KR20180081285A

KR20180081285A - 염료 화합물

Info

Publication number: KR20180081285A
Application number: KR1020170002335A
Authority: KR
Inventors: 이승수; 송주만; 제종태
Original assignee: 에스에프씨 주식회사
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-07-16

Abstract

본 발명은 하기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 염료 화합물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 염료 화합물은 종래 시아닌 염료에 비하여 양자효율이 현저히 개선된 효과를 가지고, 강한 형광을 나타내어 광학 영상이 필요한 다양한 생물학적 시스템에 대한 프로브 등으로 광범위한 분야에서 유효하게 활용할 수 있다. 특히, 미토콘드리아의 표지하여 추적할 수 있는 Mitotracker로 활용할 수 있어 생체 또는 세포조직에서 미토콘드리아를 정량적으로 영상화할 수 있으며, 또한 살아있는 세포의 pH를 확인할 수 있는 pH probe로도 적용할 수 있다.
[화학식 Ⅰ]

Description

염료 화합물{Dye compounds}

본 발명은 염료 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 양자효율, 형광 세기 및 광 안정성 등의 광 특성이 우수하고, 고 수용성 및 생체 분자와의 결합 또는 생체분자 내에서 우수한 광 특성을 갖는 신규한 염료 화합물에 관한 것이다.

형광은 생명 과학 분야에서 비파괴적으로 생물학적 분자를 추적 또는 분석하는데 가장 일반적으로 사용되는 기법이다. 자체 발광하는 프로테인이나 자체 발광하는 분자들도 있지만, 일반적으로 단백질(proteins), 핵산(nucleic acids), 지질(lipids), 작은 분자에 발광특성을 가지는 염료를 표지(labeling)하면, 광학적 추적 및 분석이 가능하다. 단순한 발광특성이나, 발광 특성 변화를 이용한 영상화, 에너지 트렌스퍼, 주변 환경 변화에 따른 발광 특성 변화, 화학 반응에 따른 구조 변화에 의한 발광 특성 변화 등 다양한 화학적 광학적 특성들의 변화를 분석함으로써, 생명 과학 분야에 유용한 정보를 얻을 수 있다.

이러한 현상 분석을 위한 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경, 공초점현미경, 유세포분석기, 마이크로어레이, 중합효소 연쇄반응장치, 핵산이나 단백질의 분리를 위한 전기영동장치, 실시간 생체내 영상 장비, 면역 분석 기법, DNA 서열 분석, PCR 분석, 핵산 및 단백질 진단 키트 및 진단 장비, 의료 영상 수술을 위한 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 장비, 최근에는 새로운 응용 분야 및 보다 정확하고 쉽게 분석 가능한 다양한 장비가 계속해서 개발되고 있다.

분석 기술에 적합한 형광 염료로 사용되기 위해서는 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용성 매질에서 고 휘도 특성, 다양한 pH 조건에서 안정성, 광 안전성, 형광 장비에 맞는 여기 및 발광 파장 특성 등이 요구된다. 이러한 요구 조건에 부합하는 형광 염료로, 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 많이 알려져 있다. 특히, 시아닌 발색단을 갖는 형광 염료는 대표적인 염료의 카테고리에 속하는 것으로 널리 활용되고 있다.

다만, 현재 알려져 있는 인도카르보시아닌, 인도디카르보시아닌 및 인도트리카르보시아닌 골격을 가진 카르보시아닌은 높은 몰 흡광 계수를 가지나, 낮은 형광 양자 효율을 갖는 것으로 알려져 있으며, 이러한 단점으로 인하여 생체분자에 커플링 된 후 낮은 밝기(brightness)를 나타내는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점이 개선되어 보다 강한 형광을 나타내어 유효하게 광학 영상을 얻을 수 있는 새로운 염료에 대한 개발이 필요한 실정이다.

또한, 폴리메틴 시아닌 염료는 1856년 이래로, 염료가 적용되는 다양한 분야들에서 독보적인 위치를 차지 하고 있으며, 이러한 주제에 대해서는 다양한 영역들에서 매년 수 많은 적용예들이 보고되고 있다.

일반적으로, 시아닌 염료들은 두 개의 질소 중심으로 구성되는 바, 그 중 하나는 양으로 대전되어 홀수 개의 탄소 원자들로 이루어진 접합 사슬에 의해서 다른 질소 원자에 연결된다. 이러한 특징은 "푸쉬-풀" 알켄으로 연구된 바 있으며, 폴리메틴 염료의 기초를 형성하기도 하는 바, 폴리메틴 염료는 발색단으로서 스트렙토폴리메틴 단위를 포함한다. 스트렙토폴리메틴 단위의 전하에 따라서, 이러한 염료 들은 하기와 같이 분류된다.

양이온성 스트렙토폴리메틴시아닌 및 헤미시아닌 염료 (1), 음이온성 스트렙토폴리메틴 옥소놀 염료 (2), 중성 스트렙토폴리메틴메로시아닌 염료 (3), 양쪽대전성 스쿠아레인계 시아닌 염료 (4).

일반적으로 상기 염료들은 안정한 형태에서 올-트랜스 기하학을 갖는다. 때때로, 이러한 염료들은 광이성질체화 (photoisomerization) 과정을 거친다. 이러한 종들의 생성은 섬광 광분해 (flash photolysis), 일시적 흡수 (transient absorption), 및 피코초 시간-분해 스펙트로스코피 (picoseconds time-resolved spectroscopy)와 같은 다양한 기술들을 사용하여 연구할 수 있다. 또한, 상기 염료 들은 할로겐화 은 포토그래피 및 밴드-갭 반도체 물질에서의 스펙트럼 증감제, 광 디스크에서 기록 매체, 태양에너지를 포획하기 위한 산업용 페인트, 레이저 물질, 광합성의 광포획 시스템, 광굴절 물질, 항암제 및 생물학적 시스템에 대한 프로브 등으로 광범위한 분야에서 활용되고 있다.

일반적으로 상기 염료들은 높은 몰흡광계수를 가지기 때문에 진한 색을 보인다. 하지만 양자효율(Quantum yield)이 떨어진다는 치명적인 단점이 있다. 그 이유는 시아닌 염료는 rotational, translational, vibrational mode 들이 있어서 들뜬 상태의 에너지를 형광이 아닌 non-radiative process로 손실 되기 때문에다.(D. F. O'Brien, T. M.Kelly, and L. F. Costa (1974). Excited state Properties of some Carbocyanine dyes and the energy transfer mechanism of spectral sensitisation. Photogr. Sci. Eng. 18(1), 76-84.)따라서, 본 발명의 발명자들은 이런 형광 손실을 줄이기 위해 시아닌 염료의 폴리 메틴 체인을 Rigid하게 디자인 함으로써 형광양자효율을 현저하게 증가시키고자 한다.

또한, 상용화된 mitotracker 염료들은 양전하로 하전되어 있기 때문에 세포 내 미토콘드리아에 선택적으로 결합하는 특성을 가지고 있고, 밝은 형광과 뛰어난 광 안정성은 Mitotracker로 사용하기에 적합하며, 미토콘드리아를 labeling 하기 위해 간단한 Incubation 과정만으로도 충분히 염색이 된다.

그러나, 이후 특정 실험에서는 세포를 formaldehyde 와 같은 시약으로 fixation시키는 작업이 필요한데 이 과정에서 상용화되어 있는 몇몇 Mitotracker는 형광이 유지되지 못하는 단점을 갖고 있다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 Fixation 과정 후에도 형광이 안정하게 유지되는 염료를 개발하고자 하고, 또한 다양한 파장의 형광으로 디자인하여 원하는 파장의 Mitotracker를 선택할 수 있는 염료를 개발하고자 한다.

사용자가 사용하는 다른 Probe들과 형광의 파장이 겹치면 분석이 안되기 때문에 좁은 Bandwith를 가진 다양한 형광파장의 재료가 중요한 요소로 작용하므로, 다양한 파장을 가진 Mitotracker를 개발하고자 한다.

또한, Intracellular pH 나 Cytosolic pH를 측정하면 세포의 기능을 확인하는데 매우 용이하며(Methods Mol Biol 637, 311 (2010); Nanotechnology 24, 365 (2013)), 세포 내 pH 변화를 통해서 ionic homeostasis, reactive oxygen species balance, apoptosis, cell cycle, cellular mobility 등의 세포 활동을 측정할 수 있다.(Circulation 124, 1806 (2011); Yonsei Med J 6, 473 (1995); J Bacteriol 185, 1190 (2003)).

세포 내 pH 측정을 하기 위해 pH detecting probe들을 사용하는데, 본 발명의 발명자들은 pH 변화에 따라 형광 세기가 변하는 특징도 갖고 있는 염료를 개발하고, 이 특성을 이용하여 살아있는 세포의 pH를 확인할 수 있는 pH probe로 사용할 수 있도록 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 상기와 문제를 해결하기 위하여, 보다 강한 형광을 나타내어 유효하게 광학 영상을 얻을 수 있는 새로운 염료를 제공하고자 한다.

또한, 종래 Mitotracker가 갖고 있는 문제점인 Fixation 과정 후에도 형광이 안정하게 유지되는 염료와 다양한 파장의 형광으로 디자인하여 원하는 파장의 Mitotracker를 선택 활용할 수 있는 염료를 제공하자고 한다.

또한, pH 변화에 따라 형광 세기가 변하여 살아있는 세포의 pH를 확인할 수 있는 pH probe로 활용할 수 있는 염료를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 염료 화합물을 제공한다.

[화학식 Ⅰ]

상기 [화학식 Ⅰ]의 치환기에 대한 구체적인 설명은 후술한다.

또한, 본 발명은 상기 염료 화합물과 표지 대상 물질을 결합시키는 단계를 포함하는 화합물 표지방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 형광양자효율이 현저히 개선되고, 강한 형광을 나타내어 광학 영상을 효과적으로 얻을 있도록 설계되어 다양한 생물학적 시스템에 대한 프로브 등으로 활용할 수 있는 신규한 구조의 염료 화합물에 관한 것이다.

본 발명의 일 측면은 하기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 신규한 염료 화합물에 관한 것이다.

[화학식 Ⅰ]

상기 [화학식 Ⅰ]에서,

X₁은 CR₁R₂, O 및 S 중에서 선택되는 어느 하나이고, X₂ 및 X₃은 각각 독립적으로 O 및 S 중에서 선택된다.

Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 20의 아릴이거나 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 20의 헤테로아릴이며, 상기 Ar₁ 및 Ar₂는 각각 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

상기 R₁, R₂ 및 상기 1종 이상의 치환기는 각각 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환된 알키닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 알콕시알킬, 할로겐, 시아노, 니트로, 할로겐, 아민, 하이드록시, 알데하이드, 아미노, 아마이드, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 술포히드록시, 술포닐, 술포네이트, 설페이트, 카르복실레이트, 아미드, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 카르복실, 카르복실산, 케톤, 설프하이드릴, 아실클로라이드, 설폰산, 에스터, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 및 4차 암모늄 중에서 선택되고,

상기 R₁, R₂ 및 상기 1종 이상의 치환기가 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 알콕시 및 알콕시알킬 중에서 선택되는 어느 하나인 경우 1종 이상의 치환기로 더 치환될 수 있으며, 상기 1종 이상의 치환기는 할로겐, 시아노, 니트로, 할로겐, 아민, 하이드록시, 알데하이드, 아미노, 아마이드, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 술포히드록시, 술포닐, 술포네이트, 설페이트, 카르복실레이트, 아미드, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 카르복실, 카르복실산, 케톤, 설프하이드릴, 아실클로라이드, 설폰산, 에스터, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 및 4차 암모늄 중에서 선택되고,

A-는 상대 이온으로서, 유기 또는 무기 이온이고, 특별히 제한되지 않으며, 용도에 따라 유기용제 내에서 본 발명에 따른 염료의 용해성이나, 안정성의 관점에서 적절하게 선택할 수 있으며, 존재 또는 비존재할 수 있다.

일반적으로 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온, 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온이 될 수도 있고, 티오시안산 이온, 벤젠술포닉산 이온, 나프탈렌술포닉산 이온, p-톨루엔술포닉산 이온, 알킬술포닉산 이온, 벤젠카르복실릭산 이온, 알킬카르복실릭산 이온, 삼할로알킬카르복실릭산 이온, 알킬술포닉산 이온, 삼할로알킬술포닉산 이온, 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 될 수도 있으며, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트, 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온일 수도 있다. 또한, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 이온일 수도 있다.

한편, 본 발명에 따른 [화학식 Ⅰ]의 염료 화합물은 상술한 바와 같이 표지 대상 물질과 결합할 수 있도록 반응성 치환기를 포함할 수 있으며, 물에 대한 용해도 증가 및 형광 염료간의 상호작용과 염료와 다양한 표지인자 간의 원하지 않는 표지발생을 방지하기 위해서 극성과 전하를 가지는 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면, 치환기 중에서 적어도 하나는 아민, 티올, 알코올, 알데하이드, 케톤 등의 치환기를 갖는 표지 대상 물질과 컨쥬게이션(conjugation)할 수 있다.

상기 표지 대상 물질은 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물 등으로서, 특별히 제한되지 않지만, 항체(antibody); 항원(antigen); 지질(lipid); 단백질(protein); 펩타이드(peptide); 탄수화물(carbohydrate); 덱스트란(dextran); 지방산(fatty acid); 인지질(phospholipid); 리포다당류(lipopoly saccharide); 아미노기, 설프하이드릴기, 카르보닐기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 인산기 및 티오인산기 중에서 하나 이상을 포함하거나, 또는 포함하도록 유도화된 뉴클레오타이드(nucleotides) 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide); 아미노기, 설프하이드릴기, 카르보닐기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 포스페이트기 및 티오포스페이트기 중에서 하나 이상을 포함하거나, 또는 포함하도록 유도화된 옥시폴리핵산(oxypolynuceotide) 또는 데옥시폴리핵산(deoxypolynuceotide); 미생물; 약물; 호르몬; 세포; 세포막; 및 독소(toxins);로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 반응성 치환기는 활성에스테르(activated esters), 카르복실(carboxyl), 아마이드(amide), 아크릴아마이드(acrylamides), 아자이드(azide), 아실아자이드(acyl azides), 아실할라이드(acyl halides), 알카인(alkyne), 아민(amine), 알데하이드(aldehydes), 케톤(ketones), 알킬할라이드(alkyl halides), 알킬설포네이트(alkyl sulfonates), 아릴할라이드(aryl halides), 아지리딘(aziridines), 보로네이트(boronates), 다이아조알칸(diazoalkanes), 에폭사이드(epoxides), 할로플래티네이트(할로백금산염, haloplatinate), 할로트리아진(halotriazines), 이미도에스테르(imido esters), 이소시아네이트(isocyanates), 실릴할라이드(silyl halides), 설포네이트에스테르(sulfonate esters), 설포닐할라이드(sulfonyl halides), 숙신이미딜에스테르(succinimidyl ester), 설포-숙신이미딜에스테르(sulpho-succinimidyl ester), 무수물(anhydrides), 산할로겐화물(산 할라이드, acid halides), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 비닐설폰(vinylsulphone), 디클로로트리아진(dichlorotriazines), 할로아세트아미드(haloacetamides), 말레이미드(maleimides), 카르보다이이미드(carbodiimide), 포스포라미다이트(phosphoramidites), 하이드라진(hydrazines), 하이드라자이드(hydrazide) 등일 수 있고, 바람직하게는 카르복실산의 숙신이미딜에스테르, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 할로아세트아미드 등일 수 있다.

상기 활성에스테르는 본 발명이 속하는 기술분야에서, 치환반응에서 우수한 이탈 그룹기인 R을 갖는 구조식 -COR'로서, 상기 R'은 예를 들면, 숙신이미딜옥시(succinimidyloxy, -OC₄H₄O₂), 술포숙신이미딜옥시(sulfosuccinimidyloxy, -OC₄H₃O₂-SO₃H), 또는 -1-옥시벤조벤조트리아졸일(-1-oxybenzotriazolyl, -OC₆H₄N₈)이거나; 아릴옥시 또는 전자끌기 그룹에 속하는 니트로, 할로겐, 시아노, 할로겐알킬 등을 1종 이상 포함하는 아릴옥시이거나; 무수물(anhydrides, -OCOR_a 또는 -OCNR_aNHR_b)을 구성하는 카르보디이미드(carbodiimide)에 의해서 활성화된 카르복실산(carboxylic acid)일 수 있고, 상기 R_a 또는 R_b는 탄소수 1 내지 6의 알킬, 탄소수 1 내지 6의 알콕시, 시클로헥실, 3-디메틸아미노프로필, N-모폴리노에틸 등이다.

또한, 본 발명에 따른 반응성 치환기(R_X)는 다양한 링커(L)에 공유결합으로 연결되어, R_X-L- 구조일 수 있다.

이러한 링커는 단일결합이거나, 또는 바람직하게 탄소(C), 질소(N), 산소(O) 및 황(S) 원자로 구성되는 군에서 선택된 원자가 1 내지 20개 연결된 직쇄 또는 분지쇄의 사슬일 수 있고, 지방족 탄화수소 고리, 방향족 탄화수소 고리, 지방족 헤테로 고리 또는 방향족 헤테로 고리일 수도 있다. 또한, 이러한 링커는 + 또는 - 전하를 가질 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 염료 화합물은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 32] 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 [화학식 Ⅰ]의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

[화학식 20]

[화학식 21]

[화학식 22]

[화학식 23]

[화학식 24]

[화학식 25]

[화학식 26]

[화학식 27]

[화학식 28]

[화학식 29]

[화학식 30]

[화학식 31]

[화학식 32]

또한, 본 발명에 따른 염료 화합물은 세포 내 미토콘드리아를 선택적으로 염색하여 영상화할 수 있으므로 미토콘드리아 표지 및 추적 프로브(Mitotracker)로 적용할 수 있다.

특히, 다양한 파장의 형광으로 설계할 수 있기 때문에 사용자가 원하는 파장을 선택하여 Mitotracker로 활용할 수 있을 수 있다. 이와 같은 다양한 파장을 가진 Mitotracker가 필요한 이유는 사용자가 사용하는 다른 프로브(Probe)들과 형광의 파장이 겹치면 분석이 안되므로, 좁은 밴드폭를 가진 다양한 형광 파장으로 선택적으로 설계할 수 있는 것은 상업적으로 매우 중요한 요소이다.

또한, 본 발명에 따른 염료 화합물은 세포 내 pH의 변화에 따라 형광의 세기가 변하는 것을 특징으로 하고, 이에 따라 살아있는 세포의 pH를 확인할 수 있는 pH 프로브, 나아가서 이를 포함하는 세포 내 pH 측정 센서 등에 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 염료 화합물을 이용하여 Intracellular pH 나 Cytosolic pH를 측정하면 ionic homeostasis, reactive oxygen species balance, apoptosis, cell cycle, cellular mobility 등의 세포 활동을 직간접적으로 측정할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 염료 화합물은 사용 목적에 따라 pH2~6사이의 산성 조건에서 강한 형광을 내는 타입으로, 또는 pH 8~12사이에 염기성 조건에서 강한 형광을 내도록 선택하여 사용할 수 있어 pH 프로브로 더욱 유용하게 활용할 수 있다.

나아가서, 살아 있는 세포의 염색을 통해 pH 측정하는 방법 외에, 최근에는 plate reader를 통해 세포의 pH를 측정하는 방법이 활용되고 있는데, 본 발명에 따른 염료 화합물은 이에도 적용이 가능하여 pH를 측정하고자 하는 여러 적용분야에 다양하게 이용할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 구체적인 염료 화합물의 합성방법과, 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

합성예 1. 화학식 1의 합성

(1) 중간체 1의 합성

[중간체 1]

2,3,3-트리메틸인돌레닌 4.5 g(28 mmol)을 상온, 질소 기류하에서 에탄올 400 mL과 함께 교반하고, 48% 염산 수용액(80 mL)을 적가하였다. 1 시간 후 반응액을 감압증류하였다. 감압증류된 반응기에 아세토니트릴(320 mL), 아세틱에시드(8 mL)와 아크롤레닌 다이에틸 아세탈 (65.72 g, 505 mmol)을 첨가하였다. 70 ℃에서 2 시간 동안 반응하였다. 반응액을 감압증류하고 HPLC Rainin Dynamax C18, 8 μm 컬럼, 물/아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세틱 에시드)의 전개액으로 60분동안 10~100%까지 20 mL/min으로 정제하였다.

(2) 중간체 2의 합성

[중간체 2]

상기 [중간체 1] 1.36 g(4.7 mmol)과 4,6-다이하이드록시-1,3-벤젠다이카복스알데하이드 0.78 g(4.7 mmol)을 에탄올 20 mL에 넣고 3 시간 동안 환류, 교반하였다. 상온으로 냉각하여 감압증류 후 실리카컬럼정제하였다. 정제한 물질에 클로로포름 10 mL와 50% 황산 수용액 1 mL를 넣고 상온에서 20분 교반하였다. 2노르말 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 7-8로 맞추고 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 감압증류 후 실리카컬럼정제하였다. (0.24 g, 15%)

¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ= 10.15(1H, s), 7.80(1H, s), 7.66(1H, s), 7.36(2H, m), 7.28(1H, d), 7.12(1H, d), 5.97(1H, s), 5.12(1H, m), 4.25(1H, m), 3.93(1H, m), 2.73(1H, m), 2.33(1H, m), 1.68(3H, s), 1.63(3H, s)

(3) 중간체 3의 합성

[중간체 3]

4-아미노벤조익 에씨드 5 g(36 mmole)과 포타슘 사이오시아네이트 19.03 g(195 mmole)을 아세틱 에씨드 70 mL에 넣고 50분 동안 상온 교반하였다. 0 ℃에서 브롬 2.06 mL(40 mmole)를 천천히 적가하였다. 상온에서 24 시간 동안 교반한다. 물 200 mL에 반응액을 첨가하여 70-80 ℃에서 1.5시간 가열 교반하였다. 감압여과하고 여과액을 0 ℃에서 암모늄용액을 첨가하여 pH를 6으로 맞추고 감압 여과하여 고체를 건조하였다.

(4) 중간체 4의 합성

[중간체 4]

수산화 칼륨 20 g을 물 60 mL에 넣고 30분 동안 상온 교반하였다. 상기 [중간체 3] 9.4 g를 첨가하고 빛을 차단한 상태로 120 ℃에서 24 시간 동안 환류 교반하였다. 염산을 첨가하여 pH를 4로 맞추고, 여과하여 물로 여러 번 씻어준 후 고체를 건조하였다.

(5) 화학식 1의 합성

[화학식 1]

[중간체 2] 0.05 g(0.14 mmole)과 1,2,3,3-테트라메틸인돌리움 아이오다이드(1,2,3,3-Tetramethylindolium iodide) 0.05 g(0.16 mmole), 에탄올을 넣고 80 ℃에서 24시간 가열 교반하였다. 2M 염산을 첨가하여 pH를 4로 맞추고 유기층을 모았다. 염화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 10으로 맞추고 유기층을 모았다. 감압증류 후 ODS컬럼정제하였다.

¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ= 8.51(1H, d), 8.4(1H, s), 8.31(1H, s), 7.65(1H, d), 7.51(8H, s), 6.66(1H, s), 5.40(1H, m), 4.30(1H, m), 4.07(3H, s), 2.89(1H, m), 2.47(1H, m), 1.79(3H, s), 1.75(3H, s), 1.74(6H, s).

합성예 2. 화학식 2의 합성

[화학식 2]

[중간체 2] 0.05 g(0.1 mmole)과 1,4-다이메틸피리디니움 아이오다이드(Pyridinium, 1,4-dimethyl-, iodide) 0.04 g(0.16 mmole), piperidine, 에탄올을 넣고 80 ℃에서 3시간 가열 교반하였다. 반응이 끝나면 감압증류 후 ODS컬럼정제하였다.

¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ= 8.45(2H, s), 8.05(1H, s), 7.75(2H, s), 7.71(1H, s), 7.64(1H, d), 7.48(4H, s), 7.15(1H, d), 6.43(1H, s), 5.37(1H, m), 4.54(1H, m), 4.29(1H, m), 4.18(3H, s), 2.81(1H, m), 2.45(1H, m), 1.73(3H, s), 1.70(3H, s).

합성예 3. 화학식 3의 합성

[화학식 3]

상기 합성예 2의 [중간체 2]로부터 [화학식 2]을 합성하는 예에서 1,4-다이메틸피리디니움 아이오다이드 대신 2,3-다이메틸벤조티아졸륨, 4-메틸벤젠설포네이트를 사용하여 화학식 3를 합성하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO): δ= 8.36(1H, d), 8.34(1H, s), 8.30(1H, S), 8.23(1H, d), 8.10(1H, d), 7.90(1H, d), 7.81(5H, m), 7.61(3H, m), 6.58(1H, s), 5.44(1H, m), 4.70(1H, dd), 4.29(3H, s), 4.20(1H, m), 2.79(1H, m), 2.53(1H, m), 1.78(3H, s), 1.75(3H, s).

합성예 4. 화학식 4의 합성

[화학식 4]

상기 합성예 2의 [중간체 2]로부터 [화학식 2]을 합성하는 예에서 1,4-다이메틸피리디니움 아이오다이드 대신 7-하이드록시쿠마린-4-아세틱 에시드를 사용하여 화학식 4를 합성하였다.

¹H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 8.05(1H, s), 7.70(1H, d), 7.65(1H, S), 7.57(4H, m), 7.48(1H, s), 7.45(1H, s), 6.85(1H, dd), 6.78(1H, d), 6.53(1H, s), 6.36(1H, s), 5.42(1H, m), 4.61(1H, m), 4.32(1H, m), 2.93(1H, m), 2.54(1H, m), 1.86(3H, s), 1.81(3H, s).

합성예 5. 화학식 5의 합성

[화학식 5]

상기 합성예 2의 [중간체 2]로부터 [화학식 2]을 합성하는 예에서 1,4-다이메틸피리디니움 아이오다이드 대신 2-메틸벤조티아졸을 사용하여 화학식 5를 합성하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO): δ= 8.35(1H, S), 8.17(1H, s), 8.08(1H, d), 7.97(1H, d), 7.84(2H, m), 7.73(1H, d), 7.61(2H, m), 7.52(1H, m), 7.49(1H, d), 7.45(1H, td), 6.57(1H, s), 5.43(1H, m), 4.70(1H, m), 4.23(1H, m), 2.79(1H, m), 2.55(1H, m), 1.80(3H, s), 1.76(3H, s).

실험예

본 발명에 따른 [화학식 1] 내지 [화학식 5]에 대해서 흡수 스펙트럼(λabs), 발광 스펙트럼(λem), 몰흡광계수 및 양자효율을 측정하여 하기 [표 1]에 나타내었다.

구분	용매	λ_abs (nm)	λ_em(nm)	ε (M^-1cm^-1)	Quantum yield
화학식 1	DMSO	660	640	34,500	0.215
화학식 1	PBS	594	663	41,000	0.073
화학식 2	DMSO	623	680	7500	0.54
화학식 2	PBS	570	625	33700	0.202
화학식 3	DMSO	646	685	51700	0.384
화학식 3	PBS	559	572	28000	0.095
화학식 4	DMSO	607	635	34000	0.328
화학식 4	PBS	570	-	18000	-
화학식 5	DMSO	610	634	29000	0.326
화학식 5	PBS	562	-	14000	-

Claims

하기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 염료 화합물:
[화학식 Ⅰ]

상기 [화학식 Ⅰ]에서,
X₁은 CR₁R₂, O 및 S 중에서 선택되는 어느 하나이고, X₂ 및 X₃은 각각 독립적으로 O 및 S 중에서 선택되고,
Ar₁ 및 Ar₂는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 20의 아릴이거나 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 20의 헤테로아릴이며, 상기 Ar₁ 및 Ar₂는 각각 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있으며,
상기 R₁, R₂ 및 상기 1종 이상의 치환기는 각각 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환된 알키닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 알콕시알킬, 할로겐, 시아노, 니트로, 할로겐, 아민, 하이드록시, 알데하이드, 아미노, 아마이드, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 술포히드록시, 술포닐, 술포네이트, 설페이트, 카르복실레이트, 아미드, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 카르복실, 카르복실산, 케톤, 설프하이드릴, 아실클로라이드, 설폰산, 에스터, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 및 4차 암모늄 중에서 선택되고,
상기 R₁, R₂ 및 상기 1종 이상의 치환기가 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 알콕시 및 알콕시알킬 중에서 선택되는 어느 하나인 경우 1종 이상의 치환기로 더 치환될 수 있으며, 상기 1종 이상의 치환기는 할로겐, 시아노, 니트로, 할로겐, 아민, 하이드록시, 알데하이드, 아미노, 아마이드, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 술포히드록시, 술포닐, 술포네이트, 설페이트, 카르복실레이트, 아미드, 아지도, 구아니디움, 카르보닐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 카르복실, 카르복실산, 케톤, 설프하이드릴, 아실클로라이드, 설폰산, 에스터, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 및 4차 암모늄 중에서 선택되고,
A는 상대이온이다.
제1항에 있어서,
상기 Ar₁, Ar₂, R₁, R₂ 및 상기 1종 이상의 치환기는 상기 염료 화합물이 표지되는 표지 대상 물질에 결합하는 반응성 치환기(R_X)를 포함하고,
상기 반응성 치환기(R_X)는 활성에스테르(activated esters), 카르복실(carboxyl), 아마이드(amide), 아크릴아마이드(acrylamides), 아자이드(azide), 아실아자이드(acyl azides), 아실할라이드(acyl halides), 알카인(alkyne), 아민(amine), 알데하이드(aldehydes), 케톤(ketones), 알킬할라이드(alkyl halides), 알킬설포네이트(alkyl sulfonates), 아릴할라이드(aryl halides), 아지리딘(aziridines), 보로네이트(boronates), 다이아조알칸(diazoalkanes), 에폭사이드(epoxides), 할로플래티네이트(할로백금산염, haloplatinate), 할로트리아진(halotriazines), 이미도에스테르(imido esters), 이소시아네이트(isocyanates), 실릴할라이드(silyl halides), 설포네이트에스테르(sulfonate esters), 설포닐할라이드(sulfonyl halides), 숙신이미딜에스테르(succinimidyl ester), 설포-숙신이미딜에스테르(sulpho-succinimidyl ester), 무수물(anhydrides), 산할로겐화물(산 할라이드, acid halides), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 비닐설폰(vinylsulphone), 디클로로트리아진(dichlorotriazines), 할로아세트아미드(haloacetamides), 말레이미드(maleimides), 카르보다이이미드(carbodiimide), 포스포라미다이트(phosphoramidites), 하이드라진(hydrazines) 및 하이드라자이드(hydrazide) 중에서 선택되는 어느 하나이고,
상기 활성에스테르는 -COR'이고, 상기 R'는 숙신이미딜옥시(succinimidyloxy, -OC₄H₄O₂), 술포숙신이미딜옥시(sulfosuccinimidyloxy, -OC₄H₃O₂-SO₃H), 또는 -1-옥시벤조벤조트리아졸일(-1-oxybenzotriazolyl, -OC₆H₄N₈)이거나; 비치환된 아릴옥시 또는 니트로, 할로겐, 시아노 및 할로겐알킬 중에서 선택된 1종 이상으로 치환된 아릴옥시이거나; 또는 카르복실산인 것을 특징으로 하는 염료 화합물.
제2항에 있어서,
상기 반응성 치환기(R_X)는 링커(L)에 공유결합으로 연결된 -L-R_X 구조이고, 상기 L은 단일결합이거나, 탄소(C), 질소(N), 산소(O) 및 황(S) 원자로 구성되는 군에서 선택된 원자가 1 내지 20개 연결된 직쇄 또는 분지쇄의 사슬이거나, 지방족 탄화수소 고리, 방향족 탄화수소 고리, 지방족 헤테로 고리 및 방향족 헤테로 고리에서 선택된 어느 하나이고, 상기 L은 + 또는 - 전하를 가질 수 있는 것을 특징으로 하는 염료 화합물.
제2항에 있어서,
상기 표지 대상 물질은 아미노기, 설프하이드릴기, 카르보닐기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 인산기 및 티오인산기 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물이고,
상기 생체분자는 항체(antibody); 항원(antigen); 지질(lipid); 단백질(protein); 펩타이드(peptide); 탄수화물(carbohydrate); 덱스트란(dextran); 지방산(fatty acid); 인지질(phospholipid); 리포다당류(lipopoly saccharide); 아미노기, 설프하이드릴기, 카르보닐기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 인산기 및 티오인산기 중에서 하나 이상을 포함하거나, 또는 포함하도록 유도화된 뉴클레오타이드(nucleotides) 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide); 아미노기, 설프하이드릴기, 카르보닐기, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 포스페이트기 및 티오포스페이트기 중에서 하나 이상을 포함하거나, 또는 포함하도록 유도화된 옥시폴리핵산(oxypolynuceotide) 또는 데옥시폴리핵산(deoxypolynuceotide); 미생물; 약물; 호르몬; 세포; 세포막; 및 독소(toxins);로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염료 화합물.
제1항에 있어서,
상기 [화학식 Ⅰ]로 표시되는 염료 화합물은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 32] 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염료 화합물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

[화학식 20]

[화학식 21]

[화학식 22]

[화학식 23]

[화학식 24]

[화학식 25]

[화학식 26]

[화학식 27]

[화학식 28]

[화학식 29]

[화학식 30]

[화학식 31]

[화학식 32]
제1항에 있어서,
상기 염료 화합물은 세포 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는 염료 화합물.
제1항에 있어서,
상기 염료 화합물은 세포 내 pH에 따라 형광의 세기가 변하는 것을 특징으로 하는 염료 화합물.
(a) 표지 대상 물질을 포함하는 시료에 제1항에 따른 염료 화합물을 주입하고, 인큐베이팅하는 단계;를 포함하는 화합물 표지방법.
제8항에 있어서,
(b) 상기 표지 대상 물질과 결합된 염료 화합물의 형광 발광을 측정하는 단계;를 더 포함하여, 형광 세기에 따라 표지 대상 물질을 정량화하는 것을 특징으로 하는 화합물 표지방법.