附图说明
图1实施例1制备的BuAN-DAze的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的BuAN-DAze的核磁谱图碳谱。
图3实施例2制备的BuAN-DAzo的核磁谱图氢谱。
图4实施例2制备的BuAN-DAzo的核磁谱图碳谱。
图5实施例3制备的BuAN-EDA的核磁谱图氢谱。
图6实施例4制备的BuAN-DAC的核磁谱图氢谱。
图7实施例1制备的染料BuAN-DAze在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图8实施例2制备的染料BuAN-DAzo在不同溶剂中归一化的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图9实施例2制备的染料BuAN-DAzo在不同溶剂中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化紫外吸收，荧光染料的浓度为10μM。
图10实施例1制备的染料BuAN-DAze在乙醇中不同温度下(20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃)的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图11实施例1制备的染料BuAN-DAze在乙二醇与甘油不同比例下(0:10,2:8,4:6,6:4,8:20,10:2；体积：体积)的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图12实施例1制备的染料BuAN-DAze在500W钨灯照射下495nm处荧光强度随时间变化图，选取商业绿色线粒体染料、罗丹明123、荧光素、Bodipy作为参比染料。
图13实施例1制备的染料BuAN-DAze在不同pH下(pH＝2-12)的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM；插图为不同pH下495nm处荧光强度值变化。
图14实施例1制备的染料BuAN-DAze晶体结构示意图。
图15实施例1制备的染料BuAN-DAze在MCF(乳腺癌细胞)中荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
N-丁基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAze)的合成：
中间体N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910631360000051
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.0g,3.11mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(250mg，3.43mmol)。70℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.5Hz,2H),1.68(m,2H),1.40(m,J＝7.8Hz,2H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
N-丁基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAze)的合成：
Figure BDA0001910631360000061
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.26mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(300mg，5.26mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体80mg，产率51％。实施例1制备的BuAN-DAze的核磁谱图氢谱与碳谱如图1、2所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.21–4.12(m,2H),4.05(s,2H),2.42(s,8H),1.69(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.43(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.44,155.52,133.05,132.82,110.29,108.05,106.30,54.79,39.68,30.41,20.49,16.90,13.93.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值calcd for C22H26N3O2[M+H]+364.2025,实际值364.2035.
经检测，其结构如上式BuAN-DAze所示，其荧光性能如下：
将BuAN-DAze溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光及激发光谱。
BuAN-DAze在乙醇中荧光激发光谱与荧光发射光谱测试。每次取20μL BuAN-DAze母液加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。
BuAN-DAze在乙醇中荧光激发光谱与荧光发射光谱如图7所示：BuAN-Daze在乙醇中激发波长在480nm，荧光发射波长在488nm，较为适合488nm激光激发下的荧光染料。此外，荧光发射的半峰宽只有32nm，能有效避免荧光成像过程中的串色现象。
实施例2
N-丁基-4,5-二(氮杂环戊)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAzo)的合成：
Figure BDA0001910631360000071
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入四氢吡咯200mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体38mg，产率75％。实施例2制备的BuAN-DAzo的核磁谱图氢谱与碳谱如图3、4所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝8.7Hz,2H),6.65(d,J＝8.7Hz,2H),4.18(t,J＝7.0Hz,2H),3.60(s,2H),3.37(d,J＝4.9Hz,1H),3.28(d,J＝4.2Hz,2H),2.67(d,J＝8.0Hz,2H),2.19(s,2H),1.97(s,4H),1.70(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.57(s,2H),1.45(dt,J＝15.1,7.4Hz,2H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.33,154.20,133.79,132.69,109.52,108.97,106.15,52.27,49.49,39.53,30.45,25.89,25.54,20.51,13.97.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H30N3O2[M+H]+392.2338,实际值392.2343.
经检测，其结构如上式BuAN-DAzo所示，其荧光性能如下：
将BuAN-DAzo溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光及激发光谱。
BuAN-DAzo在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中荧光发射光谱与紫外吸收光谱测试。每次取20μL BuAN-DAzo母液加入4mL乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱与紫外吸收光谱测试。
BuAN-DAzo在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中荧光发射光谱如图8所示：BuAN-DAzo在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的荧光发射峰均在497nm左右，半峰宽窄，且荧光波长不随极性的变化而发生变化，在不同极性环境中能够保持信号的准确性。
BuAN-DAzo在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中紫外吸收光谱图如图9所示：BuAN-DAzo在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的吸收波长均在485nm左右，且不随溶剂极性变化而变化。
实施例3
N-丁基-4,5-乙二胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-EDA)的合成：
Figure BDA0001910631360000091
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.27mmol)溶于25mL乙二醇甲醚中，并向其中加入乙二胺100mg。将反应液缓慢加热至50℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体71mg，产率87％。实施例3制备的BuAN-EDA的核磁谱图氢谱如图5所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(s,2H),8.03(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(d,J＝8.7Hz,2H),4.01–3.92(m,2H),3.51(s,4H),1.54(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.31(dt,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.90(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.36,155.59,135.28,133.35,110.27,107.36,105.79,46.73,38.97,30.40,20.35.
经检测，其结构如上式BuAN-EDA所示，其最大吸收波长在488nm左右。
实施例4
N-丁基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAC)的合成：
Figure BDA0001910631360000101
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.27mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺350mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体31mg，产率32％。实施例4制备的BuAN-DAC的核磁谱图氢谱如图6所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.50(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.04–3.83(m,2H),3.16(t,J＝7.0Hz,2H),2.19(d,J＝11.2Hz,2H),1.73(d,J＝8.1Hz,2H),1.54(dt,J＝14.9,7.6Hz,2H),1.30(dq,J＝14.3,7.2Hz,6H),0.90(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.43,154.52,134.70,133.32,110.56,107.86,106.52,59.52,55.38,32.09,30.40,23.64,20.35,14.28.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O2[M+H]+364.2025,实际值364.2028.
经检测，其结构如上式BuAN-DAC所示，其最大吸收波长在478nm左右，荧光发射波长为487nm。
实施例5
N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成：
中间体N-十二烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(DDAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910631360000111
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加十二胺(500mg，2.70mmol)。90℃下24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得黄白色固体542mg，产率71％。其核磁谱图氢谱如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,2H),1.1-1.8(m,20H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成：
Figure BDA0001910631360000112
将N-十二烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(250mg，0.51mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺350mg。将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体61mg，产率25％。其核磁谱图氢谱及碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.46(s,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),3.94(t,J＝7.2Hz,2H),3.15(s,2H),2.19(d,J＝11.6Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.43–1.12(m,22H),0.84(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.42,154.48,134.69,133.28,110.54,107.93,106.56,59.54,32.09,31.76,29.48,29.46,29.43,29.39,29.27,29.17,28.16,27.06,23.65,22.55,14.41.
经检测，其结构如上式DDAN-DAC所示，其最大吸收波长在478nm左右，荧光发射波长为487nm。
实施例6
N-十六烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(HexAN-DAC)的合成：
中间体N-十六烷基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910631360000121
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入十六胺(500mg，2.07mmol)。90℃下24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1，V/V)分离得黄白色固体528mg，产率62％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.7Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),3.63(t,J＝6.5Hz,2H),1.1-1.8(m,28H),0.92(t,J＝7.8Hz,3H).
N-十六烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(HexAN-DAC)的合成：
Figure BDA0001910631360000131
将N-十六烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(300mg，0.55mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺450mg。将反应液缓慢加热至130℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体102mg，产率35％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.51(s,2H),6.85(d,J＝8.5Hz,2H),3.96(t,J＝7.2Hz,2H),3.25(s,2H),2.19(d,J＝11.3Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.47–1.02(m,30H),0.85(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.55,154.62,134.77,133.20,110.54,108.05,106.70,59.55,32.12,31.76,29.48,29.46,29.33,29.32,29.19,28.20,27.07,23.68,22.57,14.43.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C34H50N3O2[M+H]+532.3903,实际值532.3930.
经检测，其结构如上式HexAN-DAC所示，其最大吸收波长在478nm左右。
实施例7
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(OAN-DAze)的合成：
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1，8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910631360000141
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g,6.24mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(1.97g，18.7mmol)。40℃下2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体996mg，产率39％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3/DMSO-d6)δ8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.50(d,J＝7.9Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(t,J＝5.9Hz,2H),4.21(s,1H),3.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.58(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3/DMSO)δ167.48,166.76,155.77,140.86,137.11,136.25,135.21,130.44,128.84,128.34,127.29,125.60,77.28,72.13,65.73.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C16H14BrN2O6[M+H]+409.0035,实际值409.0031.
OAN-DAze的合成
Figure BDA0001910631360000151
将OAN-Br(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷200mg。将反应液缓慢加热至50℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率52％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(d,J＝5.3Hz,2H),4.09(s,8H),3.83(t,J＝5.4Hz,2H),3.68(s,4H),2.42(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.74,155.77,133.31,133.16,109.85,107.84,106.39,72.18,68.91,61.94,55.25,38.99,16.89.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实际值396.1919.
经检测，其结构如上式Halo-OH所示，其最大吸收波长在485nm左右。
实施例8
Nu-DAze的合成：
中间体N-磺酸甲基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(SO3-NBr)的合成：
Figure BDA0001910631360000161
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.70g,2.18mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加氨基甲磺酸(485mg，4.68mmol)与600mg二异丙基乙基胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝200:1-50:1，V/V)分离得土黄色固体317mg，产率35％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),8.57(d,J＝7.8Hz,1H),8.38(s,2H),8.36(d,J＝7.9Hz,1H),3.38(s,2H).
Nu-DAze的合成：
Figure BDA0001910631360000162
将SO3-NBr(50mg，0.12mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷100mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体7mg，产率14％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝8.5Hz,2H),8.28(s,1H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.18(s,8H),2.45(s,4H).
经检测，其结构如上式SO3-DAze所示，其最大吸收波长在485nm左右。
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及细胞内荧光成像。
实施例9
BuAN-DAze在乙醇中不同温度(20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃)下荧光发射光谱测试。取20μL BuAN-DAze母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光染料测试液。通过金属加热块升温，水循环降温，调节至所需温度并稳定5min后进行荧光光谱的测试。
BuAN-DAze在乙醇中不同温度下荧光光谱图如图10所示：BuAN-DAze随着温度的增加分子内扭动增加，荧光会有少量的淬灭，但是在生理温度30-40℃荧光强度基本不变。
实施例10
BuAN-DAze在乙二醇与甘油不同比例下(0:10,2:8,4:6,6:4,8:20,10:2；体积：体积)的荧光发射谱测试。取20μL BuAN-DAze母液，分别加入4mL乙二醇与甘油不同比例溶液后，在室温分别搅拌与超声2h，配制成10μM的荧光染料测试液，而后进行荧光光谱测试。
BuAN-DAze在乙二醇与甘油不同比例下荧光发射光谱如图11所示：BuAN-DAze在乙二醇与甘油不同比例下荧光光谱未出现明显变化，荧光强度基本不变，说明BuAN-DAze不受黏度的影响，在成像过程中荧光信号不会随黏度变化而失去真实性。
实施例11
BuAN-DAze在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化测试。取20μL BuAN-DAze及商业染料母液加入4mL PBS(磷酸缓冲液，pH 7.4)中，而后加入螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10h为时间节点进行荧光光谱测试，并选取各自染料荧光发射峰值对时间进行曲线图。
BuAN-DAze在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化图如图12所示：BuAN-DAze荧光强度在光照10h后仍然能够保持较高强度(97％)，而商业绿色线粒体染料、罗丹明123、荧光素、Bodipy等荧光强度均大幅降低，这说明BuAN-DAze光稳定性极高。
实施例12
BuAN-DAze在不同pH下(pH＝2-12)的荧光发射光谱测试。取400μL BuAN-DAze母液溶于80mL水中，通过氢氧化钠溶液及盐酸溶液调节pH，带稳定后取出4mL测试液进行荧光光谱测试，并选取荧光峰值对pH值作图。
BuAN-DAze在不同pH下(pH＝2-12)的荧光发射光谱如图13所示：BuAN-DAze在不同pH下荧光光谱基本不存在明显变化，荧光强度基本保持不变，BuAN-Daze能够在不同pH下保持高稳定性。
实施例13
BuAN-DAze晶体培养。BuAN-DAze固体粉末5-10mg溶于5mL色谱甲醇中，而后通过0.22μm涤纶过滤器过滤，置于10mL玻璃小瓶中，棉花密封，放置于安静通风处进行挥发。
BuAN-DAze晶体结构图如图14所示：BuAN-DAze供电基一端，两个氮杂环丁烷由于强的环张力与拥挤性，形成了将近90度的面夹角，类似于脚蹼状分别位于萘酰亚胺平面两侧。
实施例14
BuAN-DAze对活细胞染色后荧光成像测试。取0.5μL BuAN-DAze母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育10分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
BuAN-DAze终浓度为1μM的细胞培养液孵育MCF 10min后的共聚焦荧光成像如图15所示：，BuAN-DAze能够很快进入细胞并对细胞进行荧光成像。

Claims (3)

1.一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征在于：包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，脂肪胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或以体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
其中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与脂肪胺质量比为1-4:1；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与乙醇的质量与体积比为1:10-50g/mL；
(2)染料N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
该染料基于萘酰亚胺染料在4,5-位引入刚性的环胺结构，用于488nm激光激发的荧光染料对极性、温度均不敏感，荧光量子产率在水中高达0.80以上，荧光半峰宽小于35nm，其结构如下：
Figure FDA0003486954020000011
Figure FDA0003486954020000021
2.按照权利要求1所述的一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪胺的质量比为1:1-4；
N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为4-50:1g/mL。
3.一种如权利要求1-2 任一所述方法制得的488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料在荧光分析制剂中的应用。
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