CN115960110B - 一种高效的光动力光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种高效的光动力光敏剂及其制备方法和应用。为开发出具有线粒体靶向性且具有高的单重态氧量子产率的光敏剂，本发明通过在结构刚性的香豆素半花菁染料(RCHC)结构中安装重原子I，构建了一个高效的光动力光敏剂I‑RCHC。一方面由于该光敏剂的刚性结构大大降低了非辐射跃迁过程，另一方面由于该光敏剂在水中形成的J‑聚集体可以有效降低ΔEST，因此I‑RCHC具有高的单线态氧量子产率；此外，该光敏剂还具有吸收波长位于近红外区、生物兼容性好、线粒体靶向性等优点，光照下对癌细胞的半致死浓度(EC50)为1.5μM，具有潜在的生物应用价值。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高效的光动力光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是近年来发展的一种非破坏性肿瘤治疗方法，具有时空分辨率高、正常组织损伤小、无耐药性、可反复治疗等优势，已在临床得到应用，治疗效果的关键是选择合适的光敏剂(PS)。光动力治疗的基本原理是，在光照条件下，PS吸收光子后从基态跃迁到单重激发态(S1)，然后通过系间窜越(ISC)衰减到三重激发态(T1)，处于三线激发态的光敏剂将激发能传递给周围的氧气分子后(3O2)，导致高活性的单线态氧(1O2)或其他活性氧化物(ROS)的产生，从而杀死癌细胞。实际上，目前最广泛采用的光敏剂构建方法是将重原子(如Br和I)引入到荧光团分子中，利用“自旋-轨道偶合效应(SOC)”(重原子效应)来促进单线态向三线态系间窜越(S1→T1)，从而产生1O2。由于非辐射跃迁是三线态形成的主要竞争过程，因此，向结构相对刚性的荧光染料分子中引入重原子(例如，I)可以最大程度地促进ISC过程，从而导致更高的单重态氧量子产率。此外，近年来发展的“聚集诱导的系间窜越”(AI-ISC)策略可以通过能量分裂效应来减小单线态和三线态的能级间隙(ΔEST)，从而促进系间窜越，因此基于该策略开发的PS通常具有增强的光动力效果。研究表明，线粒体是光动力治疗的重要靶点，线粒体靶向的光敏剂能更加有效地杀死肿瘤细胞。因此，开发出具有线粒体靶向性且具有高的单重态氧量子产率的PS是PDT效果好坏的关键。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种高效的光动力光敏剂及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，采用了下列技术方案：
一种高效的光动力光敏剂，其结构式为：
一种高效的光动力光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将7-羟基久洛尼定(化合物1)和丙二酸二苯酯溶于无水甲苯中反应，反应结束后反应液经过滤、洗涤以及干燥得到黄色固体(化合物2)，无需提纯直接用于下一步反应；
(2)在氮气保护下，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)逐滴滴入三氯氧磷(POCl3)中进行反应，反应结束后得到红色溶液，随后将化合物2的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述红色溶液中继续反应，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中，然后用NaOH溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到红色固体(化合物3)；
(3)在氮气保护下，分别将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(化合物4)、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷(化合物5)、NaHCO3和KI溶解在无水乙腈中搅拌反应，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离后得到化合物6；
(4)依次将化合物3、化合物6、哌啶盐酸盐和哌啶溶解在乙腈中，混合物在剧烈搅拌下回流反应，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂得到粗产品(化合物7)；将粗产品重新溶解在二氯甲烷和浓盐酸的混合溶剂中，混合物反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7，经萃取、干燥后，再经柱色谱分离，得到光动力光敏剂，即I-RCHC。
进一步，所述步骤(1)中7-羟基久洛尼定和丙二酸二苯酯的摩尔比为1：1。
进一步，所述步骤(1)中反应的温度为110℃，反应的时间为8h。
进一步，所述步骤(2)中N,N-二甲基甲酰胺和三氯氧磷体积比为1:1。
进一步，所述步骤(2)中反应的温度为50℃，反应的时间为30min；所述继续反应的条件是在70℃下反应过夜。
进一步，所述步骤(3)中5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI的摩尔比为2：3：4：3。
进一步，所述步骤(3)中反应的温度为95℃，反应的时间为18h，所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇＝9:1(V/V)。
进一步，所述步骤(4)中化合物3、化合物6和哌啶盐酸盐的摩尔比为1：1：1。
进一步，所述步骤(4)中回流反应的时间为12h；所述混合物反应的温度25℃；所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇/三氟乙酸＝400:10:1(V/V/V)。
一种高效的光动力光敏剂的应用，在近红外光照射下产生活性氧化物，从而杀死癌细胞及消融肿瘤的应用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
与目前报道的基于重原子促进系间窜越机理设计的光敏剂相比，本发明提供的光敏剂不仅具有吸收波长位于近红外区、线粒体靶向性等优点，重要的是在水中具有高的单线态氧量子产率。一方面归因于其刚性分子结构有效抑制了C＝C双键异构化引起的非辐射跃迁过程(三线态形成的竞争过程)；另一方面是由于I-RCHC在水中可以以单体(612nm)和J-聚集体(666nm)两种形式存在，J-聚集体可以通过降低单线态(S1)和三线态(T1)的能级间隙(ΔEST)来提高单线态氧量子产率。因此，本发明提供的光敏剂能够在近红外光照射下产生大量活性氧化物，破坏癌细胞的线粒体功能，从而杀死癌细胞，因此具有潜在的生物应用价值。
附图说明
图1为本发明化合物3的NMR图；
图2为本发明化合物6的NMR和HRMS图；
图3为本发明化合物I-RCHC的NMR和HRMS图；
图4为9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)在激光(650nm，1.5mW/cm2)光照下在PBS中捕获光敏剂产生单线态氧的紫外可见吸收光谱变化图，每照射30s记录一次，其中，(A)为ABDA和光敏剂I-RCHC；(B)为ABDA和对比化合物I-CHC；(C)为ABDA和参比化合物MB；(D)为ABDA在380nm处吸光度值随时间的变化图；
图5为A549细胞分别孵化I-RCHC和Mito-Tracker Deep Red后的细胞影像图，对于I-RCHC和Mito-Tracker Deep Red，收集波长分别为570-630nm(λex＝561nm)和640-750nm(λex＝633nm)，标尺:10μm；
图6中，(A)为光敏剂I-RCHC和MB的细胞毒性实验，(黑色)A549细胞用不同浓度(0μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM)的I-RCHC或MB处理1h后，继续孵化24h；(灰色)A549细胞先用不同浓度(0μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM)的I-RCHC或MB处理1h，再用650nm激光(15mW/cm2，15min)照射后继续孵化24h；(B)为负载I-RCHC的A549细胞在非光照/光照(15mW/cm2，15min)条件下的活/死细胞染色实验；对于calcein AM和PI，收集波长分别为490-560nm(λex＝488nm)和570-750nm(λex＝561nm)；(C)为负载I-RCHC和SOSG的A549细胞在非光照/光照(15mW/cm2，15min)条件下的荧光影像图，对于SOSG，收集波长为490-750nm(λex＝488nm),标尺:100μm；(D)为负载I-RCHC的A549细胞在非光照/光照(15mW/cm2，15min)后，继续孵化JC-1(10μM)30min后的荧光影像图，对于白色通道(JC-1的单体)和灰色通道(JC-1的聚集体)，收集波长分别为490-560nm(λex＝488nm)和570-750nm(λex＝561nm)，标尺:20μm；
图7中，(A)为荷瘤裸鼠分别经原位注射PBS(300μL)和I-RCHC(100μM，300μL)后，再用650nm的激光(100mW/cm2,30min)照射后在0天、3天、6天和9天时的照片；(B)和(C)分别为荷瘤小鼠肿瘤体积的变化曲线以及体重的变化曲线。
具体实施方式
实施例1
一种高效的光动力光敏剂，其结构式为：
一种高效的光动力光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将7-羟基久洛尼定(化合物1，27.3mmol)和丙二酸二苯酯(27.5mmol)分别溶于无水甲苯中，混合物在110℃条件下反应8h，反应结束后反应液经过滤、洗涤以及干燥得黄色固体(化合物2)，无需提纯直接用于下一步反应；
(2)在氮气保护下，将DMF(6mL)逐滴滴入POCl3(6mL)中，混合物在50℃条件下反应30min后得到红色溶液，随后将事先溶解在DMF(25mL)中的化合物2逐滴加入到上述红色溶液中，反应液在70℃条件下反应过夜，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中(150mL)，然后用NaOH溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到红色固体，即化合物3(产率83.7％)，图1为化合物3的NMR图；
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ10.28(s,1H),7.45(s,1H),3.42(q,J＝5.4,6.0,4.8Hz,4H),2.89(m,4H),2.01(d,J＝6.0Hz,4H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ187.3,160.3,153.7,151.4,149.6,124.9,120.4,109.6,107.3,105.6,50.4,50.0,27.5,20.9,20.1,20.0.
(3)在氮气保护下，分别将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(化合物4，2.0mmol)、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷(化合物5，3.0mmol)、NaHCO3(4.0mmol)和KI(3.0mmol)溶解在无水乙腈中(30mL)，混合物在95℃条件下搅拌反应18h，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱纯化(展开剂为二氯甲烷/甲醇＝9:1，v/v)后得到化合物6，图2为化合物6的NMR和HRMS图；
1H NMR(600MHz,CD3CN)7.13(m,2H),6.76(t,J＝7.2Hz,1H),6.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.90(t,J＝4.8,4.2Hz,1H),4.00(d,J＝7.8Hz,3H),3.91(s,1H),3.83(s,2H),3.66(t,J＝7.8Hz,7.2Hz,2H),1.93(m,2H),1.32(s,6H).13C NMR(150MHz,CD3CN)161.1,145.7,137.5,127.6,121.8,118.4,105.3,102.3,73.2,64.7,43.9,37.0,29.9,29.3；ESI-MS[M+H]+:calculated for 260.1645,found 260.1645.
(4)依次将化合物3(1mmol)、化合物6(1mmol)、哌啶盐酸盐(1mmol)和几滴哌啶溶解在乙腈中(50mL)，混合物在剧烈搅拌下回流反应12h，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂得粗产品；将粗产品重新溶解在二氯甲烷(50mL)和浓盐酸(15mL)的混合溶剂中，混合物在25℃条件下反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7后经萃取、干燥后得到粗产品，粗产品经柱色谱(体积比为400:10:1的CH2Cl2、MeOH、TFA的混合物)分离得到光动力光敏剂I-RCHC(产率42.2％)，图3为化合物I-RCHC的NMR和HRMS图。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.23(s,1H),8.00(s,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(s,1H),5.55(q,J＝4.8,6.0,5.4Hz,1H),4.62(q,J＝4.8,9.6,4.2Hz,1H),4.20(m,1H),3.44(d,J＝5.4Hz,4H),2.90(t,J＝6.6,5.4Hz,1H),2.75(d,J＝4.8Hz,4H),2.61(m,1H),1.89(d,J＝4.8Hz,4H),1.71(d,J＝7.8Hz,6H)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ173.5,166.0,159.6,152.7,150.9,145.1,141.2,138.7,138.0,132.2,122.2,120.9,115.9,108.7,106.3,100.3,99.8,94.3,72.5,51.3,50.5,49.9,42.7,25.8,25.1,20.8,20.1,19.8；ESI-MS[M+]:calculated for 591.1140,found 591.1135.
对比化合物
一种光动力光敏剂的对比化合物(I-CHC)，其结构式为：
实施例2
1.测试溶液配制
将光敏剂I-RCHC用DMSO(包含2％乙酸)配成2mM的储存液，随后用待测溶剂稀释至测试浓度。
2.单线态氧量子产率的计算
光敏剂I-RCHC及其对比化合物I-CHC在PBS中的单线态氧量子产率，是以MB(在PBS中ΦΔ＝0.52)为参比测定的，计算公式如下：
其中，为参比的单线态氧量子产率，msam与mstd分别为含有I-RCHC/I-CHC或MB的ABDA溶液用激光(650nm，1.5mW/cm2)照射后在380nm处吸光度值与光照时间的拟合曲线的斜率值，Fstd和Fsam通过公式F＝1-10-OD(OD值为650nm处I-RCHC/I-CHC或MB的吸光度值)计算获得。
3.光敏剂体外性能研究
为了验证构象固定可以减少由于C＝C双键异构化引起的非辐射跃迁过程，即本发明开发的光敏剂在光照条件下具有更强的单线态氧产生能力，我们检测了I-RCHC和I-CHC在光照下产生单线态氧的情况，如图4所示。以ABDA为单线态氧捕获剂，MB为参比化合物，650nm(1.5mW/cm2)作为激发光，经计算可得，I-RCHC和其对比化合物I-CHC在PBS中的单线态氧量子产率分别为1.37和0.41，I-RCHC单线态氧量子产率分别是I-CHC和MB的3.3倍和2.6倍。光敏剂I-RCHC单线态氧量子产率的提高，一方面归因于其刚性分子结构有效抑制了C＝C双键异构化引起的非辐射跃迁过程(三线态形成的竞争过程)；另一方面是由于I-RCHC在水中可以以单体(612nm)和J-聚集体(666nm)两种形式存在，J-聚集体可以通过降低单线态(S1)和三线态(T1)的能级间隙(ΔEST)来提高单线态氧量子产率。
4.光敏剂在细胞水平的光动力治疗效果研究
首先，共定位实验说明I-RCHC可以有效的被A549细胞摄入并定位在线粒体中，如图5所示。为了进一步验证光敏剂I-RCHC的生物应用效果，我们通过CCK8实验测试了光敏剂的生物毒性以及光动力治疗效果。A549细胞用不同浓度的I-RCHC/MB孵化1h，对照组置于细胞培养箱内继续培养24h，光照组用650nm的激光(15mW/cm2，15min)照射后置于细胞培养箱内继续培养24h。如图6中A所示，I-RCHC在1-5μM范围内具有可接受的暗度性，其光毒性随着浓度的增大逐渐增大，光照下半致死浓度(EC50)为1.5μM，远低于MB的光照半致死浓度(10μM)。I-RCHC在光照下产生的细胞毒性也可以被钙黄绿素AM/碘化丙啶(PI)双染实验证实，如图6中B所示；使用商业化的单线态氧荧光探针(SOSG)我们证实I-RCHC在光照下在细胞内产生了大量的1O2，如图6中C所示；使用商业化的线粒体膜电位探针(JC-1)我们证实I-RCHC在光照下诱导了严重的线粒体去极化，如图6中D所示。综上所述，光敏剂I-RCHC在光照下可通过产生1O2损害线粒体功能，从而导致细胞死亡。
5.光敏剂在活体中的光动力治疗效果研究
最后，我们评估了I-RCHC在荷瘤裸鼠体内的PDT疗效。荷瘤裸鼠被分为PBS/光照组和I-RCHC/光照组，荷瘤裸鼠的肿瘤部位分别经原位注射PBS和I-RCHC后，再用650nm(100mW/cm2)的激光照射30分钟。如图7中A所示，PBS/光照组中荷瘤鼠的肿瘤随着时间推移明显增大，说明PBS加光照对于肿瘤的生长没有抑制作用；相反，I-RCHC/光照组中荷瘤鼠的肿瘤随着时间推移逐渐消融并在光照9天后基本消失，光动力治疗过程中肿瘤体积的变化同样验证了I-RCHC优良的光动力效果，如图7中B所示。此外，在光动力治疗期间，所有荷瘤裸鼠的体重均未明显下降，如图7中C所示，这表明I-RCHC具有良好的生物相容性和可忽略的副作用。上述结果说明，I-RCHC在活体中仍然具有优异的PDT功效，这主要归功于其长激发波长、J聚集状态下高1O2生成能力和线粒体靶向特性。
综上所述，本发明通过在结构刚性的香豆素半花菁染料(RCHC)结构中安装重原子I，构建了一个高效的光动力光敏剂I-RCHC。一方面由于该光敏剂的刚性结构大大降低了非辐射跃迁过程，另一方面由于该光敏剂在水中形成的J-聚集体可以有效降低ΔEST，因此I-RCHC具有高的单线态氧量子产率(1.37)；此外，该光敏剂还具有吸收波长位于近红外区、生物兼容性好、线粒体靶向性等优点，光照下对癌细胞的半致死浓度(EC50)为1.5μM，具有潜在的生物应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高效的光动力光敏剂，其特征在于，所述光动力光敏剂的结构式为：
2.一种权利要求1所述高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将7-羟基久洛尼定和丙二酸二苯酯溶于无水甲苯中反应，反应结束后反应液经过滤、洗涤以及干燥得到化合物2，无需提纯直接用于下一步反应；
(2)在氮气保护下，将N,N-二甲基甲酰胺逐滴滴入三氯氧磷中进行反应，反应结束后得到红色溶液，随后将化合物2的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述红色溶液中继续反应，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中，然后用NaOH溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到化合物3；
(3)在氮气保护下，将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI溶解在无水乙腈中搅拌反应，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离后得到化合物6；
(4)依次将化合物3、化合物6、哌啶盐酸盐和哌啶溶解在乙腈中，混合物在剧烈搅拌下回流反应，反应结束后反应液冷却至室温，旋干溶剂得粗产品；将粗产品重新溶解在二氯甲烷和浓盐酸的混合溶剂中，混合物反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7，经萃取、干燥后，再经柱色谱分离，得到光动力光敏剂；
所述化合物2的结构式为：
所述化合物3的结构式为：
所述化合物6的结构式为：
3.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中7-羟基久洛尼定和丙二酸二苯酯的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应的温度为110℃，反应的时间为8h。
5.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中N,N-二甲基甲酰胺和三氯氧磷体积比为1:1。
6.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应的温度为50℃，反应的时间为30min；所述继续反应的条件是在70℃下过夜反应。
7.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI的摩尔比为2：3：4：3。
8.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应的温度为95℃，反应的时间为18h；所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇，体积比为9:1。
9.根据权利要求2所述的一种高效的光动力光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中化合物3、化合物6和哌啶盐酸盐的摩尔比为1：1：1；所述回流反应的时间为12h；所述混合物反应的温度25℃；所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇/三氟乙酸，体积比为400:10:1。
10.一种权利要求1所述高效的光动力光敏剂的应用，其特征在于，用于制备杀死癌细胞及消融肿瘤的药物。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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