CN114149441B - 一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光标记技术领域，具体涉及一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用。本发明利用了芳香胺类化合物的氨基与两种邻位含氯的醛基香豆素进行一步成环反应后，得到一系列新的含氮杂环化合物。该类化合物具有优异荧光发射性能的同时，在不同的有机溶剂中均具有良好的光稳定性。本发明有效解决了菁类染料的光稳定性差的问题，同时可以在细胞水平上对不同细胞器进行标记。氮杂环的引入使得化合物的生物相容性得到了提高，为生物应用奠定了良好的基础。另外，此类反应的原料廉价易得且合成标记物的步骤简单、容易操作，在不降低标记物性能的同时可以有效地降低生产成本，具有一定的商业价值。

Description

一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用
技术领域
本发明属于荧光标记技术，具体涉及一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物及其制备和应用。
背景技术
脂滴作为一个动态的独立的细胞器，它是真核细胞中性脂质储存的重要场所，在脂质协调过程中，可以促进细胞中脂质的吸收，代谢，运输和信号传导，进而来维持各项生理活动的顺利进行(参考：J.-W.Shi,Y.Tian,X.-L.Zhang,etal.,An AIEgen-BasedFluorescent Probe for Highly Selective and Specific Imaging of Lipid Dropletsin L02 and HepG2 Cells,Sensors and Actuators B:Chemical,2019(284)545-552)；线粒体由双膜系统组成，是真核细胞内参与能量代谢和细胞内稳态的细胞器，因此在整个生命体的活动中充当能量交换的动力源，代谢工厂和信息传导中心，是细胞新陈代谢的中枢(参考：X.-Y.Li,Y.-M.Hu,H.-M.Ma,et al.,Mitochondria-Immobilized Near-InfraredRatiometric Fluorescent pH Probe to Evaluate Cellular Mitophagy,Anal Chem,2019(91)11409-11416)。在复杂的细胞环境中，对脂滴和线粒体的状态进行观察和检测显得极其重要(参考：D.I.Danylchuk,P.H.Jouard,A.S.Klymchenko,TargetedSolvatochromic Fluorescent Probes for Imaging Lipid Order in Organelles underOxidative and Mechanical Stress,J.Am.Chem.Soc,2021(143)912-924)。就目前的检测手段来讲，荧光标记由于选择性好，灵敏度高，操作方便，一直活跃在研究者的视线中，近年来，标记脂滴和线粒体的染料类荧光探针也越来越多(参考：(1)J.-Y.Ni,R.Sun,J.-F.Ge,et al.,Convenient Construction of Fluorescent Markers for Lipid Droplets with1,8-Naphthalimide Unit,Dyes and Pigments,2021(186)109003.(2)W.Ma,B.Xu,Y.-J.Xu,et al.,The Application of Amide Units in the Construction of NeutralFunctional Dyes for Mitochondrial Staining,J.Mater.Chem.B,2021(9)2524)。
目前常用的细胞器商用标记物在经过长期反复使用的过程中，一些缺点就随之慢慢的凸显出来。NileRed和BODIPY的衍生物是常用的脂滴商用标记物，而Nile Red类衍生物在标记的过程中对脂滴缺乏特异性，在一些情况下会对其它细胞器进行染色；BODIPY类衍生物由于斯托克斯位移比较小也限制了其使用。在标记线粒体的过程中，常用的商用标记物大多是一些盐类结构，例如三苯基膦盐、吡啶盐和吲哚盐等，它们能够定位于线粒体的同时也存在一些问题，这些阳离子进入细胞后会改变线粒体的膜电位，进而使细胞的微环境发生改变，影响生命体的生理活动(参考：Y.Wang,B.Xu,R.Sun,J.-F.Ge,et al.,TheApplication of Nitrogen Heterocycles in Mitochondrial-Targeting FluorescentMarkers with Neutral Skeletons,J.Mater.Chem.B,2020(8)7466)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用不同的芳香胺与香豆素类衍生物在控制投料比的基础上，通过一步反应得到一系列具有色烯并喹啉的杂环化合物，使其在生物应用中，能够对脂滴或线粒体进行成像。
本发明提供一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物，所述氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物结构中心有一个或多个色烯并喹啉环，所述色烯并喹啉环的周边有一个或多个二烷基氨基。
优选的，其结构式如1a-1d中任一所示：
Figure GDA0003901901430000021
优选的，所述氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物中的色烯并喹啉环旁有1-2个苯环。
优选的，所述氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物由芳香胺和香豆素类荧光前体通过一步反应合成。
进一步地，所述芳香胺为1-萘胺(5a)、N,N-二乙基对苯二胺(5b)或对苯二胺(5c)。
进一步地，所述香豆素类荧光前体为4-氯-3-甲酰基香豆素(5d)或7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛(5e)；
Figure GDA0003901901430000022
进一步地，所述芳香胺和香豆素类荧光前体的摩尔比为1:1-2。
进一步地，所述芳香胺和香豆素类荧光前体在催化剂作用下反应合成氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物；所述催化剂为路易斯酸。
进一步地，所述路易斯酸为三氯化铝、三氟化硼、三氧化硫或溴化铁。
进一步地，反应溶剂为四氢呋喃；所述芳香胺和催化剂的摩尔比为1：1-2。
本发明还提供一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物作为细胞器荧光标记的应用。
进一步地，所述1a、1b和1c氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物作用于脂滴成像；所述1d氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物作用于线粒体。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明首次公开了一系列新型的杂环荧光标记物，氮杂环的引入提高了化合物的生物相容性，更有助于在生物领域的应用，而且在芳香胺与香豆素类衍生物反应的过程中方便快捷只需一步操作，就可得到目标产物且可以定位于脂滴或线粒体，具有生物应用价值。
含氮杂环作为此类结构的中心，提高了生物相容性，N,N-二乙氨基作为常用的强给电子基位于结构的两端，在提高化合物在有机溶剂中溶解性的同时也影响其光学性质。
将廉价易得的芳香胺与经典的香豆素类衍生物通过成环反应合成了可以定位于脂滴或线粒体的荧光标记物。此类荧光标记物在保持香豆素优良的荧光性能以外，通过对结构进行修饰，把没有靶向能力的香豆素类衍生物最终变成了可以对脂滴或线粒体进行靶向的荧光探针。更为重要的是基于两种廉价易得的原料进行反应的整个过程操作简单且方便快捷。
本发明利用廉价易得的芳香胺类化合物并且使用四氢呋喃非质子性溶剂作为反应的有机溶剂，无水三氯化铝参与其中，保证反应顺利进行具有实际应用价值。
本发明的杂环类荧光探针分别与HeLa细胞共培育之后，可以实现对脂滴或线粒体的荧光成像。这类荧光标记物在细胞成像过程中细胞毒性低对生物样品损伤小，具有大的斯托克斯位移背景干扰小，具有极大的科学意义和商业价值。
附图说明
图1为本发明涉及的荧光标记物1a-1d的合成路线；
图2为荧光标记物1a-1d的光稳定性；
图3为荧光标记物1a-1d在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图4为荧光标记物1a-1d的细胞毒性测试图；
图5为荧光标记物1a-1d在HeLa细胞中的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像；绿光通道使用405nm激发，收集468-550nm范围内的荧光信号；红光通道使用561nm激发，收集570-750nm范围内的荧光信号。
本发明实施例的合成路线参见附图1，其中5a-5e代表不同原料的编号。本发明的化合物合成中，原料比例以及纯化方法采用常规比例或者常规纯化方法，实施例为示意性表述，且本发明通过核磁氢谱、核磁碳谱以及高分辨质谱验证产物结构的正确性。
实施例1
染料1a合成的步骤如下：
取化合物N,N-二乙基对苯二胺5b(1.0毫摩尔，393.0毫克)，化合物5d(1.0毫摩尔,500.0毫克)和三氯化铝(1.0毫摩尔，319.0毫克)溶解于20.0毫升的四氢呋喃中，然后回流3到4个小时，TLC检测反应进度；降至室温后，直接通过旋转蒸发仪除去溶剂，经柱层析(洗脱剂：纯二氯甲烷)分离得到纯净染料1a，橙色固体，175.3毫克，产率为44.5％。表征为：核磁氢谱1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.97(s,1H,Ar-H),8.57(s,1H,Ar-H),8.58(d,J＝5.7Hz,1H,Ar-H),8.02(d,J＝9.6Hz,Ar-H),7.68(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),7.56(t,J＝14.4Hz,1H,Ar-H),7.42(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),δ7.20(s,1H,Ar-H),3.53(q,J＝6.0Hz,4H,2×CH2),2.50(s,6H,2×CH3).核磁碳谱13C NMR(151MHz,CDCl3)δ(ppm)161.9,151.9,144.9,137.4,130.8,130.2,123.1,117.1,115.8,103.8,44.7,12.4.高分辨质谱HRMS(ESI+)m/z理论值C20H18N2O2 +,[M+Na]+:341.1260,实测值:341.1223。
实施例2
染料1b合成的步骤如下：
取化合物N,N-二乙基对苯二胺5b(1.0毫摩尔，176.16毫克)，化合物5e(1.0毫摩尔，300.0毫克)和三氯化铝(1.0毫摩尔，142.9毫克)溶解于20.0毫升的四氢呋喃中，然后回流3到4个小时，TLC检测反应进度；降至室温后，直接通过旋转蒸发仪除去溶剂，经柱层析(洗脱剂：纯二氯甲烷)分离得到纯净染料1b，橙红色固体，66.8毫克，产率为23％。其表征为：核磁氢谱1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.87(s,1H,Ar-H),8.29(d,J＝6.6Hz,1H,Ar-H),7.91(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H),7.60(d,J＝6.6Hz,Ar-H),7.13(s,1H,Ar-H),6.77(t,J＝6.6Hz,1H,Ar-H),6.56(s,1H,Ar-H),3.46(q,J＝18Hz,8H,4×CH2),1.17(q,J＝6.0Hz,12H,4×CH3).核磁碳谱13C NMR(151MHz,CDCl3)δ(ppm)162.7,153.9,145.5,137.9,129.5,128.3,125.4,123.0,114.8,108.9,104.6,98.1,44.7,12.6.高分辨质谱HRMS(ESI+)m/z理论值：C24H27N3O2 +,[M+H]+:390.2176,实测值:390.2217。
实施例3
染料1c合成的步骤如下：
取化合物1-萘胺5a(1.0毫摩尔，153.6毫克)，化合物5e(1.0毫摩尔，300毫克)和三氯化铝(1.0毫摩尔，142.9毫克)溶解于20.0毫升的四氢呋喃中，然后回流3到4个小时，TLC检测反应进度；降至室温后，直接通过旋转蒸发仪除去溶剂，经柱层析(洗脱剂：纯二氯甲烷)分离得到纯净染料1c，亮黄色固体，123.7毫克，产率41.2％。其表征为：核磁氢谱1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.33(d,J＝5.4Hz,1H,Ar-H),9.01(s,1H,Ar-H),8.53(d,J＝6.9Hz,1H,Ar-H),8.04(d,J＝5.4Hz,Ar-H),7.98(d,J＝6.6Hz,1H,Ar-H),7.84(q,J＝9.0Hz,3H,Ar-H),6.83(d,J＝6.3Hz,1H,Ar-H),6.56(s,1H,Ar-H),3.46(q,J＝5.1Hz,4H,2×CH2),1.16(q,J＝9.9Hz,6H,2×CH3).核磁碳谱13C NMR(151MHz,CDCl3)δ(ppm)162.3,154.7,150.5,149.8,138.9,135.1,130.8,129.7,127.8,127.0,126.1,125.6,124.4,109.1,98.1,45.1,12.5.高分辨质谱HRMS(ESI+)m/z理论值：C24H20N2O2 +，[M+Na]+:391.1417,实测值:391.1433。
实施例4
为了验证苯环的两边对称位置都能进行成环反应，进一步利用化合物对苯二胺5c合成了染料1d。
染料1d合成的一般步骤如下：
取化合物对苯二胺5c(1.0毫摩尔，55.09毫克)，化合物5e(2.0毫摩尔，285.0毫克)和三氯化铝(2.0毫摩尔，135.8毫克)溶解于25.0毫升的四氢呋喃中，然后回流6到7个小时，TLC检测反应进度；降至室温后，直接通过旋转蒸发仪除去溶剂，经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(40/1，v/v))分离得到纯净染料1d，橙黄色固体，108.73毫克，产率21.8％。其表征为：核磁氢谱1H NMR(300MHz,CDCl3-d6)δ(ppm)7.94(d,J＝9.0Hz,1H,Ar-H),7.86(d,J＝9.0,1H,Ar-H),6.88(s,2H,Ar-H),6.75(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H),6.59(d,J＝8.7,2H,Ar-H),6.37(s,2H,Ar-H),3.44(m,8H,4×CH2),1.20(t,J＝14.1Hz,12H,4×CH3).高分辨质谱HRMS(ESI+)m/z理论值：C24H20N2O2 +,[M+H]+:559.2340,实测值:559.4016。
效果对比1
对上述制备的染料1a-1d(浓度为10μM)进行光稳定性测试，首先称取相应质量的染料1a-1d和参照物Cy7，将其分别溶解在乙腈中(浓度为10μM)，用飞利浦碘钨灯(500W)照射所有样品，灯与样品间的距离设为25cm。在灯和样品之间放置一个8cm厚的亚硝酸钠(60克每升)冷阱，以消除热量和短波长光。连续照射6h，其中每半小时进行一次紫外、荧光测试，六小时后，光稳定性根据照射前后不同时间吸收强度的变化来计算剩余吸收率。如图2所示，荧光标记物光稳定性分别是1a：46％，1b：43％，1c：76％，1d：71％，Cy7：5.3％，可以看出染料1a-1d与菁类染料相比有着较高的光稳定性。
效果对比2
对上述制备的染料1a-1d(浓度为10μM)在二氯甲烷中的紫外吸收和荧光发射性质进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度或荧光强度，结果如图3所示。
荧光标记物1a(浓度为10μM)在二氯甲烷中的紫外吸收和荧光发射光谱，如图3所示，荧光标记物1a在452nm处有最大吸收(图3中(a))；荧光标记物1a在532nm处有最高的荧光强度(图3中(e))，此时的激发波长为428nm，狭缝宽度为3nm/3nm。
荧光标记物1b(浓度为10μM)在二氯甲烷中的紫外吸收和荧光发射光谱，如图3所示，荧光标记物1b在473nm处有最大吸收(图3中(b))；荧光标记物1b在562nm处有最高的荧光强度(图3中(f))，此时的激发波长为407nm，狭缝宽度为3nm/3nm。
荧光标记物1c(浓度为10μM)在二氯甲烷中的紫外吸收和荧光发射光谱，如图3所示，荧光标记物1c在375nm处有最大吸收(图3中(c))；荧光标记物1c在546nm处有最高的荧光强度(图3中(g))，此时的激发波长为461nm，狭缝宽度为3nm/3nm。
荧光标记物1d(浓度为10μM)在二氯甲烷中的紫外吸收和荧光发射光谱，如图3所示，荧光标记物1d在429nm处有最大吸收(图3中(d))；荧光标记物1d在495nm处有最高的荧光强度(图3中(h))，此时的激发波长为430nm，狭缝宽度为5nm/3nm。
效果对比3
此外，本发明还测试了荧光标记物1a-1d的细胞毒性。通过使用CCK-8方法测量在这些染料的存在下HeLa细胞的活力。将HeLa细胞分别与不同浓度的染料(2、4、6、8和10μM)孵育6h。如图4所示，荧光标记物1a-1d的细胞毒性测试结果表明：它们具有良好的细胞生存力并且适合用于活细胞成像。
图4中，细胞存活率(％)＝(Asample–Ab)/(Ac–Ab)，其中Ac：阴性对照(包括培养基和细胞，无待测染料添加)，Ab：空白(包括待测染料和培养基，无细胞添加)，Asample：测试组(包括培养基、细胞和待测染料)。
效果对比4
为了测试荧光标记物1a与商用脂滴标记物相比的荧光标记能力，使用二甲基亚砜将荧光标记物1a配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得荧光标记物1a在细胞培养基中的浓度为6μM，随后分别加入脂滴红色标记物Nile Red(100nM)，与HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱共同培养5min(以下实验相同)；然后经PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用405nm激发，收集468-550nm范围内的荧光信号，红光通道使用561nm激发，收集570-750nm范围内的荧光信号。结果如图5所示，其中(a)为明场，(b)为荧光标记物1a的细胞成像图，(c)为脂滴红色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f)为共定位实验，它们的共定位系数为0.95。结果表明，荧光标记物1a的荧光图像与商用线粒体红色标记物NileRed的荧光图像在细胞中的分布情况一致，且强度相近，表明荧光标记物1a在HeLa细胞中具有脂滴标记能力，可作为脂滴绿色标记物。
效果对比5
为了验证荧光标记物1b(6μM)对HeLa细胞脂滴的标记效果，采用的实验方法与上述荧光标记物1a相同，如图5所示，(g)为明场，(h)为荧光标记物1b的细胞成像图，(i)为脂滴红色标记物的细胞成像图，(j)为绿光通道和红光通道的叠加图，(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(l)为共定位实验，它们的共定位系数为0.97。结果表明荧光标记物1b同探针1a一样，在HeLa细胞中都对脂滴具有很好的靶向能力。
效果对比6
荧光标记物1c(5μM)的实验方法与上述荧光标记物1a一样，如图5所示，(m)为明场，(n)为荧光标记物1b的细胞成像图，(o)为脂滴红色标记物的细胞成像图，(p)为绿光通道和红光通道的叠加图，(q)为叠加图中ROI线的荧光强度，(r)为共定位实验，它们的共定位系数为0.85。以上的结果表明荧光标记物1c同探针1a和1b一样，在HeLa细胞中都对脂滴具有很好的靶向能力。
效果对比7
为了验证化合物1d是否与探针1a-1c一样，都可以对HeLa细胞中的脂滴进行荧光成像。对其进行细胞实验，使用二甲基亚砜将荧光标记物1d配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得荧光标记物1d在细胞培养基中的浓度为8μM，与HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱共同培养5min；然后经PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用405nm激发，收集468-550nm范围内的荧光信号，结果发现1d并没有对细胞中的脂滴进行染色，其染色部位类似于线粒体。为了验证这个现象再次进行共定位细胞成像，在原来的细胞培养基中加入线粒体商用红色标记物CMA Ros(100nM)，结果如图5所示，(s)为明场，(t)为荧光标记物1d的细胞成像图，(u)为线粒体红色标记物的细胞成像图，(v)为绿光通道和红光通道的叠加图，(w)为叠加图中ROI线的荧光强度，(x)为共定位实验，它们的共定位系数为0.90。这一现象表明染料1d具有线粒体的标记能力，可以作为线粒体的绿色标记物。
可以看出，本发明首次公开了基于芳香胺类与香豆素类衍生物的成环反应，合成了一系列氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物，可以实现对脂滴以及中性结构对线粒体的荧光成像。本发明在通过一步反应成环之后使化合物在二氯甲烷有机溶剂中具有极强的荧光强度，并且与菁类染料相比具有高的光学稳定性，同时在进一步应用于生物细胞成像时，细胞毒性低，对生物样品损伤小，选择性高且能够快速地对细胞染色且成像。成像结果表明了此类化合物对脂滴或线粒体细胞器具有特异的靶向性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物，其特征在于：所述氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物的结构式如1a-1d中任一所示：
Figure FDA0003911594550000011
2.一种权利要求1所述的氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物的制备方法，其特征在于：所述氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物由芳香胺和香豆素类荧光前体反应合成；
所述芳香胺为1-萘胺、N,N-二乙基对苯二胺或对苯二胺；
所述香豆素类荧光前体为4-氯-3-甲酰基香豆素或7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛。
3.根据权利要求2所述的氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物的制备方法，其特征在于：所述芳香胺和香豆素类荧光前体的摩尔比为1：1-2。
4.根据权利要求2所述的氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物的制备方法，其特征在于：所述芳香胺和香豆素类荧光前体是在催化剂作用下反应合成氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物；所述催化剂为路易斯酸。
5.根据权利要求4所述的氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物的制备方法，其特征在于：所述芳香胺和催化剂的摩尔比为1：1-2。
6.权利要求1所述的氨基取代色烯并喹啉型荧光标记物在制备细胞器荧光标记物中的应用。
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