CN107850601A

CN107850601A - 染料化合物

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Publication number: CN107850601A
Application number: CN201680041283.1A
Authority: CN
Inventors: 宋主满; 闵善基; 李承受; 李道民; 朴庆和; 黄文赞; 申峰基; 诸淙台
Original assignee: Samsung Mobile Display Co Ltd
Current assignee: SFC Co Ltd; Samsung Display Co Ltd
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-07-18
Also published as: WO2017010852A1; US20180203015A1; US10473666B2; JP2018530630A; CN107850601B; JP6815038B2; EP3309552A1; EP3309552B1; EP3309552A4; KR20170009795A; KR102502117B1

Abstract

本发明涉及由说明书中描述的[式I]和[式II]表示的染料化合物。本发明的染料化合物与现有的花青染料相比具有显著提高的量子效率并且发射出强荧光。由于这些优势，本发明的染料化合物可以在各种领域中应用，例如作为其中需要光学成像的用于各种生物系统的探针。特别地，本发明的染料化合物可用作能够标记和跟踪线粒体的染色体示踪剂。因此，本发明的染料化合物可以用于使线粒体能够在活组织或细胞中定量地成像。此外，本发明的染料化合物可用作检测活细胞的pH的pH探针。

Description

染料化合物

技术领域

本发明涉及染料化合物，并且更具体地涉及具有优异的光学性质例如量子产率、荧光强度和光稳定性，具有高的水溶性并且能够与生物分子结合或者在生物分子中保持其优异的光学性质的新染料化合物。

背景技术

荧光是生物科学中用于跟踪或分析生物分子的最常用的非破坏性方法。虽然一些发光的蛋白质和发光分子是已知，但是通常需要发光染料的标记来对蛋白质、核酸、脂质和小分子进行光学跟踪和分析。可通过分析各种化学和光学性质的变化来获得生物科学领域中的有用信息，包括发光性质的简单变化、基于发光性质的变化的成像、能量瞬变、由周围环境变化引起的发光性质的变化、以及由化学反应的结构变化引起的发光性质的变化。

这些现象的分析系统包括荧光显微镜，共焦显微镜，流式细胞仪，微阵列和用于细胞观察的聚合酶链反应系统，用于核酸和蛋白质分离的电泳系统，实时生物成像系统，免疫测定系统，DNA测序系统，PCR测定系统，用于核酸和蛋白质的诊断试剂盒和装置，以及用于图像引导手术的诊断和治疗系统，例如内窥镜。目前正在不断开发和改进新应用和多个更精确和更易分析的系统。

要求用于分析技术的合适荧光染料在介质(即存在生物分子的水溶性介质)中具有高亮度，在各种pH条件下的稳定性、光稳定性以及与荧光系统匹配的激发和发射波长特性。作为满足这些要求的荧光染料，广泛已知的是基于苍耳烷(Xanthane)的荧光素和罗丹明以及基于聚甲炔的花青衍生物。特别地，广泛使用的具有花青生色团的荧光染料属于典型染料的类别。

目前已知的具有吲哚羰花青、吲哚二羰花青和吲哚三羰花青骨架的羰花青具有高的摩尔消光系数但荧光量子产率低。据报道由于这个缺点，这些羰花青在与生物分子偶联之后表现出低亮度。

因此，为了解决这个问题，有必要通过发射更强的荧光能够获得有效光学图像的新染料。

自1856年以来，聚甲炔花青染料在染料的各种应用领域中一直处于未受挑战的位置。对于这个主题，每年都发表在不同领域中的许多应用。

通用的花青染料由两个氮中心组成，其中一个带正电荷，并且由奇数个碳原子的共轭链连接到另一个氮原子上。已经作为“推-挽(Push-pull)”烯烃研究了这一特征并且形成包含链霉菌聚甲炔(streptopolymethine)单元作为发色团的聚甲炔染料的基础。根据链霉菌甲炔(streptomethine)单元的电荷，这些染料分类如下。

阳离子链霉菌聚甲炔花青和半花青染料(1)、阴离子链霉菌聚甲炔-氧杂青(oxonol)染料(2)、中性链霉菌聚甲炔-部花青染料(3)、和两性离子基于方酸的花青染料(4)：

通常地，染料具有稳定形式的全反式几何结构。有时，这些染料经历光致异构化。这些物种的形成可以通过使用各种技术如闪光光解、瞬态吸收和皮秒时间分辨的光谱来研究。这些染料已被广泛用作卤化银摄影和带隙半导体材料中的光谱敏化剂，光盘中的记录介质，在用于捕获太阳能的工业涂料中，作为激光材料，在光合作用的捕光系统中作为光折射材料，作为抗肿瘤剂，以及作为生物系统的探针。

通常地，上述染料颜色深，这是由于它们的高摩尔消光系数所致，但具有低量子产率的致命缺点。原因在于，旋转、平移和振动模式的花青染料通过非辐射过程而不是通过荧光过程而失去其激发态能量(D.F.O’Brien,T.M.Kelly和L.F.Costa(1974).ExcitedstateProperties of some Carbocyanine dyes and the energy transfer mechanism ofspectral sensitisation.Photogr.Sci.Eng.18(1),76-84.)。因此，为了减少这种荧光损失，本发明的发明人设计了具有刚性聚甲炔链的花青染料，以实现大大增加荧光量子产率。

商业上可用的染色体示踪剂(mitotracker)染料由于它们带正电荷而能够选择性地与细胞内线粒体结合，由于它们高的荧光亮度和突出的光稳定性而适合用作染色体示踪剂，并且通过简单的线粒体标记孵育而被充分地染色。

然而，在随后的实验中需要将细胞固定在试剂例如甲醛中的操作。然而，在该操作中，一些商业上可用的染色体示踪剂不能保持其荧光。

以下染色体示踪剂商业上购自Thermo Fisher Scientific：

MitoTracker：染色体示踪剂

因此，本发明的发明人试图开发即使在固定之后荧光也保持稳定的染料，并且设计发射各种波长的荧光的染料，使得用户可以选择发射所需波长的染色体示踪剂。

具有窄带宽的发射各种波长的荧光的材料被认为是重要的因素，因为它们的荧光在与其他探针的荧光波长重叠时难以对其进行分析。因此，本发明的发明人旨在开发具有各种波长的染色体示踪剂。

细胞内pH或细胞溶质pH的测量将极大地促进细胞功能的鉴定(Methods Mol Biol637,311(2010)；Nanotechnology 24,365(2013))。另一方面，许多细胞功能，如离子稳态、活性氧物质平衡、细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移，可以通过改变细胞内pH来测量(Circulation 124,1806(2011)；Yonsei Med J 6,473(1995)；J Bacteriol 185,1190(2003))。

使用pH检测探针测量细胞内pH。因此，本发明的发明人旨在开发其荧光强度响应于pH改变而变化的染料，并且使用该染料作为能够基于该pH依赖性行为测量活细胞pH值的pH探针。

发明内容

技术问题

因此，本发明涉及提供可以发射更强荧光以获得有效光学图像的新染料。

此外，本发明还涉及提供即使在固定之后荧光也保持稳定的染料以及被设计成发射各种波长的荧光的染料，使得用户可以选择发射期望波长的染色体示踪剂。

此外，本发明还涉及提供其荧光强度响应于pH改变而变化，并且可以用作测量活细胞的pH的pH探针的染料。

技术方案

本发明的一个方面提供了由式I或式II表示的染料化合物。

[式I]

[式II]

式I和式II中的取代基的限定在下文中进行详细地描述。

本发明的另一方面提供了用染料化合物标记靶标物质的方法，包括将染料化合物结合至靶标物质。

有益效果

与现有的花青染料相比，本发明的染料化合物显着提高了量子产率并发出强的荧光。由于这些优点，本发明的染料化合物可以在各个领域找到应用，例如作为需要光学成像的各种生物系统的探针。

特别地，本发明的染料化合物可用作能够标记和跟踪线粒体的染色体示踪剂。因此，本发明的染料化合物可用于对活组织和细胞中的线粒体定量成像。此外，本发明的染料化合物可用作测量活细胞的pH的pH探针。

附图说明

图1a是用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图1b是用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图1c是用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

图1d是用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

图1e示出了用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG和用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度随着D/P比变化。

图1f比较了式1的化合物与Alexa568的生物活性。

图2a是用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图2b是用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图2c是用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

图2d是用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

图2e示出了用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG和用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度随着D/P比变化。

图2f比较了式3的化合物与Alexa594的生物活性。

图3a是用式50的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图3b示出了用式50的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG与用Alexa546标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度亮度随着D/P比变化。

图3c比较了式44的化合物与Alexa546的生物活性。

图4a是用式110的化合物标记的Raw 264.7细胞的图像，其在552nm的激发波长和560nm至600nm的发射波长下获得。

图4b是用Mitotracker GreenFM(MTG)标记的Raw 264.7细胞的图像，其在488nm的激发波长和470nm至520nm的发射波长下获得。

图4c是图4a和图4b的合并图像。使用LAS AF软件计算皮尔逊共定位系数(A＝0.73)。

图5示出了用式110的化合物(1.0μM)染色HeLa A431细胞的三个区域A、B和C的荧光强度，其以2秒为间隔测量3500秒。

图6a是用式97的化合物标记的HeLa A431细胞的图像，其在552nm的激发波长和571nm至650nm的发射波长下获得。

图6b是用Mitotracker Green FM(MTG)标记的HeLa A431细胞的图像，其在488nm的激发波长和498nm至540nm的发射波长下获得。

图6c是图6a和图6b的合并图像。

图7示出了用式III至式2的化合物(1.0μM)染色HeLa A431细胞的三个区域A、B和C的荧光强度，其以2秒为间隔测量3500秒。

图8示出了用Cy3B(1.0μM)染色HeLa A431细胞的两个区域A和B的荧光强度，其在比较实验例1中以2秒为间隔测量2000秒。

图9和图10示出了式111的化合物和式97的化合物分别作为pH探针的特性。

图11示出了式97、式100、式101和式102的化合物在PBS缓冲液和乙醇中的双光子作用谱。

最佳实施方案

下文中，将更详细地描述本发明。

本发明涉及具有新结构的染料化合物，其具有显着提高的荧光量子产率，并被设计为发射强荧光以获得有效的光学图像，因此可用作各种生物系统的探针。

本发明的一个方面涉及由式I和式II表示的新染料化合物：

[式I]

在式I中，

Ar₁为任选地经选自以下的一个或更多个取代基取代的C₆-C₂₀芳基或C₂-C₂₀杂芳基：氢、氘、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的芳氧基烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烷氧基烷基、卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，所述烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、芳氧基、芳氧基烷基、烷氧基和烷氧基烷基任选地进一步经选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，

E各自为CR₁或N，

Z₁为NR₂R₃、OR₄或SR₅，

X为O、S、NR₈R₉、SiR₁₀R₁₁、CR₁₂R₁₃或Se，

Y为CR₁₄R₁₅、NR₁₆、O、S、Se、SiR₁₇R₁₈或CR₁₉R₂₀＝CR₂₁R₂₂，

W为CR₂₃R₂₄、CR₂₅R₂₆＝CR5₂₇R₂₈、O、-[CR₂₉R₃₀-CR₃₁R₃₂]-或-[CR₃₃R₃₄-O]-，

R₂₃至R₃₄彼此相同或不同并且各自独立地为氢、氘、烷基或丙烯酰氧基，并且两个相邻的取代基任选地彼此连接以形成脂环族烃，

R₁至R₃中的两个任选地与两个相邻取代基形成脂环族烃环或者单环或多环芳族烃环，并且所述脂环族烃环或芳族烃环的碳原子任选地被选自以下的取代基替代：N、S、O、Se、Te、Po、NR₃₅、SiR₃₆R₃₇、GeR₃₈R₃₉、PR₄₀和BR₄₁，

R₁至R₂₂和R₃₅至R₄₁彼此相同或不同并且各自独立地选自氢、氘、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的芳氧基烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烷氧基烷基、卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，所述烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、芳氧基、芳氧基烷基、烷氧基和烷氧基烷基任选地进一步经选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，并且

A^-为有机离子或无机离子，以及

[式II]

其中Ar₁、E、X、Y、W和R₁如式I中限定的，Z₂为NR₆、O、S或O⁺R₇，并且R₆和R₇如式I中限定的。

A^-为有机离子或无机离子，考虑到染料在有机溶剂中的溶解性和稳定性，式I和式II中的A^-没有特别限制且适当地根据期望的应用选择。式I和式II中的A^-可为阴离子，根据需要也可以为由A⁺表示的阳离子。

通常地，式I和式II中的A^-可为选自六氟磷酸根离子、卤素离子、磷酸根离子、高氯酸根离子、高碘酸根离子、六氟化锑离子、六氟酒石酸根离子、氟硼酸根离子、和四氟硼酸根离子的无机酸阴离子，选自硫氰酸根离子、苯磺酸根离子、萘磺酸根离子、对甲苯磺酸根离子、烷基磺酸根离子、苯羧酸根离子、烷基羧酸根离子、三卤代烷基羧酸根离子、烷基磺酸根离子、三卤代烷基磺酸根离子、和烟酸的有机酸根离子，或者选自联苯二硫醇、硫代双酚螯合物和双二醇-α-二酮的金属化合物的离子。或者，式I和式II中的A^-还可为选自钠离子和钾离子的金属离子或季铵离子。

根据本发明的一个实施方案，式I和式II中的A^-可选自卤素离子-SO₄ ^2-、-S₂O₃ ^2-、-SO^3-、-ClO^4-、-BF^4-、-PF^6-、-SbF^6-、-BiCl^5-、-AsF^6-、-SbCl^6-、-SnCl^6-、-COO^-、-HSO^4-、-SO₃CH^3-、Na⁺、K⁺、季铵离子、乙酸根离子、丙酸根离子、氰酸根离子及其组合。根据阳离子的数量和经取代的阴离子的数量，式I和式II中的A^-可以存在或不存在。

由式I和式II表示的染料化合物各自可包含可以与靶标物质结合的一个或更多个反应性取代基。由式I和式II表示的染料化合物各自可包含一个或更多个极性带电取代基。极性带电取代基的存在增加了染料化合物在水中的溶解性，防止了荧光染料分子之间的相互作用，并防止了染料对各种标记物的不期望的标记。

根据一个优选的实施方案，至少一个取代基可以与具有一个或更多个取代基(例如，胺、硫醇、醇、醛和酮基团)的靶标物质缔合。

靶标物质可选自例如，生物分子、纳米颗粒和有机化合物，但不限于此。具体地，靶标物质可为：抗体；抗原；脂质；蛋白质；肽；碳水化合物；葡聚糖；脂肪酸；磷脂；脂多糖；包含或衍生为包含一个或更多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基、硫醇、磷酸和硫代磷酸基的核苷酸或寡核苷酸；包含或衍生为包含一个或更多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基、硫醇、磷酸酯和硫代磷酸酯基的氧聚核苷酸或脱氧聚核苷酸；微生物；药物；激素；细胞；细胞膜；毒素；及其组合。

反应性取代基的具体实例包括活性酯、羧基、酰胺基、丙烯酰胺基、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰基卤、炔烃、胺、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳基卤化物、氮丙啶、硼酸盐/酯、重氮烷、环氧化物、卤铂酸盐、卤代三嗪、亚氨酸酯、异氰酸酯、甲硅烷基卤化物、磺酸酯、磺酰基卤化物、琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、酸酐、酰卤、异硫氰酸酯、乙烯基砜、二氯三嗪、卤代乙酰胺、马来酰亚胺、碳二亚胺、亚磷酰胺、肼和酰肼。优选地，反应性取代基为羧酸的琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺和卤代乙酰胺等。

活性酯由-COR’表示，其中R’表示本领域已知的取代反应的良好离去基团并且可为例如，琥珀酰亚胺氧基(-OC₄H₄O₂)，磺基琥珀酰亚胺氧基(-OC₄H₃O₂-SO₃H)，-1-氧基苯并三唑基(-OC₆H₄N₈)，任选包含一个或更多个吸电子基团如硝基、卤素、氰基和卤代烷基的芳氧基，或者通过由形成酸酐(-OCOR_a或-OCNR_aNHR_b)的碳化二亚胺活化的羧酸，其中R_a或R_b为C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。

此外，反应性取代基R_x可以共价结合至各种连接基团L以形成R_X-L-结构。

所述连接基团是单键或者包含选自碳(C)、氮(N)、氧(O)和硫(S)原子的具有1至20个连接原子的直链或支化链。所述连接基团还可为脂族烃环、芳族烃环、杂脂族环或杂芳族环。所述连接基团可具有正(+)电荷或带负(-)电荷。

根据本发明，由式I和式II表示的染料化合物可以是选自式1至式113中的任一者，然而，根据本发明的式I和式II的染料化合物的范围不限于式1至式113的化合物。

本发明的染料化合物具有对细胞内线粒体进行选择性染色和成像的能力。由于这种能力，本发明的染料化合物可以用作能够标记和追踪线粒体的探针(即染色体示踪剂)。

特别地，本发明的染料化合物可以被设计为发射各种波长的荧光，使得使用者可以选择和使用发射期望波长的荧光的任何染料化合物作为染色体示踪剂。具有不同波长的染色体示踪剂是必要的原因是选择性设计发射具有窄带宽的各种波长的荧光的染色体示踪剂被认为是商业上非常重要的因素，因为它们的荧光在与其他探针的荧光波长重叠时难以对其进行分析。

根据本发明的染料化合物的荧光强度响应于细胞内pH改变而变化。基于这种pH-依赖性行为，本发明的染料化合物可以用作pH探针，并且甚至在细胞内pH传感器中用于测量细胞内pH值。

使用本发明的染料化合物测量细胞内pH和细胞溶质pH能够直接或间接鉴定细胞功能，例如离子稳态、反应性氧物种平衡、细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移。

特别地，可以选择本发明的染料化合物，以在pH 2-6的酸性条件下或者在pH 8-12的碱性条件下发射强荧光。这种选择性使用使得染料化合物作为pH探针更有用。

本发明的染料化合物可用于其中需要pH测量的各种应用领域，不仅包括通过细胞染色进行pH测量的方法，而且还包括最近使用平板读取器进行的细胞pH测量的方法。

具体实施方式

下文中，将对用于合成本发明的染料化合物的具体方法进行说明。将参照以下实例和比较实验进行更详细地说明本发明。然而，这些实例仅仅是举例说明而不旨在限制本发明的范围。

合成例1：由式1表示的化合物的合成

(1)由式1-a表示的化合物的合成

通过反应1-1合成由式1-a表示的化合物。

向200mL的乙醇中添加2-甲基乙酰乙酸乙酯(23.5g，163mmol)和6-溴己酸乙酯(40.0g，179mmol)。向混合物这逐滴添加液体乙醇钠。将所得的混合物在80℃下搅拌10h。在反应完成之后，滤出固体并在减压下对滤液进行蒸馏。剩余物用二氯甲烷和2N盐酸溶液萃取。有机层用无水硫酸钠处理、过滤并在减压下蒸馏(47.7g)。在除去溶剂之后，添加300mL的水。将混合物在回流下搅拌10h。在反应完成之后，反应溶液用二氯甲烷萃取，用硫酸钠处理，过滤并在减压下蒸馏(25g，71％)。

LC-MS：m/z＝185.84[M+]

(2)由式1-b表示的化合物的合成

通过反应1-2合成由式1-b表示的化合物。

将对肼基苯磺酸(20g，106mmol)和由式1-a表示的化合物(其通过反应1-1合成)(59.4g，319mmol)添加至6N盐酸溶液(30mL)和乙醇(60mL)的混合物中。将所得的混合物在回流下搅拌12h。使反应混合物冷却至室温并过滤所得的固体。所述固体用乙酸乙酯洗涤并在减压下干燥。向氢氧化钾(1.4g，25.4mmol)的35mL丙醇溶液中逐滴添加所述固体(5.1g，21.2mmol)的35mL甲醇溶液。其后，将所得的溶液在室温下搅拌12h。过滤固体、干燥并通过C18反相色谱使用水/甲醇纯化(11.1g，30％)。

LC-MS：m/z＝404.86[M+]

(3)由式1-c表示的化合物的合成

通过反应1-3合成由式1-c表示的化合物。

在反应器中于室温下氮气流下将由式1-b表示的化合物(其通过反应1-2合成)(3.0g，7.4mmol)与乙醇一起搅拌，向混合物中逐滴添加48％的盐酸溶液(10.0mL)。在1h之后，将反应溶液在减压下蒸馏。向反应器中添加乙腈(120.0mL)、乙酸(3.0mL)和丙烯醛二乙基缩醛(17.3g，133.0mmol)。使混合物在70℃下反应2h。将反应溶液在减压下蒸馏并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(1.2g，30％)。

LC-MS：m/z＝496.96[M+]

(4)由式1-d表示的化合物合成

通过反应1-4合成由式1-d表示的化合物。

将3-氨基苯酚(5.0g，4.5mmol)和1，3-丙磺酸内酯(0.56g，4.6mmol)添加到正丁醇中并在回流下搅拌30分钟。将反应溶液冷却至室温并搅拌过夜。过滤所得的反应溶液以分离灰色固体。将固体用甲醇洗涤(0.8g，80％)。

LC-MS：m/z＝231.30[M+]

(5)由式1-e表示的化合物的合成

通过反应1-5合成由式1-e表示的化合物。

将由式1-d表示的化合物(其通过反应1-4合成)(1g，4.3mmol)和1，3-丙磺酸内酯(0.54g，4.4mmol)与5mL的N，N-二甲基甲酰胺在130℃下搅拌2h。将反应溶液冷却至室温，在减压下蒸馏并且通过反相色谱纯化(1.48g，95％)。

LC-MS：m/z＝353.19[M+]

(5)由式1-f表示的化合物的合成

通过反应1-6合成由式1-f表示的化合物。

在反应器中将由式1-e表示的化合物(其通过反应1-5合成)(3.0g，8.0mmol)放入N,N-二甲基甲酰胺(1.3g，8.0mmol)中。使反应在50℃下进行12h。在反应完成之后，用水稀释反应混合物并中和。在除去溶剂之后，反应混合物通过反相色谱纯化(0.8g，25％)。

LC-MS：m/z＝380.84[M+]

(5)由式1表示的化合物的合成

通过反应1-7合成由式1表示的化合物。

将由式1-c表示的化合物(其通过反应1-3合成)(1.0g，1.9mmol)和由式1-f表示的化合物(其通过反应6合成)(0.8g，1.9mmol)溶解在20mL的乙醇中。将溶液在80℃下搅拌8h。在反应完成之后，将反应混合物在减压下浓缩以除去溶剂。将浓缩物溶解在50mL的氯仿中并且向其中逐滴添加1mL的50％硫酸。用二氯甲烷稀释混合物并用水萃取。在减压下对有机层进行浓缩并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(0.4g，51％)。

LC-MS：m/z＝739.79[M+]

合成例2：由式2表示的化合物的合成

(1)由式2-a表示的化合物的合成

通过反应2-1合成由式2-a表示的化合物。

将2-甲基乙酰乙酸乙酯(23.5g，163mmol)和6-溴己酸乙酯(40.0g，179mmol)添加到200mL的乙醇中并且向其中逐滴添加液体乙醇钠。将混合物在80℃下搅拌10h。在反应完成之后，滤出固体并在减压下对滤液进行蒸馏。剩余物用二氯甲烷和2N盐酸溶液萃取。有机层用无水硫酸钠处理、过滤并在减压下蒸馏(47.7g)。在除去溶剂之后，添加300mL的水，然后回流10h。在反应完成之后，反应溶液用二氯甲烷萃取。萃取物用硫酸钠处理、过滤并在减压下蒸馏(25g，71％)。

LC-MS：m/z＝185.84[M+]

(2)由式2-b表示的化合物的合成

通过反应2-2合成由式2-b表示的化合物。

将苯基肼基盐酸盐(5.0g，34.6mmol)和由式2-a表示的化合物(通过式2-1合成)(32.2g，173mmol)添加到6N盐酸溶液(30mL)和乙醇(60mL)的混合物中。将所得的混合物在回流下搅拌12h。在冷却至室温之后，向反应溶液中逐滴添加乙酸乙酯。滤出沉淀的固体。将滤液在减压下进行蒸馏并且通过硅胶柱色谱纯化以获得为液体的期望化合物(3.2g，61％)。

LC-MS：m/z＝296.89[M+]

(3)由式2-c表示的化合物的合成

通过反应2-3合成由式2-c表示的化合物。

在反应器中于室温下氮气流下将由式2-b表示的化合物(其通过反应2-2合成)(3.0g，7.4mmol)与乙醇一起搅拌并且向其中逐滴添加48％的盐酸溶液(10.0mL)。在1h之后，将反应溶液在减压下进行蒸馏。向反应器中添加乙腈(120.0mL)、乙酸(3.0mL)和丙烯醛二乙基缩醛(17.3g，133.0mmol)。使混合物在70℃下反应2h。将反应溶液在减压下进行蒸馏并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(1.2g，30％)。

LC-MS：m/z＝418.01[M+]

(4)由式2表示的化合物的合成

通过反应2-4合成由式2表示的化合物。

将由式2-c表示的化合物(其通过反应2-3合成)(1.0g，1.9mmol)和9-甲酰基-8-羟基久洛尼定(0.8g，1.9mmol)溶解在20mL的乙醇中。将溶液在80℃下搅拌8h。在反应完成之后，在减压下对反应溶液进行浓缩以除去溶剂。将浓缩物溶解在50mL的氯仿并且向其中逐滴添加1mL的50％硫酸。混合物用二氯甲烷稀释并用水萃取。萃取物在减压下蒸馏并且剩余物通过硅胶柱色谱纯化(0.3g，40％)。

LC-MS：m/z＝496.91[M+]

合成例3：由式3表示的化合物的合成

(1)由式3-a表示的化合物的合成

通过反应3-1合成由式3-a表示的化合物。

将2-甲基乙酰乙酸乙酯(23.5g，163mmol)和6-溴己酸乙酯(40.0g，179mmol)添加到200mL的乙醇中并且向其中逐滴添加液体乙醇钠。将混合物在80℃下搅拌10h。在反应完成之后，滤出固体并在减压下对滤液进行蒸馏。剩余物用二氯甲烷和2N盐酸水溶液萃取。有机层用无水硫酸钠处理、过滤并在减压下蒸馏(47.7g)以除去溶剂。向剩余物中添加300mL的水，然后在回流下搅拌10h。在反应完成之后，反应溶液用二氯甲烷萃取，用硫酸钠处理，过滤并在减压下蒸馏(25g，71％)。

LC-MS：m/z＝185.84[M+]

(2)由式3-b表示的化合物的合成

通过反应3-2合成由式3-b表示的化合物。

将对肼基苯磺酸(20g，106mmol)和由式3-a表示的化合物(在反应3-1中合成)(59.4g，319mmol)添加到6N盐酸水溶液(30mL)和乙醇(60mL)的混合物中。将所得的混合物在回流下搅拌12h。将反应溶液冷却至室温。过滤所得的固体，用乙酸乙酯洗涤，并在减压下干燥。向氢氧化钾(1.4g，25.4mmol)在35ml的丙醇中的溶液中逐滴添加固体(5.1g，21.2mmol)的30mL甲醇溶液。其后，将所得的溶液在室温下搅拌12h。过滤固体，干燥并通过C18反相色谱使用水/甲醇纯化(11.1g，30％)。

LC-MS：m/z＝404.86[M+]

(3)由式3-c表示的化合物的合成

通过反应3-3合成由式3-c表示的化合物。

在反应器中于室温下氮气流下将由式3-b表示的化合物(其通过反应3-2合成)(3.0g，7.4mmol)与乙醇一起搅拌并且向其中逐滴添加48％盐酸水溶液(10.0mL)。在1h之后，将反应溶液在减压下进行蒸馏。向反应器中添加乙腈(120.0mL)、乙酸(3.0mL)和丙烯醛二乙基缩醛(17.3g，133.0mmol)。使反应在70℃下进行2h。将反应溶液在减压下进行蒸馏并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(1.2g，30％)。

LC-MS：m/z＝496.96[M+]

(4)由式3-d表示的化合物的合成

通过反应3-4合成由式3-d表示的化合物。

将7-甲氧基-2，2，4-三甲基-1，2-氢化喹啉(10.0g，49mmol)和1，3-丙烷砜(6.6g，54mmol)在145℃下搅拌3h。在反应完成之后，反应混合物使用二氯甲烷和甲醇通过柱色谱纯化(10.0g，63％)。

LC-MS：m/z＝325.01[M+]

(5)由式3-e表示的化合物的合成

通过反应3-5合成由式3-e表示的化合物。

将由式3-d表示的化合物(其通过反应3-4合成)(10.0g，31mmol)放在反应器中并且向其中逐滴添加磺酸(9.8mL)。将混合物搅拌30分钟。在0℃下向反应混合物中逐滴添加20.0％发烟硫酸(3.9mL)。使反应进行48h。在反应完成之后，将反应混合物添加到冷水中，用氢氧化钠中和，并由乙醇再结晶(11.0g，88％)。

LC-MS：m/z＝404.88[M+]

(6)由式3-f表示的化合物的合成

通过反应3-6合成由式3-f表示的化合物。

在氢气氛下室温下，将由式3-e表示的化合物(其通过反应3-5合成)(12.0g，30.0mmol)、10％ Pd/C(0.9g)和120mL的甲醇搅拌12h。滤出所得的固体。将滤液在减压下进行蒸馏并由乙醇再结晶(11.5g，95％)。

LC-MS：m/z＝406.78[M+]

(7)由式3-g表示的化合物的合成

通过反应3-7合成由式3-g表示的化合物。

在反应器中105℃下，将由式3-f表示的化合物(其通过反应3-6合成)(12.0g，29.0mmol)、碘化钠(11.0g，74.0mmol)和溴化氢(72.0g，174.0mmol)搅拌12h。在反应完成之后，反应混合物用碳酸氢钠水溶液中和。除去溶剂并且将晶体用水/丙酮/乙醇沉淀。晶体由甲醇/丙酮再结晶并用丙酮洗涤(3.0g，27％)。

LC-MS：m/z＝392.93[M+]

(8)由式3-h表示的化合物的合成

通过反应3-8合成由式3-h表示的化合物。

在反应器中将由式3-g表示的化合物(其通过反应3-7合成)(3.0g，8.0mmol)放在N,N-二甲基甲酰胺(1.3g，8.0mmol)中。使反应在50℃下进行12h。在反应完成之后，反应混合物用水稀释并中和。在除去溶剂之后，晶体用甲醇/丙酮沉淀。晶体由乙醇再结晶(0.8g，25％)。

LC-MS：m/z＝420.74[M+]

(9)由式3表示的化合物的合成

通过反应3-9合成由式3表示的化合物。

将由式3-c表示的化合物(其通过反应3-3合成)(1.0g，1.9mmol)和由式3-h表示的化合物(其通过反应8合成)(0.8g，1.9mmol)溶解在20mL的乙醇中。将溶液在80℃下搅拌8h。在反应完成之后，将反应溶液在减压下浓缩以除去溶剂。将浓缩物溶解在50mL的氯仿中并向其中逐滴添加1mL的50％硫酸。混合物用二氯甲烷稀释并用水萃取。将有机层在减压下浓缩并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(0.4g，51％)。

LC-MS：m/z＝780.01[M+]

(10)由式36，3-NHS表示的化合物的合成

由式3-NHS表示的化合物通过下面的反应合成。

将由式3表示的化合物(其通过反应3-9合成)、(0.24g，0.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(0.03g，0.03mmol)和N,N-二环己基碳二亚胺(0.054g，0.03mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(1ml)中。将溶液在室温下搅拌1h。在反应完成之后，反应溶液通过HPLC(RaininDynamaxC18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(0.15g，56.6％)。

合成例4：由式4表示的化合物的合成

(1)由式4-a表示的化合物的合成

通过反应4-1合成由式4-a表示的化合物。

在反应1-2中，使用对肼基苯磺酸(20g，106mmol)和3-甲基-2-丁酮(27.48g，319mmol)合成由式4-a表示的化合物(11.1g，30％)。

LC-MS：m/z＝277.02[M+]

(2)由式4-b表示的化合物的合成

通过反应4-2合成由式4-b表示的化合物。

在反应1-3中，使用通过反应4-1合成的由式4-a表示的化合物进行合成(5.0g，34.0％)。

LC-MS：m/z＝408.12[M+]

(3)由式4-c表示的化合物的合成

通过反应4-3合成由式4-c表示的化合物。

将3-甲氧基-N-甲基苯胺(10.0g，73.0mmol)和6-溴己酸(17.1g，87.5mmol)在回流下与100mL的N，N-二甲基甲酰胺一起搅拌。在反应完成之后，反应溶液通过柱色谱纯化(13.6g，74.3％)。

LC-MS：m/z＝252.15[M+]

(4)由式4-d表示的化合物的合成

通过反应4-4合成由式4-d表示的化合物。

在反应3-7，使用通过反应4-4合成的由式4-d表示的化合物进行合成(5.1g，45.6％)。

LC-MS：m/z＝238.14[M+]

(5)由式4-e表示的化合物的合成

通过反应4-5合成由式4-e表示的化合物。

在反应1-6中，使用通过反应4-5合成的由式4-e表示的化合物进行合成(2.0g，35.1％)。

LC-MS：m/z＝266.13[M+]

(6)由式4-f表示的化合物的合成

通过反应4-6合成由式4-f表示的化合物。

在反应1-7中，使用通过反应4-2合成的由式4-b表示的化合物和通过反应4-5合成的由式4-e表示的化合物进行合成(0.46g，23.5％)。

LC-MS：m/z＝525.20[M+]

(7)由式4表示的化合物的合成

通过反应4-7合成由式4表示的化合物。

将由式4-b表示的化合物(其通过反应4-2合成)(1.0g，1.9mmol)溶解在1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，向其中添加0.5ml的膦酰氯，然后加热。向混合物中添加2-氨基乙烷-1，1-二磺酸。在室温下搅拌之后，反应混合物通过柱色谱纯化(0.2g，15.2％)。

LC-MS：m/z＝696.14[M+]

合成例5：由式5表示的化合物的合成

(1)由式5-a表示的化合物的合成

通过反应5-1合成由式5-a表示的化合物。在反应4-3中，使用7-甲氧基-2，2-4-三甲基-1，2-二氢化喹啉进行合成(15.0g，52.6％)。

LC-MS：m/z＝318.20[M+]

(2)由式5-b表示的化合物的合成

通过反应5-2合成由式5-b表示的化合物。

在反应3-5中，使用通过反应5-1合成的由式5-a表示的化合物进行合成(13.0g，65.0％)。

LC-MS：m/z＝420.14[M+]

(3)由式5-c表示的化合物的合成

通过反应5-3合成由式5-c表示的化合物。

在反应3-7中，使用通过反应5-2合成的由式5-b表示的化合物进行合成(7.2g，56.0％)。

LC-MS：m/z＝406.12[M+]

(4)由式5-d表示的化合物的合成

通过反应5-4合成由式5-d表示的化合物。

在反应3-8中，使用通过反应5-3合成的由式5-c表示的化合物进行合成(2.5g，30％)。

LC-MS：m/z＝434.12[M+]

(5)由式5表示的化合物的合成

通过反应5-5合成由式5表示的化合物。

在反应4-6中，使用通过反应4-2合成的由式4-b表示的化合物和通过反应5-4合成的由式5-d表示的化合物进行合成(0.51g，32.0％)。

LC-MS：m/z＝693.18[M+]

合成例6：由式6表示的化合物的合成

(1)由式6-a表示的化合物的合成

通过反应6-1合成由式6-a表示的化合物。在反应1-3中，使用2，3，3-三乙基假吲哚进行合成(10.0g，62.5％)。

LC-MS：m/z＝261.16[M+]

(2)由式6-b表示的化合物的合成

通过反应6-2合成由式6-b表示的化合物。在反应4-3中，使用间茴香胺进行合成(8.1g，42.1％)。

LC-MS：m/z＝238.14[M+]

(3)由式6-c表示的化合物的合成

通过反应6-3合成由式6-c表示的化合物。

将通过反应6-2合成的由式6-b表示的化合物(5.0g，21.0mmol)、1-氯-3-甲基-2-丁烷(5.2g，25.3mmol)、碳酸钾(3.5g，25.3mol)和5mL的乙腈在回流下搅拌。在反应完成之后，反应溶液通过柱色谱纯化(4.0g，62.0％)。

LC-MS：m/z＝306.20[M+]

(4)由式6-d表示的化合物的合成

通过反应6-4合成由式6-d表示的化合物。

将通过反应6-3合成的由式6-c表示的化合物(4.0g，13.1mmol)和4.0ml的甲磺酸在回流下搅拌。在反应完成之后，中和反应溶液，萃取并通过柱色谱纯化(3.0g，75.2％)。

LC-MS：m/z＝306.20[M+]

(5)由式6-e表示的化合物的合成

通过反应6-4合成由式6-e表示的化合物。

在反应3-7中，使用通过反应6-4合成的由式6-d表示的化合物进行合成(2.5g，87.3％)。

LC-MS：m/z＝292.18[M+]

(6)由式6-f表示的化合物的合成

通过反应6-5合成由式6-f和式6-g表示的化合物。

在反应3-8中，使用通过反应6-4合成的化合物来合成由式6-f表示的化合物(0.84g，31.8％)和由6-g表示的化合物(0.56g，21.2％)。

LC-MS：m/z＝320.4[M+]

(7)由式6表示的化合物的合成

通过反应6-6合成由式6表示的化合物。

在反应1-7中，使用由式6-a表示的化合物(其通过反应6-1合成)和由式6-f表示的化合物(其通过反应6-5合成)进行合成(0.35g，32.0％)。

LC-MS：m/z＝500.30[M+]

合成例7：由式7表示的化合物的合成

(1)由式7表示的化合物的合成

通过反应6-6合成由式7表示的化合物。

在反应1-7中，使用由式6-a表示的化合物(其通过反应6-1合成)和由式6-g表示的化合物(其通过反应6-5合成)进行合成(0.24g，35.0％)。

LC-MS：m/z＝500.30[M+]

合成例8：由式44表示的化合物的合成

(1)由式8-a表示的化合物的合成

通过反应8-1合成由式8-a表示的化合物。

[反应8-1]

[式8-a]

将2-甲基乙酰乙酸乙酯(23.5g，163mmol)和6-溴己酸乙酯(40.0g，179mmol)在200ml的乙醇中搅拌并向其中逐滴添加液体乙醇钠。将混合物在80℃下搅拌10h。在反应完成之后，滤出固体。将滤液在减压下进行蒸馏并用二氯甲烷和2N盐酸水溶液萃取。有机层用无水硫酸钠处理并在减压下进行蒸馏(47.7g)。在除去溶剂之后，添加300ml的水，然后在回流下搅拌10h。在反应完成之后，反应溶液用二氯甲烷萃取，用硫酸钠处理，并在减压下蒸馏(25g，71％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝10.85(1H，s)，2.52(1H，m)，2.36(2H，m)2.30(3H，s)，1.65(4H，m)，1.35(4H，m)，1.09(3H，d)

(2)由式8-b表示的化合物的合成

通过反应8-2合成由式8-b表示的化合物。

[反应8-2]

[式8-b]

将苯基肼基盐酸盐(8.6g，75mmol)和由式8-a表示的化合物(42g，225mmol)添加到86ml的乙醇中并向其中添加21.5ml的盐酸。将混合物在回流下搅拌12h。使反应混合物冷却至室温并向其中添加50ml的乙酸乙酯。过滤所得的固体，用乙酸乙酯洗涤，并在减压下干燥。剩余物用二氯甲烷和2N氢氧化钠水溶液萃取。将有机层在减压下干燥并通过硅胶柱色谱纯化(8.5g，40％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝7.92(1H，q)，7.51(2H，m)，7.42(1H，q)，4.09(2H，q)，2.82(3H，s)，2.18(2H，t)，2.12(2H，m)，1.97(2H，m)，1.49(3H，s)，1.46(2H，m)，1.26(2H，m)，1.23(3H，t)，0.73(2H，m).

(3)由式8-c表示的化合物的合成

通过反应8-3合成由式8-c表示的化合物。

[反应8-3]

[式8-c]

在反应器中于室温下氮气流下将8g(28mmol)的由式8-b表示的化合物(其通过反应8-2合成)在400ml的乙醇中搅拌并向其中逐滴添加48％的盐酸水溶液(80ml)。在1h之后，将反应溶液在减压下进行蒸馏。向反应器中添加乙腈(320ml)、乙酸(8ml)和丙烯醛二乙基缩醛(65.72g，505mmol)。使混合物在70℃下反应2h。将反应溶液在减压下进行蒸馏并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％。

(4)由式8-d表示的化合物的合成

通过反应8-4合成由式8-d表示的化合物。

[反应8-4]

[式8-d]

将2g(4.7mmol)的由式8-c表示的化合物(其通过反应8-3合成)和0.58g(4.7mmol)的2,4-二羟基苯醛在20ml的乙醇中在回流下搅拌3h。将反应溶液冷却至室温，减压下蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化。向粗产物中添加10ml的氯仿和1ml的50％硫酸水溶液。将混合物在室温下搅拌20分钟。用2N氢氧化钠溶液将反应混合物调整至pH 7至8，用氯甲烷萃取并通过硅胶柱色谱纯化(0.3g，15％)。

(5)由式44表示的化合物的合成

通过反应8-5合成由式44表示的化合物。

[反应8-5]

[式44]

将0.3g(0.67mmol)的由式8-d表示的化合物(其通过反应8-4合成)添加到1.3ml的乙腈并且向其中添加1.3ml的6N盐酸溶液。将混合物搅拌12h。用2N氢氧化钠溶液将反应溶液调整至pH 7至8，减压下蒸馏，并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液纯化(90mg，32％)。

¹H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝8.28(1H，s)，7.68(2H，m)，7.61(2H，m)，7.48(1H，d)，6.58(1H，d)，6.40(1H，s)，5.42(1H，m)，6.70(1H，m)，4.30(1H，m)，2.87(1H，m)，2.54(1H，m)，2.14(2H，m)，1.80(2H，m)，1.29(3H，s)，0-3(6H，m)

合成例9：由式45表示的化合物的合成

(1)由式9-a表示的化合物的合成

以与反应8-2相似的方式，通过反应9-1合成由式9-a表示的化合物。

[反应9-1]

[式9-a]

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝7.92(2H，dd)，7.81(1H，d)，7.76(1H，d)，7.49(1H，t)，7.39(1H，t)，4.01(2H，q)，2.38(1H，m)2.32(3H，s)，2.04(2H，t)，1.97(1H，m)，1.47(3H，s)，1.35(2H，m)，1.16(3H，t)，1.07(2H，m)，0.58(1H，m)，0.39(1H，m)

(2)由式9-b表示的化合物的合成

通过反应9-2合成由式9-b表示的化合物。

[反应9-2]

[式9-b]

在180℃下，将10g(30mmol)的由式9-a表示的化合物(其通过反应9-1合成)在5ml的硫酸溶液中搅拌2h。在冷却至室温之后，将反应溶液倒入冰中并且向其中缓慢添加5ml的50％氢氧化钠溶液。在室温下搅拌24h之后，滤出所得的沉淀物并向滤液中添加5ml的硫酸钠饱和水溶液。过滤所得的沉淀物并由水再结晶两次。将所得的固体在真空下干燥(8g，60％)。

(3)由式9-c表示的化合物的合成

以与反应8-3相似的方式，通过反应9-3合成由式9-c表示的化合物。

[反应9-3]

[式9-c]

(4)由式9-d表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应9-4合成由式9-d表示的化合物。

[反应9-4]

[式9-d]

(5)由式45表示的化合物的合成

通过反应9-5合成由式45表示的化合物。

[反应9-5]

[式45]

在40℃下，将0.3g(30mmol)的由式9-d表示的化合物(其通过反应9-4合成)在1ml的硫酸溶液中搅拌2h。将反应溶液冷却至室温并倒入冰中。向反应溶液中缓慢地逐滴添加50％氢氧化钠溶液直到为中性。混合物通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％。

¹H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝8.13(2H，m)，7.97(3h，m)，7.72(2H，m)，5.48(1H，m)，4.65(1H，m)4.43(1H，m)，2.98(1H，m)，2.61(1H，m)，2.44(1H，m)，2.24(1H，m)，1.77(3H，d)，1.70(2H，m)，0.85(4H，m)0.46(1H，m)，-0.01(1H，m)

合成例10：由式46表示的化合物的合成

由式46表示的化合物通过以下反应合成：

将由式44表示的化合物(其通过反应8-5合成)(0.5g，0.138mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.08g，0.069mmol)和N，N-二环己基碳二亚胺(0.142g，0.069mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(1ml)中。将溶液在室温下搅拌1h。在反应完成之后，反应溶液通过HPLC(RaininDynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％(0.38g，60.0％)。

合成例11：由式47表示的化合物的合成

(1)由式11-a表示的化合物的合成

以与反应8-3相似的方式，通过反应11-1合成由式11-a表示的化合物。

[反应11-1]

[式11-a]

(2)由式11-b表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应11-2合成由式11-b表示的化合物。

[反应11-2]

[式11-b]

¹H NMR(400MHz.MeOD)：δ＝7.90(1H，s)，7.45(2H，m)，7.25(2H，m)，7.00(1H，d)，6.31(1H，d)，5.15(1H，m)，4.36(1H，m)，3.92(1H，m)，2.78(1H，m)，2.41(1H，m)，1.73(6H，d)

(3)由式47表示的化合物的合成

通过反应11-3合成由式47表示的化合物。

[反应11-3]

[式47]

在50℃下在氮气流下将0.3g(1mmole)的由式11-b表示的化合物(其通过反应11-2合成)和0.1g(2mmole)的氢氧化钾在3ml的乙醇中搅拌30分钟。向反应混合物中添加0.3g(1mmole)的5-碘戊酸乙酯。将混合物在回流下搅拌3h。在反应完成之后，将反应溶液在减压下浓缩并且通过HPLC(Rainin Dynamax C18，8μm柱)使用水/乙腈(0.1％三氟乙酸)作为显影液以20mL/分钟的速率纯化60分钟，纯化至10％至100％。

M+＝448.2，¹H NMR(400MHz，D₂O)：δ＝8.28(1H，s)，7.55-7.80(4H，m)，7.31(1H，s)，6.60(1H，s)，5.51(1H，s)，4.74(1H，m)，4.08(1H，m)，2.94(1H，m)，2.66(1H，m)，1.82(6H，d)，1-4.5(10H，m)

合成例12：由式48表示的化合物的合成

(1)由式12-a表示的化合物的合成

以与反应8-3相似的方式，通过反应12-1合成由式12-a表示的化合物。

[反应12-1]

[式12-a]

(2)由式48表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应12-2合成由式48表示的化合物。

[反应12-2]

[式48]

¹H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝7.40(1H，s)，8.37(1H，d)，8.20(1H，d)，8.13(1H，d)，7.84(1H，d)，7.77(1H，t)，7.67(1H，t)，7.49(1H，dd)，6.59(1H，dt)，6.41(1H，s)，5.46(1H，m)，4.82(1H，m)，4.42(1H，m)，2.92(1H，m)，2.60(1H，m)，2.10(2H，m)，2.01(2H，t)，1.29(3H，s)，1.33(2H，m)，1.11(2H，m)，0.84(1H，m)，0.43(1H，m)

合成例13：由式49表示的化合物的合成

(1)由式49表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应13-1合成由式49表示的化合物。

[反应13-1]

[式49]

¹H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝8.39(1H，s)，8.33(1H，d)，8.1/(1H，dd)，8.09(IH，d)，7.83(1H，dd)，7.74(1H，t)，7.64(1H，t)，7.54(1H，dd)，6.70(1H，dt)，6.56(1H，m)，5.46(1H，m)，4.84(1H，m)，4.41(1H，m)，3.86(3H，s)，3.70(1H，m)，2.90(2H，m)，2.63(3H，m)，1.94(2H，t)，1.25(3H，s)，1.07(2H，t)，0.80(1H，m)，0.40(1H，m)

合成例14：由式50表示的化合物的合成

(1)由式50表示的化合物的合成

以与反应9-5相似的方式，通过反应14-1合成由式50表示的化合物。

[反应14-1]

[式50]

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.62(1H，s)，8.40(1H，m)，8.31(1H，m)，8.37(1H，d)，7.99(1H，dd)，7.92(1H，d)，8.05(1H，s)，6.43(1H，s)，5.48(1H，m)，4.84(1H，m)，4.42(1H，m)，2.80(5H，m)，2.58(1H，m)，1.98(3H，s)，1.95(2H，t)，1.20(1H，m)，1.04(1H，m)，0.76(1H，m)，0.25(1H，m)

合成例15：由式51表示的化合物的合成

(1)由式15-a表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应15-1合成由式50-a表示的化合物。

[反应15-1]

[式15-a]

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝10.15(1H，s)，7.80(1H，s)，7.66(1H，s)，7.36(2H，m)，7.28(1H，d)，7.12(1H，d)，5.97(1H，s)，5.12(1H，m)，4.25(1H，m)，3.93(1H，m)，2.73(1H，m)，2.33(1H，m)，1.68(3H，s)，1.63(3H，s)

(2)由式15-b表示的化合物的合成

通过反应15-2合成由式15-b表示的化合物。

[反应15-2]

[式15-b]

在室温下将5g(36mmole)的4-氨基苯甲酸和19.03g(195mmole)的硫氰酸钾在70ml的乙酸中搅拌50分钟。在0℃下向混合物中缓慢地逐滴添加2.06ml(40mmole)的溴。将所得混合物在室温下搅拌24h。在70℃至80℃下，将反应溶液在200ml的水中搅拌1.5h。减压下过滤反应混合物。在0℃下通过添加铵溶液将滤液调整至pH 6并且在减压下过滤。干燥过滤的固体。

(3)由式15-c表示的化合物的合成

通过反应15-3合成由式15-c表示的化合物。

[反应15-3]

[式15-c]

在室温下，将20g的氢氧化钾在60ml的水中搅拌30分钟。向反应混合物中添加9.4g的由式15-b表示的化合物(其通过反应15-2合成)。在120℃下，将所得的混合物在回流下避光搅拌24h。通过添加盐酸将反应混合物调整至pH 4并过滤。所得的固体用水洗涤若干次并干燥。

(4)由式51表示的化合物的合成

通过反应15-4合成由式51表示的化合物。

[反应15-4]

[式51]

在80℃至90℃下，将0.2g(0.58mmole)的由式15-a表示的化合物(其通过反应15-1合成)、0.69g(0.69mmole)的由式15-c表示的化合物(其通过反应15-3合成)和0.011g(0.058mmole)的对甲苯磺酸在二甲基甲酰胺中搅拌24h。在反应完成之后，添加水。所得的混合物在减压下过滤，用水洗涤若干次并干燥。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝12.85(1H，s)，8.78(1H，s)，8.74(1H，s)，8.04(1H，m)，7.80(1H，q)，7.57(1H，m)，7.44(1H，d)，7.08(1H，d)，6.59(1H，s)，5.44(1H，q)，4.68(1H，q)，4.23(1H，m)，2.78(1H，m)，2.26(1H，m)，1.78(6H，d).

合成例16：由式52表示的化合物的合成

(1)由式16-a表示的化合物的合成

通过反应16-1合成由式16-a表示的化合物。

[反应16-1]

[式16-a]

将15.1g(0.1mole)的4-氨基苯基乙酸和10.5g(0.1mol)的碳酸钠在120ml的水中搅拌10分钟。向反应溶液中缓慢地逐滴添加6.9g(0.1mole)的钠腈的30ml水溶液。释放热量并形成泡沫。在搅拌10分钟之后，缓慢地逐滴添加140ml的盐酸。将混合物搅拌30分钟。缓慢地逐滴添加45.1g(0.2mole)的氯化锡二水合物的盐酸溶液，然后在室温下搅拌。在反应完成之后，将反应混合物在减压下过滤并用冷水和乙醇洗涤(22g)。

(2)由式16-b表示的化合物的合成

通过反应16-2合成由式16-b表示的化合物。

[反应16-2]

[式16-b]

将22g(0.132mole)的由式15-a表示的化合物(其通过反应15-1合成)在220ml的乙酸中搅拌。向反应混合物中添加27.4g(0.318mole)的3-甲基-2-丁酮。将所得的混合物在室温下搅拌30分钟。搅拌在回流下继续用于完全溶解。将反应溶液冷却至室温并用二氯甲烷和水萃取。萃取物在减压下浓缩并干燥以获得10g的棕色固体。

(3)由式16-c表示的化合物的合成

通过反应16-3合成由式16-c表示的化合物。

[反应16-3]

[式16-c]

向100ml的冷却至0℃的乙醇中缓慢地逐滴添加7ml的亚硫酰氯。将混合物搅拌10分钟。向反应混合物中缓慢地逐滴添加10g(0.05mole)的由式15-a表示的化合物(其通过反应15-1合成)的乙醇溶液。将所得的混合物在室温下搅拌，减压下浓缩并干燥以获得13g的紫色液体。

(4)由式16-d表示的化合物的合成

以与反应8-3相似的方式，通过反应16-4合成由式16-d表示的化合物。

[反应16-4]

[式16-d]

(4)由式16-e表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应16-5合成由式16-e表示的化合物。

[反应16-5]

[式16-e]

(5)由式52表示的化合物的合成

通过反应16-6合成由式52表示的化合物。

[反应16-6]

[式52]

将0.6g(1mmole)的由式16-e表示的化合物(其通过反应16-5合成)在甲醇、四氢呋喃和水(每个11ml)的混合物中搅拌，向反应混合物中添加3.8g(9mmole)的氢氧化锂一水合物。将所得的混合物搅拌24h。用1N盐酸水溶液将反应混合物调整至pH≤4并用二氯甲烷萃取。萃取物在减压下进行蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化(0.5g)。

合成例17：由式53表示的化合物的合成

(1)由式17-a表示的化合物的合成

以与反应16-3相似的方式，通过反应17-1合成由式17-a表示的化合物。

[反应17-1]

[式17-a]

(2)由式17-b表示的化合物的合成

通过反应17-2合成由式17-b表示的化合物。

[反应17-2]

[式17-b]

向4.01ml(26mmole)的磷酰氯中缓慢地逐滴添加4.78ml(65.4mmole)的二甲氧基甲酰胺。将混合物搅拌2h。向反应溶液中缓慢地逐滴添加5g(24mmole)的由式17-a表示的化合物(其通过反应17-1合成)的12.5ml二甲氧基二酰胺溶液。将所得的混合物搅拌24h。向反应溶液中缓慢地逐滴添加过量的水。在减压下过滤沉淀的固体并通过硅胶柱色谱纯化。

(3)由式17-c表示的化合物的合成

通过反应17-3合成由式17-c表示的化合物。

[反应17-3]

[式17-c]

将8g(34mmole)的由式17-b表示的化合物(其通过反应17-2合成)在200ml的二氯甲烷中搅拌，向反应混合物中缓慢地逐滴添加13.44g(101mmole)的氯化铝。将所得的混合物在40℃下搅拌24h。在冷却至室温之后，向反应混合物中逐滴添加100ml的6N盐酸溶液，萃取并通过硅胶柱色谱纯化(4.3g，59％)。

(4)由式17-d表示的化合物的合成

以与反应16-6相似的方式，通过反应17-4合成由式17-d表示的化合物。

[反应17-4]

[式17-d]

(5)由式17-e表示的化合物的合成

以与反应9-3相似的方式，通过反应17-5合成由式17-e表示的化合物。

[反应17-5]

[式17-e]

(6)由式17-f表示的化合物的合成

以与反应9-4相似的方式，通过反应17-6合成由式17-f表示的化合物。

[反应17-6]

[式17-f]

(7)由式53表示的化合物的合成

以与反应8-4相似的方式，通过反应17-7合成由式53表示的化合物。

[反应17-7]

[式53]

合成例18：由式97表示的化合物的合成

(1)由式18-a表示的化合物的合成

通过反应18-1合成由式18-a表示的化合物。

[反应18-1]

[式18-a]

在50℃下将2-(2-溴乙基)-1,3-二烷(22mL，0.188mol)和碘化钾(63g,0.376mol)在300ml的乙腈中搅拌1h。向反应混合物中逐滴添加2,3,3-三乙基假吲哚(30g，0.188mol)。将所得的混合物在回流下搅拌12h。冷却之后，滤出固体。将滤液在减压下进行蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化(25g，34％)。

(2)通过反应18-2合成由式97表示的化合物。

[反应18-2]

[式18-a][式97]

将由式18-a表示的化合物(其通过反应18-1合成)(5g，1.3mmol)和2,4-二羟基苯醛(1.8g，1.3mmol)在回流下在10ml的乙醇中搅拌3h。将反应溶液冷却至室温，在减压下蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化。向粗产物在添加500ml的氯仿和100ml的50％硫酸水溶液。将混合物在室温下搅拌20分钟。用2N氢氧化钠溶液将反应混合物调整至pH 7至8，用二氯甲烷萃取，在减压下蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化。

合成例19：由式98表示的化合物的合成

通过反应18-3合成由式98表示的化合物。

[反应18-3]

[式18-a][式98]

由式18-a表示的化合物(其通过反应18-1合成)(1g，4mmol)和4-二甲基氨基水杨机醛(0.7g，4mmol)在回流下在10ml的乙醇中搅拌2h。将反应溶液冷却至室温，减压下蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化。向粗产物中添加100ml的氯仿和10ml的50％硫酸水溶液。将混合物在室温下搅拌20分钟。用2N氢氧化钠溶液将反应混合物调整至pH7至8，用二氯甲烷萃取，在减压下蒸馏并通过硅胶柱色谱纯化。

合成例20：由式105表示的化合物的合成

(1)根据Chem.Eur.J.2012,18,16196-16202中描述的已知合成方法，通过反应20-1合成由式20-a表示的化合物。

[反应20-1]

[式20-a]

(2)根据Chem.Eur.J.2010,16,158-166中描述的已知合成方法，通过反应20-2合成由式20-b表示的化合物。

[反应20-2]

[式20-b]

(3)根据Chem.Eur.J.2010,16,158-166中描述的已知合成方法，通过反应20-3合成由式20-c表示的化合物。

[反应20-3]

[式20-c]

(4)通过反应20-4合成由式20-d表示的化合物。

[反应20-4]

[式20-d]

在反应器中将磷酰氯逐滴添加到冷却至0℃的N-二甲基甲酰胺。将混合物搅拌10分钟。向反应混合物中逐滴添加由式4-c表示的化合物的N-二甲基甲酰胺稀释溶液。使混合物在50℃下反应12h。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入冰水中，用1M氢氧化钠的水性溶液中和，减压下萃取，减压下浓缩并通过硅胶柱色谱纯化。

(5)通过以下反应20-5合成由式105表示的化合物：

[反应8]

[式20-a][式20-d][式105]

在反应器中在40℃下将由式20-a表示的化合物(3g，0.0115mol)在30ml的乙醇中搅拌。向反应混合物中添加由式4-d表示的化合物(2.88g，0.0112mol)的乙醇稀释溶液。将混合物在回流下搅拌12h。将反应溶液冷却至室温并在减压下浓缩。在室温下浓缩物用300ml的氯仿稀释并向其中逐滴添加30ml的50％硫酸水溶液。使混合物反应2h。反应混合物用1M氢氧化钠水溶液中和，用二氯甲烷萃取，减压下浓缩并通过柱色谱纯化(0.8g，16％)。

实验例1

测量式1至式7的化合物的吸收光谱(λ_吸收)、发射光谱(λ_发射)、摩尔消光系数(ε)和量子产率并将结果示于表1中。

[比较化合物]

[表1]

化合物	溶剂	λ_吸收(nm)	λ_发射(nm)	ε(M-1cm-1)	Q.Y.
						比较化合物		548	562	150,000	0.04
式1	DMSO	584	617	66,000	0.91
						式2	DMSO	597	623	71,500	0.94
式3	DMSO	595	624	64,000	0.87
						式4	DMSO	584	614	76,000	0.81
式5	DMSO	617	659	65,000	0.56
						式6	DMSO	579	612	12,800	0.72
式7	DMSO	584	615	60,000	1.00

实验例2

将山羊抗-小鼠IgG用Alexa568(Thermo Fisher Scientific)和式1的化合物标记并且记录其吸收光谱和荧光发射光谱。

图1a是用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱，图1b是用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱，图1c是用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱，并且图1d是用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

式1的化合物的吸收波长与Alexa568的吸收波长相似。式1的化合物比Alexa568更少聚集。发现式1的化合物的荧光发射强度高于Alexa568的荧光发射强度。

实验例3

1.山羊抗-小鼠IgG用0.1M碳酸氢钠缓冲液稀释以制备1mg/ml蛋白质溶液。

2.准备五个管，并将蛋白质溶液(每个125μl)置于其中。

3.将不同量(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染料溶液(5mg/ml)放置在管中，然后涡旋。

4.将管在储物柜中于室温下摇动～30分钟。

5.将溶液转移到Amicon离心过滤器中。

6.通过离心(14,000rpm，10分钟，5次循环)用PBS洗涤反应溶液直到除去游离染料。

7.将离心过滤器倒置并连接至Amicon管，并收集滤液(1,000rpm，2分钟)。

8.滤液用PBS稀释(每个1ml)。

9.用酶标仪测量UV、PL和荧光。

标记之后，测量染料的吸光度和蛋白质在280nm处的吸光度。使用以下方程式确定每个样品中染料与蛋白质的比率：

分母中的因子X考虑了染料的最大吸光度(A_染料)和染料在280nm处的吸光度，其对应最大吸光度a％。

图1e示出了用式1的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG和用Alexa568标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度随着D/P比变化。发现式1的化合物的亮度值高于Alexa568的那些。

实验例4

1.将来自小鼠血清的IgG(原代)以10μg/ml的浓度溶解在包被缓冲液中。

2.将100μl溶液分在FLISAH/B黑色康宁板的每个孔中。

3.在顶部密封之后，将板在室温下避光孵育2h。

4.每个孔用300μl的洗涤缓冲液洗涤三次。

5.将300μl的封闭缓冲液置于每个孔中。在顶部密封之后，将板在在室温下避光孵育1h。

6.在除去封闭缓冲液后，孔用洗涤缓冲液洗涤三次。

7.将100μl的染料结合的二抗(10μg/ml)置于每个孔中。在顶部密封之后，将板在室温下避光孵育1h。

8.在除去溶液之后，每个孔用200μl的洗涤缓冲液洗涤5次。

9.将100μl的PBS放入每个含有样品的孔中。

10.用酶标仪测量荧光。

表2示出了在不同D/P比下式1的化合物和Alexa568的荧光值。图1f比较了式1的化合物与Alexa568的生物活性。

[表2]

由表2中的结果和图1f可以看出，当D/P比为～4.8时，染料(式1)二次体与最高效率的一抗偶联。此外，发现式1的化合物的亮度值远高于Alexa568的那些。还发现式1的化合物具有比Alexa568更好的生物活性。

实验例5

山羊抗-小鼠IgG用Alexa594(Thermo Fisher Scientific)和式3的化合物标记并记录其的吸收光谱和荧光发射光谱。

图2a是用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱，图2b是用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱，图2c是用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱，并且图2d是用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的荧光发射光谱。

式3的化合物的吸收波长与Alexa594的那些相似。此外，发现式3的化合物的荧光发射强度高于Alexa594的荧光发射强度。

实验例6

重复实验例3的过程，不同之处在于使用式3的化合物。

图2e示出了用式3的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG和用Alexa594标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度随着D/P比变化。发现式3的化合物的亮度值高于Alexa594的那些。特别地，式3的化合物与Alexa594之间亮度的差异随着D/P比的增加而增加。

实验例7

重复实验例4的过程，不同之处在于使用式3的化合物。

表3示出了在不同D/P比中式3的化合物和Alexa594的荧光值。图2f比较了式3的化合物与Alexa594的生物活性。

[表3]

由表3中的结果和图2f可以看出，当D/P比为～3.4时，染料(式3)二次体与最高效率的一抗偶联。当D/P比≥5时，发现式3的化合物的亮度值远高于Alexa594的那些。还发现式3的化合物具有比Alexa594更好的生物活性。

实验例8

测量式44-53的化合物的吸收光谱(λ_吸收)、发射光谱(λ_发射)、摩尔消光系数和量子产率并将结果示于表4。

[比较化合物]

[表4]

化合物	溶剂	λ_吸收(nm)	λ_发射(nm)	ε(M^-1cm^-1)	量子产率
						比较化合物		548	562	150,000	0.04
式44	PBS	544	568	51,000	0.72
						式45	DMSO	581	601	55,000	0.73
式47	DMSO	559	580	49,000	0.45
						式48	DMSO	570	592	110,000	0.98
式49	DMSO	490	574	28,000	0.35
						式50	DMSO	573	596	100,000	0.95
式51	DMSO	595	621	78,800	0.75
						式52	PBS	541	564		0.61
式53	DMSO	546	570	33,000	0.95

实验例9

重复实验例3的过程，不同之处在于使用式50的化合物。

图3a是用式50的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG的吸收光谱。

图3b示出了用式50的化合物标记的山羊抗-小鼠IgG和用Alexa546标记的山羊抗-小鼠IgG的亮度的变化。发现式50的化合物的亮度值高于Alexa546的那些。

实验例10

重复实验例4的过程，不同之处在于使用式50的化合物。

表5示出了在不同的D/P比中式50的化合物和Alexa546的荧光值。图3c比较了式50的化合物与Alexa546的生物活性。

[表5]

由表5中的结果和图3c可以看出，当D/P比为～2.5时，染料(式50)二次体与最高效率的一抗偶联。此外，发现式50的化合物的亮度值远高于Alexa568的那些。

实验例11：评价本发明化合物的光学性质

本发明染料化合物示出远高于常规花青染料化合物的荧光量子产率。如表6中所示，本发明染料化合物具有较低的摩尔消光系数，但是显示出远高于以下比较化合物的荧光量子产率，本发明染料化合物的两个因素(摩尔消光系数×荧光量子产率)的乘积远大于比较化合物的。

[比较化合物]

本发明的染料化合物的两个因子(摩尔消光系数×荧光量子产率)的乘积比比较化合物乘积大得多。

[表6]

实验例12：本发明化合物对线粒体的选择性

研究了式110的化合物对线粒体的特异性选择性。为此，将Raw 264.7细胞与式110的化合物和市售线粒体标记物(MTG，1μM用于线粒体的MitoTracker Green FM)共定位。

MitoTracker Green FM(Thermo Fisher Scientific)的结构如下：

OPM图像在560nm至600nm(式110，λ_激发＝552nm)和470nm至520nm(MTG，λ_激发＝488nm)下获得并分别显示在图4a和图4b中。图4c是图4a和图4b的合并图像。使用LAS AF软件计算皮尔逊共定位系数(A)。

[MTG]＝1μM孵育30分钟，λ_激发＝488nm

[式110]＝1μM孵育30分钟，λ_激发＝552nm

用MitoTracker Green FM(MTG)和式110的化合物染色的两幅图像的重叠度(A)为0.73，证实主要对线粒体染色。这些结果表明式110染料的能力比其他细胞内细胞器更有选择性地对线粒体染色和更准确地使线粒体成像。

实验例13

用式110的化合物(1.0μM)染色的HeLa A431细胞的三个区域A、B和C的荧光强度，以2秒为间隔测量3500秒。结果示于图5中。

如图5所示，荧光强度在1小时内几乎没有降低，表明式1的化合物10具有良好的光稳定性。

实验例14：本发明化合物对线粒体的选择性

研究了式97的化合物对线粒体的特异性选择性。为此，将HeLa A431细胞与式97的化合物和市售线粒体标记物(MTG，0.2μM用于线粒体的MitoTracker Green FM)共定位。

OPM图像在571nm至650nm(式97，λ_激发＝552nm)和498nm至540nm(MTG，λ_激发＝488nm)下获得并分别显示在图6a和图6b中。图6c是图6a和图6b的合并图像。使用LAS AF软件计算皮尔逊共定位系数(A)。

[MTG]＝0.2μM孵育30分钟，λ_激发＝488nm

[式97]＝0.5μM孵育30分钟，λ_激发＝552nm

用MitoTracker Green FM(MTG)和式97的化合物染色的两幅图像的重叠度(A)为0.74，证实线粒体主要被染色。这些结果表明式97染料的能力比其他细胞内细胞器更有选择性地对线粒体染色和更准确地使线粒体成像。

实验例15

用式98的化合物(1.0μM)染色的HeLa A431细胞的四个区域A、B、C和D的荧光强度，以2秒为间隔测量3500秒。结果示于图7中。

如图7所示，荧光强度在1小时内几乎没有降低，表明式98的化合物具有良好的光稳定性。

比较实验例1

用Cy3B(1.0μM)染色的HeLa A431细胞的两个区域A和B的荧光强度，以2秒为间隔测量2000秒。结果示于图2中。

如图8所示，荧光强度在1500秒内大大降低，表明Cy3B相对于本发明染料化合物具有较差的光稳定性。

实验例16-17：本发明化合物作为pH探针的特性

如图9和图10所示，式111的化合物的荧光强度在酸性条件(pH 1至6)下增加，但是在碱性条件(pH 9至12)下降低，表明式111的化合物由于在酸性条件下对细胞器具有高选择性而适合用作能够在活细胞中标记酸性细胞器的探针。相反，97的化合物的荧光强度在酸性条件(pH 1至6)下降低，但是在碱性条件(pH 9至12)下增加，表明式97的化合物适合用作探针。此外，式97的化合物的吸收和荧光波长与现有的激光线(488nm、532nm和550nm)很好地匹配。

也就是说，式111的化合物作为pH探针在pH 2至6下发射强荧光并且式97的化合物作为pH探针在pH 8至12下发射强荧光。总之，这两种染料可根据其使用的目的选择性地使用。

本发明染料化合物的荧光强度响应于pH值的改变而变化。基于这种pH依赖性行为，本发明染料化合物可以作为测量活细胞的pH值的pH探针。此外，本发明染料化合物可用于需要进行pH测量的各种应用领域，不仅包括通过细胞染色进行pH测量的方法，而且还包括使用平板读取器进行的细胞pH测量的现有方法。

实验例18

评价式97和式100至式102的化合物的光物理性质并且将结果示于表7中。所有测量均在DMSO、乙醇和PBS缓冲液中进行。另外，使用飞秒(fs)荧光测量技术测量双光子截面积(δ)。

图11示出了式97、式100至式102的化合物在PBS缓冲液和乙醇中的双光子作用谱。

[表7]

λ_最大 ^吸收：单光子吸收光谱中的最大波长(nm)

λ_最大 ^发射：单光子发射光谱中的最大波长(nm)

Φ：荧光量子产率

eΦ：摩尔消光系数×荧光量子产率

λ⁽²⁾ _最大 ^吸收：双光子吸收光谱的最大波长(nm)

d：每个光子的10^-50cm⁴s的峰值双光子截面积(GM)

dΦ：双光子作用截面积

工业适用性

由前述可见，与现有花青染料相比，本发明的染料化合物具有显著提高的量子产率并发出强荧光。由于这些优点，本发明的染料化合物可以在各个领域中发现应用，例如，作为需要光学成像的各种生物系统的探针。

特别地，本发明的染料化合物可用作能够标记和跟踪线粒体的染色体示踪剂。因此，本发明的染料化合物可用于对活组织和细胞中的线粒体定量成像。此外，本发明的染料化合物可用作用于测量活细胞的pH的pH探针。

Claims

1.一种由式I或式II表示的染料化合物：

[式I]

[式II]

其中Ar₁为任选地经选自以下的一个或更多个取代基取代的C₆-C₂₀芳基或C₂-C₂₀杂芳基：氢、氘、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的芳基烷基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的芳氧基烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烷氧基烷基、卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，所述烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、芳氧基、芳氧基烷基、烷氧基和烷氧基烷基任选地进一步经选自以下的一个或更多个取代基取代：卤素、氰基、硝基、胺、羟基、醛、氨基、酰胺基、肼、硫醇、缩醛、缩酮、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、磺基羟基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、羧酸酯、叠氮基、胍、羰基、硫代羰基、氨基硫代羰基、羧基、羧酸、酮、巯基、酰基氯、磺酸、酯、聚环氧烷、聚乙二醇和季铵，

E各自为CR₁或N，

Z₁为NR₂R₃、OR₄或SR₅，Z₂为NR₆、O、S或O⁺R₇，

X为O、S、NR₈R₉、SiR₁₀R₁₁、CR₁₂R₁₃或Se，

R₁至R₃中的两个任选地与相邻取代基中的两个形成脂环族烃环或者单环或多环芳族烃环，并且所述脂环族烃环或芳族烃环的碳原子任选地被选自以下的取代基替代：N、S、O、Se、Te、Po、NR₃₅、SiR₃₆R₃₇、GeR₃₈R₃₉、PR₄₀和BR₄₁，

A^-为有机离子或无机离子，为阴离子，或由A⁺表示阳离子，A^-任选地不存在。

2.根据权利要求1所述的染料化合物，其中R₁至R₂₂、R₂₉至R₄₁及其取代基包含与被所述染料化合物标记的靶标物质结合的反应性取代基R_x；所述反应性取代基R_x选自活性酯、羧基、酰胺基、丙烯酰胺基、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰基卤、炔烃、胺、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳基卤化物、氮丙啶、硼酸酯、重氮烷、环氧化物、卤铂酸盐、卤代三嗪、亚氨酸酯、异氰酸酯、甲硅烷基卤化物、磺酸酯、磺酰基卤化物、琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、酸酐、酰卤、异硫氰酸酯、乙烯基砜、二氯三嗪、卤代乙酰胺、马来酰亚胺、碳二亚胺、亚磷酰胺、肼和酰肼；并且所述活性酯由-COR’表示，其中R’为琥珀酰亚胺氧基(-OC₄H₄O₂)、磺基琥珀酰亚胺氧基(-OC₄H₃O₂-SO₃H)、-1-氧基苯并三唑基(-OC₆H₄N₈)、任选地包含选自硝基、卤素、氰基和卤代烷基中的一个或更多个基团的芳氧基，或者羧酸。

3.根据权利要求2所述的染料化合物，其中所述反应性取代基R_x共价键合至连接基团L以形成R_X-L-结构；所述连接基团为单键或者包含选自碳(C)、氮(N)、氧(O)和硫(S)原子的具有1至20个连接原子的直链或支化链，或者选自脂族烃环、芳族烃环、杂脂族环和杂芳族环；并且所述连接基团具有正(+)电荷或负(-)电荷。

4.根据权利要求2所述的染料化合物，其中所述靶标物质选自包含一个或更多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基、硫醇、磷酸和硫代磷酸基的有机化合物、纳米颗粒和生物分子，或者选自抗体；抗原；脂质；蛋白质；肽；碳水化合物；葡聚糖；脂肪酸；磷脂；脂多糖；包含或衍生以包含一个或更多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基、硫醇、磷酸和硫代磷酸基的核苷酸或寡核苷酸；包含或衍生以包含一个或更多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基、硫醇、磷酸酯和硫代磷酸酯基的氧聚核苷酸或脱氧聚核苷酸；微生物；药物；激素；细胞；细胞膜；毒素；及其组合。

5.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述由式I或式II表示的染料化合物选自式1至式113的化合物：

6.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物对细胞内线粒体选择性地染色。

7.根据权利要求1所述的染料化合物，其中所述染料化合物的荧光强度响应于细胞内pH改变而变化。

8.一种用根据权利要求1所述的染料化合物标记靶标物质的方法，包括将所述染料化合物引入至包含靶标物质的样品中，然后孵育。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括(b)测量与所述靶标物质结合的所述染料化合物的荧光以由荧光强度定量所述靶标物质。