CN115785112B - 一种香豆素半花菁类光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法和应用。为解决经典的香豆素半花菁染料所构建的光敏剂通常存在单线态氧效率低的问题，本发明基于结构刚性的香豆素半花菁染料开发光敏剂，本发明开发的光敏剂RCHC‑I不仅具有吸收波长长、生物兼容性好等优点，重要的是其在PBS中可以以聚集态形式存在，因此单线态氧量子收率得到大大提高，此外，该光敏剂能够在近红外光照射下产生大量活性氧化物，从而杀死癌细胞，因此具有潜在的生物应用价值。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种香豆素半花菁类光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是近年来发展并临床应用的一种新型癌症治疗手段，其基本原理是利用光敏剂(PS)吸收的光能将氧气(3O2)转化为高活性的单线态氧(1O2)，从而杀死癌细胞；其特点是无耐药性、可反复治疗、时空分辨率高。然而，目前临床使用的光敏剂主要是卟啉及其衍生物，该类光敏剂的1O2产生效率低、肿瘤靶向性差，仅对少数几个癌症的治疗有效。除了卟啉及其衍生物，目前最广泛采用的光敏剂构建方法是在荧光团分子结构中引入重原子，利用重原子强的“自旋-轨道偶合效应(SOC)”(重原子效应)来促进单线态向三线态系间窜越(S1→T1)，从而促进1O2的产生。
香豆素半花菁染料(CHCs)是目前应用非常广泛的荧光染料平台之一，该染料具有激发和发射波长长、Stokes位移大、生物兼容性好等特点，因此被广泛用于光动力光敏剂的设计。由于该染料在光激发下容易发生C＝C键顺反异构化诱导的非辐射跃迁，因此基于该染料构建的光敏剂通常存在单线态氧效率低的问题；然而，由于通过非辐射跃迁散失能量的途径被有效抑制，基于结构刚性的香豆素半花菁染料(RCHCs)开发的光敏剂的单线态氧转化效率有望大大提高。
发明内容
针对上述问题，本发明基于结构刚性的香豆素半花菁染料(RCHCs)，提供了一种香豆素半花菁类光敏剂及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种香豆素半花菁类光敏剂，所述光敏剂的结构式为：
一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)逐滴滴入三氯氧磷(POCl3)中进行反应，反应结束后得到黄色溶液，随后将4-羟基-7-二乙氨基香豆素(化合物1)的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述黄色溶液中继续反应，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中，然后用NaOH溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素(化合物2)；
(2)在氮气保护下，分别将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(化合物3)、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷(化合物4)、NaHCO3和KI溶解在无水乙腈中搅拌反应，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离后得到化合物5；
(3)依次将4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素(化合物2)、化合物5、哌啶盐酸盐和哌啶溶解在乙腈中，在剧烈搅拌下回流反应，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂后得到中间体(化合物6)；将中间体重新溶解在二氯甲烷和浓盐酸的混合溶剂中，继续反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7，经萃取、干燥后，再经柱色谱分离，得到所述光敏剂，即RCHC-I。
进一步，所述步骤(1)中N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷和4-羟基-7-二乙氨基香豆素体的体积摩尔比为2.8mL：2.8mL：10mmol。
进一步，所述步骤(1)中反应的温度为50℃，反应的时间为30min；所述继续反应的条件是在60℃下反应过夜。
进一步，所述步骤(2)中5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI的摩尔比为2：3：4：3。
进一步，所述步骤(2)中搅拌反应的温度为95℃，反应的时间为18h，所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇＝9:1(V/V)。
进一步，所述步骤(3)中4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素、化合物5和哌啶盐酸盐的摩尔比为1：1：1，所述二氯甲烷和浓盐酸的体积比为50mL：15mL。
进一步，所述步骤(3)中回流反应的温度为82℃，时间为12h；所述继续反应的温度25℃；所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷/甲醇/三氟乙酸＝400:10:1(V/V/V)。
一种香豆素半花菁类光敏剂的应用，在近红外光照射下产生活性氧化物，从而杀死癌细胞的应用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
与基于经典香豆素半花菁染料构建的光敏剂相比，本发明提供的光敏剂由于其刚性结构有效抑制了C＝C双键异构化引起的非辐射跃迁过程(三线态形成的竞争过程)，以及在PBS中可以以聚集态形式存在，因此在PBS中的单线态氧量子收率得到大大提高；此外，该光敏剂具有吸收波长位于近红外区、生物兼容性好等优点。因此，本发明提供的光敏剂能够在近红外光照射下产生大量活性氧化物，从而杀死癌细胞，因此具有潜在的生物应用价值。
附图说明
图1为本发明化合物2的NMR图；
图2为本发明化合物5的NMR和HRMS图；
图3为本发明化合物RCHC-I的NMR和HRMS图；
图4为紫外可见吸收光谱的变化图，其中(A)为MB/DPBF、CHC-I/DPBF和RCHC-I/DPBF的乙腈溶液在光照条件下(1.5mW/cm2，650nm)的紫外可见吸收光谱的变化图，(B)为MB/ABDA、CHC-I/ABDA和RCHC-I/ABDA的PBS溶液在光照条件下(1.0mW/cm2，650nm)的紫外可见吸收光谱的变化图；
图5中为光敏剂RCHC-I的细胞毒性实验，(黑色)A549细胞用不同浓度(0μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM)的RCHC-I处理1h后，继续孵化24h；(灰色)A549细胞先用不同浓度(0μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM)的RCHC-I处理1h，再用650nm激光(15mW/cm2，15min)照射后，继续孵化24h。
具体实施方式
实施例1
一种香豆素半花菁类光敏剂，其结构式为：
一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，将DMF(2.8mL)逐滴滴入POCl3(2.8mL)中，在50℃下反应30min，反应结束后得到黄色溶液，随后将4-羟基-7-二乙氨基香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述黄色溶液中，在60℃下继续反应过夜，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中，然后用NaOH(质量分数为20％)溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素(化合物2，产率为88.2％)，图1为化合物2的NMR图；
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ10.31(s,1H),7.87(d,J＝9.6Hz,1H),6.72(d,J＝9.6Hz,1H),6.46(s,1H),3.51(q,J＝6.6,7.2,7.2Hz,4H),1.29(t,J＝7.2Hz,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ187.1,160.0,156.5,154.2,153.7,129.3,111.0,110.6,107.7,96.6,45.4,12.5.
(2)在氮气保护下，分别将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(化合物3，2.0mmol)、2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷(化合物4，3.0mmol)、NaHCO3(4.0mmol)和KI(3.0mmol)溶解在无水乙腈中，在95℃下搅拌反应18h，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离(展开剂为二氯甲烷/甲醇＝9:1，v/v)后得到化合物5(产率为29.2％)，图2为化合物5的NMR和HRMS图；
1H NMR(600MHz,CD3CN)7.13(m,2H),6.76(t,J＝7.2Hz,1H),6.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.90(t,J＝4.8,4.2Hz,1H),4.00(d,J＝7.8Hz,3H),3.91(s,1H),3.83(s,2H),3.66(t,J＝7.8Hz,7.2Hz,2H),1.93(m,2H),1.32(s,6H).13CNMR(150MHz,CD3CN)161.1,145.7,137.5,127.6,121.8,118.4,105.3,102.3,73.2,64.7,43.9,37.0,29.9,29.3；ESI-MS[M+H]+:calculatedfor260.1645,found260.1645.
(3)依次将化合物2(1mmol)、化合物5(1mmol)、哌啶盐酸盐(1mmol)和几滴哌啶溶解在乙腈中(50mL)，在剧烈搅拌下回流反应12h，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂后得到中间体；将中间体重新溶解在二氯甲烷(50mL)和浓盐酸(15mL)的混合溶剂中，在25℃下继续反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7，经萃取、干燥后，再经柱色谱分离(展开剂为二氯甲烷/甲醇/三氟乙酸＝400:10:1，V/V/V)，得到所述光敏剂RCHC-I(产率22.0％)，图3为化合物RCHC-I的NMR和HRMS图。
1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.87(d,J＝5.4Hz,2H),7.65(t,J＝1.2,7.8Hz,1H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H),6.85(d,J＝9.0Hz,1H),5.63(m,1H),4.61(m,1H),4.27(m,1H),4.15(m,1H),3.48(d,J＝6.6Hz,4H),2.90(m,1H),1.65(t,J＝15.0,10.8Hz,6H),1.14(s,6H)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ174.2,166.6,159.7,157.9,154.7,145.2,141.0,138.3,138.0,132.0,131.9,129.1,126.8,116.3,111.4,109.6,101.0,99.9,97.4,94.9,72.7,65.5,63.1,51.4,45.3,43.9,43.0,31.8,31.6,30.4,29.3,27.2,25.6,19.0,14.0,12.8；ESI-MS[M+]:calculatedfor567.1140,found567.1140.
实施例2
1.单线态氧量子产率的计算
RCHC-I和CHC-I在乙腈或PBS中的单线态氧量子产率，是分别以DPBF和ABDA为单线态氧捕获剂，以MB(在乙腈中ΦMB＝0.57，在PBS中ΦMB＝0.52)为参比测定的，计算公式如下：
其中，ΦMB为MB的单线态氧量子产率，k为含有RCHC-I/CHC-I或MB的DPDF/ABDA溶液在激光照射后414nm/380nm处吸光度值与光照时间拟合的曲线的斜率值，F通过公式F＝1-10-OD(OD值为RCHC-I、CHC-I或MB在650nm处的吸光度值)计算获得。
2.细胞毒性
用CCK-8细胞增殖实验研究RCHC-I的细胞光/暗毒性。简单地说，首先将贴壁生长的A549细胞用胰蛋白酶消化为细胞悬液，然后将细胞以每孔8.0×103个细胞的密度接种于96孔板中，用100μL培养基孵育过夜至细胞贴壁。然后向96孔板中加入RCHC-I的储液，保持终浓度为0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM，细胞孵化光敏剂1小时后用PBS清洗三次，再经非光照或光照15分钟，继续培养24小时，随后弃去旧培养基，更换含10％CCK-8的新鲜培养基，继续孵育0.5h后，用SpectraMax 190读板机测定450nm处的吸光度。对照组及测试组均重复6次。
3.体外单线态氧效率测试
为了验证本发明开发的光敏剂RCHC-I的光动力效果，我们首先在体外检测了其在光照下产生单线态氧的能力，并以CHC-I作为对比化合物。
对比化合物(CHC-I)，其结构式为：
如图4中(A)所示，在乙腈中，以DPBF为单线态氧捕获剂，MB为参比化合物(ΦMB＝0.57)，650nm(1.5mW/cm2)作为激发光，经计算可得，RCHC-I和其对比化合物CHC-I的单线态氧量子产率分别为0.07和0.03，说明RCHC-I的刚性结构抑制了C＝C双键异构化引起的非辐射跃迁过程(三线态形成的竞争过程)，从而增加了S1态到T1态的系间窜越效率。
如图4中(B)所示，为了进一步模拟生物环境，我们测试了光敏剂RCHC-I在PBS中的单线态氧产生效率，并以ABDA为单线态氧捕获剂，MB为参比化合物(ΦMB＝0.52)，650nm(1.0mW/cm2)作为激发光，经计算可得，RCHC-I和其对比化合物CHC-I的单线态氧量子产率分别为0.005和0.38，与CHC-I相比，RCHC-I在PBS的单线态氧量子产率增加了76倍；通过观察紫外可见光谱，可以发现RCHC-I在PBS中除了单体峰(580nm)外，还有一个H聚集峰(520nm)和一个J聚集峰(620nm)，文献报道显示，聚集可以增加轨道裂分，从而降低单线态(S1)和三线态(T1)的能级间隙(ΔEST)来提高单线态氧量子产率。
4.光敏剂在细胞水平的光动力治疗效果研究
我们通过CCK8实验测试了光敏剂RCHC-I在细胞水平的生物毒性以及光动力治疗效果。如图5所示，当用激光照射预先负载了不同浓度的RCHC-I的A549细胞后，细胞的存活率随着RCHC-I浓度的增大逐渐减小，说明光敏剂RCHC-I在光照下可以杀死癌细胞。
综上所述，本发明基于结构刚性的香豆素半花菁染料(RCHC)，利用“自旋-轨道偶合效应(SOC)”(重原子效应)策略，构建了一个光动力光敏剂I-RCHC。该光敏剂可以在近红外光的照射下产生大量单线态氧，单线态氧效率为0.38；此外，该光敏剂也可以在近红外光的照射下杀死癌细胞，因此具有潜在的生物应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种香豆素半花菁类光敏剂，其特征在于，所述光敏剂的结构式为：
。
2.一种权利要求1所述香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在氮气保护下，将N,N-二甲基甲酰胺逐滴滴入三氯氧磷中进行反应，反应结束后得到黄色溶液，随后将4-羟基-7-二乙氨基香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述黄色溶液中继续反应，反应结束后，将反应液冷却至室温并倾倒入水中，然后用NaOH溶液调节pH至大量固体生成，得到的固体经过滤、洗涤以及干燥后得到4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素；
（2）在氮气保护下，分别将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-（2-溴乙基）-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI溶解在无水乙腈中搅拌反应，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂，粗产品经柱色谱分离后得到化合物5；
（3）依次将4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素、化合物5、哌啶盐酸盐和哌啶溶解在乙腈中，在剧烈搅拌下回流反应，反应结束后，冷却至室温，旋干溶剂后得到中间体；将中间体重新溶解在二氯甲烷和浓盐酸的混合溶剂中，继续反应至TLC监测原料反应完全，反应结束后旋干二氯甲烷，剩下的酸溶液用Na2CO3水溶液调节pH至6-7，经萃取、干燥后，再经柱色谱分离，得到所述光敏剂；
所述化合物5的结构式为：；
所述中间体的结构式为：。
3.根据权利要求2所述香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷和4-羟基-7-二乙氨基香豆素的体积摩尔比为2.8 mL：2.8mL：10mmol。
4.根据权利要求2所述的一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应的温度为50℃，反应的时间为30min；所述继续反应的条件是在60℃下反应过夜。
5.根据权利要求2所述的一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、2-（2-溴乙基）-1,3-二恶烷、NaHCO3和KI的摩尔比为2：3：4：3。
6.根据权利要求2所述的一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中搅拌反应的温度为95℃，反应的时间为18h，所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为9: 1。
7.根据权利要求2所述的一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中4-氯-7-二乙氨基-3-醛基香豆素、化合物5和哌啶盐酸盐的摩尔比为1：1：1，所述二氯甲烷和浓盐酸的体积比为50 mL：15 mL。
8.根据权利要求2所述的一种香豆素半花菁类光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中回流反应的温度为82℃，时间为12h；所述继续反应的温度25℃；所述柱色谱分离的展开剂为二氯甲烷、甲醇和三氟乙酸，其体积比为400:10:1。
9.一种权利要求1所述香豆素半花菁类光敏剂的应用，其特征在于，应用在制备杀死癌细胞的药物中。
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