CN108409642A - 一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法，以三苯胺为母体通过Vilsmeier‑Haack反应进行三苯胺甲酰化，接着利用亲核取代反应制备4‑对硝基‑3‑吡啶甲氧基(N，N‑二苯基氨基)苯乙烯，进而在Pd/C，水合肼作用下还原得到的4‑对氨基‑3‑吡啶甲氧基(N，N‑二苯基氨基)苯乙烯，4‑对氨基‑3‑吡啶甲氧基(N，N‑二苯基氨基)苯乙烯与2‑吡啶甲醛通过简单的缩合反应得到席夫碱，然后在硼氢化钠的作用下还原为目标产物—双吡啶基三苯胺类荧光探针。本发明的双吡啶基三苯胺类荧光探针是一类具有细胞质成像功能的光学材料，毒性低，膜穿透性好，易进入细胞中，能应用于双光子荧光共聚焦显微成像，具有明显的应用价值。

Description

一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备 方法
技术领域
本发明属于光学材料技术领域，具体涉及一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法。
背景技术
近年来，有机双光子材料在诸多领域，尤其是双光子荧光显微成像中的应用得到了广泛的关注。与传统的单光子荧光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微镜具有很多优点：对生物样品的光损伤较小，有效延长观测时间，轴向分辨率高，观测样品的穿透能力强，图像的对比度高，对探测光路的要求低，适合多标记复合测量等。此外，荧光显微探测技术与荧光探针是相互依存互相促进的，新的荧光技术需要新的探针，新的探针将使探测技术更加完善。目前，许多双光子荧光探针存在双光子吸收截面大但共轭结构长，导致溶解性差；或者双光子吸收截面较小，且双光子诱导荧光量子产率偏低，使得双光子荧光显微镜的潜在优势没有完全发挥出来。
疏基化合物在生物体内发挥着重要的作用，是许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在生物体内的新陈代谢、生物氧化还原动态平衡及酶催化等过程中起着关键作用。高半胱氨酸(Hcy)在生物体内含量的变化均会导致一些疾病的发生，通过检测它在生物体内含量的变化，可以为体内某些疾病的诊断提供正确的依据。其次半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)分子结构仅有一个亚甲基差别，但其生物功能却完全不同，使研制区分两者的荧光探针成为挑战性课题。因此，发展高效的双光子继发性识别Cu2+和Hcy的荧光探针是一个重要的科学研究命题。
发明内容
本发明的目的正是为了解决上述问题，而提出一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针，合成的双吡啶基三苯胺类荧光探针是一类具有细胞质成像功能的光学材料，毒性低，膜穿透性好，易进入细胞中，能应用于双光子荧光共聚焦显微成像，具有明显的应用价值。
本发明提供了一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针，所述双光子荧光探针的结构式为：
一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，按以下步骤操作：
1)、中间体Ⅰ的制备
冰浴下向容器中依次加入DMF、三氯氧磷和三苯胺，在40-80℃下回流2-3h，得到的反应液经分离、洗涤、抽滤，并干燥得淡黄色中间体Ⅰ；
2)、中间体Ⅱ的制备
将中间体Ⅰ溶于乙醇中，然后加入硼氢化钠，搅拌半小时，旋干，水洗，抽滤，并干燥得白色中间体Ⅱ；
3)、中间体Ⅲ的制备
将4-(N,N-二苯基氨基)苯甲醇、KI、三苯基膦以及HAc溶于丙酮中，加入Aliquat336，在60-100℃下回流反应2-5天，洗涤，干燥，浓缩，重结晶得到白色中间体Ⅲ；
4)、中间体Ⅳ的制备
将3-羟基-4-硝基苯甲醛、K2CO3、中间体Ⅲ以及少量催化剂Aliquat336溶于DMA中，120-160℃下回流反应22-30h，反应结束后冷却至室温，洗涤，干燥重结晶得红色中间体Ⅳ；
5)、中间体Ⅴ的制备
将中间体Ⅳ、K2CO3、1-溴-2-甲烷吡啶溶于乙醇中，在50-90℃下回流反应1-3h，反应完全后，浓缩，洗涤，干燥重结晶得黄色中间体Ⅴ；
6)、中间体Ⅵ的制备
将中间体Ⅴ溶解在甲醇溶液中，在催化剂Pd/C的作用下，加入水合肼，50-90℃下，回流反应1-3h结束后，过滤，浓缩重结晶得黄白色中间体Ⅵ；
7)、中间体Ⅶ的制备
将中间体Ⅵ和2-吡啶甲醛溶于乙腈中，搅拌1-4h，抽滤，干燥得黄色中间体Ⅶ；
8)、目标产物L的制备
将中间体Ⅶ、硼氢化钠溶解在乙醇中，常温下搅拌1-3h后，抽滤，重结晶，得到淡黄色目标产物L。
作为进一步地优选手段，所述步骤1)中，DMF、三氯氧磷和三苯胺的摩尔用量比为1：1：1。
作为进一步地优选手段，所述步骤2)中，4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛、硼氢化钠摩尔用量比为1：1.5。
作为进一步地优选手段，所述步骤3)中，4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醇、KI、三苯基膦的摩尔用量比为1：2：2。
作为进一步地优选手段，所述步骤4)中，3-羟基-4-硝基苯甲醛、K2CO3、中间体Ⅲ的摩尔用量比为3：1：3。
作为进一步地优选手段，所述步骤5)中，中间体Ⅳ、K2CO3、1-溴-2甲烷吡啶的摩尔用量比为1：9：2。
作为进一步地优选手段，所述步骤6)中，中间体Ⅴ、Pd/C的摩尔用量比为10：1。
作为进一步地优选手段，所述步骤7)中，中间体Ⅵ、2-吡啶苯甲醛的摩尔用量比为1：1.2。
作为进一步地优选手段，所述步骤8)中，硼氢化钠、中间体Ⅵ的摩尔用量比为3：1。
本发明有益效果：1、本发明以具有较高反应活性和良好生物相容性的三苯胺基团作为主体，简洁高效地制备了三苯胺硝基衍生物，通过还原反应、亲核取代反应、缩合反应等，得到双吡啶基三苯胺类荧光探针，这种荧光探针L可以继发性识别Cu2+和同型半胱氨酸(Hcy)，即通过取代络合物L-Cu2+中的Cu2+从而检测Hcy；有趣的是，利用涂层L自制得试纸，可以裸眼通过观察试纸颜色的变化监测污水中的Cu2+(10-8-10-2M)；同时，在双光子荧光共聚焦显微成像中，宫劲癌细胞被本发明的双光子荧光材料染色后，可清晰地观察到有机材料对宫颈癌细胞质具有良好的成像能力，且能可逆地检测细胞中的铜离子和Hcy。
2、本发明合成的双吡啶基三苯胺类荧光探针是一类具有细胞质成像功能的光学材料，毒性低，膜穿透性好，易进入细胞中，能应用于双光子荧光共聚焦显微成像，具有明显的应用价值。
3、本发明制备方法原料易得，成本低，合成步骤简单，易于操作。
附图说明
图1为本发明的制备方法路线图。
图2是本发明双吡啶基三苯胺类荧光探针在混合水溶液中加入不同金属离子的裸眼和荧光筛选图。
图3是本发明双吡啶基三苯胺类荧光探针涂层的试纸条对梯度铜离子的颜色反映。
图4是本发明双吡啶基三苯胺类荧光探针与铜络合后的配合物对Hcy的荧光发射图。
图5是本发明吡啶基三苯胺类荧光探针对铜离子和Hcy的单、双光子荧光循环共聚焦显微成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
1、中间体Ⅰ的制备
在250mL烧瓶中加入7.4mL(0.1mol)DMF，冰水浴中搅拌，随后逐滴加入9.2mL(0.1mol)三氯氧磷，继续搅拌，30min后液体变得粘稠，最后得到白色略带黄色固体冻盐。然后将24.5g(0.1mol)三苯胺加入上述烧瓶中，升温至50℃约30min至冻盐全溶，65℃下回流反应2.5h，薄层色谱法判定反应完全(TLC)，将反应液逐滴加入1000mL冰水的烧瓶中，以氢氧化钠调节溶液pH＝9，有大量黄绿色固体析出，抽滤，烘干，色谱柱分离提纯(洗脱剂是正己烷)，得到7.81g产物，产率71.5％。1HNMR:(DMSO-d6，400Hz),δ(ppm):6.89(d，J＝8.80Hz，2H)，7.23(m，6H)，7.42(t，J＝7.80Hz，4H)，7.72(d，J＝8.80Hz，2H)，9.771(s，1H)。
2、中间体Ⅱ的制备
称取4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛27.3g(1×10-1mol)溶解在200mL乙醇中，边搅拌边分批加入5.7g(1.50×10-1mol)硼氢化钠，反应半小时，薄层色谱跟踪反应完全，旋干，大量水洗，抽滤，干燥得白色固体25.3g。产率93％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):7.26(6H，m),7.02(8H，m),4.60(2H,d),4.13(1H,t)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):145.24，143.48，135.46，129.53，128.09，126.48，125.88，123.41，63.62。
3、中间体Ⅲ的制备
将9.31g(3.4×10-2mol)4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醇，11.3g(6.8×10-2mol)KI，1.78g(6.8×10-2mol)PPh3，4.00mLHAc，500mL丙酮及少量催化剂Aliquat336，加入250mL的圆底烧瓶中，剧烈搅拌下，80℃回流反应3天，TLC示踪反应结束后，加水进行多次洗涤，干燥有机层，浓缩，重结晶得白色固体7.00g，产率73.8％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):7.88(3H，t)，7.52–7.72(12H，m)，7.28–7.36(4H，m)，7.04–6.96(5H，m)，6.75–6.85(4H，m)，5.1(2H，d，J＝16)，3.5(2H，s)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):147.24，135.48，134.46,130.53，130.09,124.48,123.88，123.41，118.85,117.87，120.59，69.62。MS(ITMS-cAPCI):520.2892,found,520.2883。4、中间体Ⅳ的制备
称取中间体Ⅲ3.11g(4.8×10-3mol)，3-羟基-4-硝基苯甲醛0.802g(4.8×10- 3mol)，K2CO30.221g(1.6×10-3mol)及少量催化剂Aliquat336，20mL DMA做溶剂，氮气保护下140℃回流26h，TLC示踪反应完全，抽滤，滤液用二氯甲烷萃取三次，干燥有机层，柱层析法分离(展开剂比例正己烷：乙醇＝100:1)，得到红色固体0.753g，产率46.1％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):10.90(1H，s)，7.95(1H，d，J＝8)，7.55(2H，d，J＝8)，7.32–7.40(5H，m)，7.26(2H，d，J＝8)，7.05–7.15(7H，m)，6.90(2H，d，J＝8)。13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):153.65，148.14，147.04，145.06，134.67，133.10，130.47，130.14，128.86，126.29，124.14，122.56，117.38.MS(ITMS-cAPCI):408.1453，found，408.1474。
5、中间体Ⅴ的制备
称取1g(2.45×10-3mol)硝基化合物，3.03g(2.2×10-2mol)K2CO3，少许Aliquat336，0.84g(4.90×10-3mol)1-溴-2-甲烷吡啶于圆底烧瓶中，20ml乙醇做溶剂，70℃下回流搅拌2h，TLC示踪反完全，抽滤，浓缩，二氯甲烷萃取三次，干燥有机层，柱层析法分离(展开剂比例石油醚：二氯甲烷＝20:1)。得到橘黄色固体0.7g，产率为57.2％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):8.60-8.61(J＝4.00，d，1H)，7.95-7.97(J＝8.00，d，1H)，7.88-7.92(J＝8.00，t，1H)，7.63-7.65(J＝8.00，t，2H)，7.46-7.56(m，3H)，7.36-7.32(J＝8.00，t，6H)，6.95-7.19(m，9H)，5.45(s，2H)。13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):151.84，149.08，147.66，146.70，144.38，137.24，137.12，132.58，130.04，129.63，128.21，126.12，124.56，123.63，123.05，122.17，121.23，118.57，112.36，71.23。FT-IR(KBr，cm-1):3062.44(w)，3031.93(w)，1630.08(w)，1580.80(s)，1507.85(w)，1490.85(m)，1412.74(w)，1378.74(w)，1330.10(w)，1279.75(s)，1174.09(s)，1091.45(m)，1027.95(m)，751.17(s)，690.05(s)。MS(ESI):calcdfor[M+H]+，500.1975；found，500.1988。
6、中间体Ⅵ的制备
称取0.40g(8×10-4mol)硝基化合物(中间体Ⅳ)于三口烧瓶内，25mL甲醇做溶剂，氮气保护下75℃回流30min后，加入0.009g Pd/C(8×10-5mol)催化剂，再逐滴加入0.5mL水合肼，TLC示踪反应完全，趁热过滤，滤液旋干，得到黄白色固体0.29g，产率82％。1HNMR(400MHz，Acetone-d6)，δ(ppm):8.59-8.60(J＝4.00，d，1H)，7.80-7.84(m，1H)，7.64-7.66(J＝8.00，d，1H)，7.43-7.45(J＝8.00，d，2H)，7.28-7.33(m，5H)，7.23(s，1H)，7.03-7.07(m，6H)，6.94-7.00(m，5H)，6.73-6.75(J＝8.00，d，1H)，6.26(s，2H)，4.73-4.76(J＝12.00，d，2H)。13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):157.11，148.93，147.09，145.69，138.10，136.90，132.56，129.48，127.93，126.83，129.78，122.92，122.80，121.43，120.85，113.89，109.81，70.50。FT-IR(KBr，cm-1)：3438.86(m)3337.89(s)，3022.85(s)，1619.41(m)，1588.42(s)，1517.15(w)，1435.03(m)，1292.83(m)，1155.97(m)，1046.48(w)，956.22(m)，753.64(s)，700.322(s)，620.91(m)，489.60(w)。MS(ESI):calcdfor[M+H]+，470.2233；found，470.2231。
7、中间体Ⅶ的制备
称取0.10g(2.1×10-4mol)胺基化合物，0.03g(2.5×10-4mol)吡啶-2-甲醛，溶于30mL乙腈中，常温下搅拌，TLC跟踪反应结束后，抽滤，得到的固体用乙醇重结晶，得深黄色固体0.09g，产率76％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):8.71-8.73(J＝8.00，d，1H)，8.68(s，1H)，8.57-8.58(J＝4.00，d，1H)，8.16-8.18(J＝8.00，d，1H)，7.94-7.99(J＝10.00，t，1H)，7.80-7.84(J＝8.00，t，1H)，7.58-7.60(J＝8.00，d，1H)，7.50-7.54(J＝8.00，d，3H)，7.44(s，1H)，7.31-7.35(J＝8.00，d，5H)，7.22-7.26(J＝4.00，d，3H)，7.04-7.12(m，7H)，6.96-6.98(J＝8.00，d，2H)，5.34(s，2H)。13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):160.86，157.02，154.21，151.38，148.95，146.93，146.77，139.55，137.03，136.97，136.92，131.52，129.56，127.60，126.36，124.16，122.92，122.82，121.25，121.01，120.13，112.01，71.03。FT-IR(KBr，cm-1):3022.27(m)，3400.90(w)，1586.39(s)，1495.80(s)，1426.51(m)，1375.08(w)，1326.87(w)，1275.66(s)，1043.25(w)，957.67(w)，756.93(m)，695.07(s)，622.65(m)。MS(ESI):calcdfor[M+H]+，559.2499；found，559.2476。
8、目标产物L的制备
在50mL圆底烧瓶中将硼氢化钠0.02g(5.4×10-4mol)平均分四次加入到15mL含0.1g(1.8×10-4mol)中间体Ⅶ的乙醇溶液中。常温下搅拌反应1.5h，有黄色固体逐渐析出，TLC示踪反应完全后，抽滤，得到的固体用乙醇重结晶，得0.07g浅黄色粉末，产率70％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):8.60-8.61(J＝4.00，d，1H)，8.55-8.56(J＝4.00，d，1H)，7.87-7.91(J＝16.00，t，1H)，7.72-7.76(J＝16.00，t，2H)，7.23-7.43(m，11H)7.0-7.06(m，6H)，6.90-6.95(J＝10.00，t，6H)，6.42-6.44(J＝8.00，d，1H)，6.15-6.18(J＝6.00，t，1H)，5.32(s，2H)，4.48-4.49(J＝4.00，d，2H)。13CNMR(100MHz，DMSO-d6)，δ(ppm):159.17，156.80，145.19，129.42，126.75，125.39，123.77，123.54，123.19，122.93，122.04，121.47，121.11，70.10，48.00。FT-IR(KBr，cm-1):3400.90(m)，3006.77(w)，1589.41(s)，1528.84(m)，1491.28(s)，1429.52(m)，1325.80(w)，1283.62(s)，1233.26(m)，1143.53(m)，1042.60(m)，961.48(m)，749.83(s)，693.67(s)，619.43(w)。MS(ESI):calcdfor[M+H]+，561.2655；found，561.2660。
9、目标产物L对铜离子的识别
如图2-4所示，室温下，用370nm激发目标产物L的混合水溶液时，荧光强度是比较强的，当加入等量的环境和生理上重要的金属离子，如：Ni2+，Hg2+，Zn2+，Ni2+，Mg2+，Pb2+，Ca2+，Cd2+，Ag+，Fe3+，Al3+，Mn2+，Co2+，Cr3+，Li+，K+，Na+，La+，Ba2+时，没有明显荧光强度改变，然而加入铜离子的目标产物L在混合水溶液中的荧光强度下降7倍，并且L与铜的配合物在加入Hcy的时候荧光强度恢复到原本目标产物的强度。此外，L对Cu2+的选择可以裸眼识别并用来检测污水中Cu2+的含量。干扰试验显示，其它各种金属离子和氨基酸不干扰目标产物L和配合物对铜离子及Hcy的识别。
10、目标产物L单光子细胞显影效果的测试
将清洗干净且灭菌的盖玻片放入6孔组织培养板中，宫颈癌细胞(Hela细胞)5×105个/孔的密度接种在直径35mm的6孔板培养皿中，并用DMEM作为细胞培养基进行细胞培养，细胞培养基中含有胎牛血清(10％)、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100ug/mL)。细胞培养皿置于含5％CO2和95％O2的培养箱中维持温度37℃进行细胞培养24h，用PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4，Gibco试剂公司生产)洗涤Hela细胞三次，洗去培养基。然后分别加入4μL目标化合物L的DMSO溶液(1mM)，培养0.5h，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗盖玻片6-7次，滴1mL4％多聚甲醛/PBS溶液固定细胞10min，蒸馏水冲洗盖玻片6-7次。将盖玻片卡在洁净载玻片上，置于激光共聚焦显微镜(LSM-710，Zeiss，德国)下观察细胞形态及荧光摄取情况，结果见图5。
从图5可以清楚地看到，目标产物L以及L-Cu2+-Hcy透过宫颈癌细胞的细胞膜，进入细胞质，并对它完全均匀的着色，说明目标产物对宫颈癌细胞的细胞质具有很高的定位能力。这种双光子材料对于细胞显影材料的筛选、制备、对于生命科学、材料科学等方面都有着重要的意义。
实施例
具体路线如下：
a、冰浴下向250mL烧瓶中加入7.4mLDMF，随后逐滴加入三氯氧磷，继续搅拌，15min后瓶中液体变得粘稠，最后得到白色略带红色固体冻盐。将24.5g(0.1mol)三苯胺加入上述烧瓶中，升温至60℃约30min至冻盐全溶，60-70℃下回流反应1-2h，薄层色谱法判定反应完全，倒入大量1000mL冷水中，以氢氧化钠调节溶液pH＝9，有大量黄绿色固体析出，抽滤，旋干，残余物经色谱柱分离，洗脱剂是正己烷，得到7.81g产物。
b、称取4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛27.3g(1×10-1mol)溶解在200mL甲醇中，室温下边搅拌边分批加入5.7g(1.50×10-1mol)硼氢化钠，反应半小时，有大量固体析出，薄层色谱跟踪反应完全，旋干，大量水洗，抽滤，干燥得白色固体25.3g。
c、将9.31g(3.4×10-2mol)4-二苯氨基苯基甲醇，用水稀释的11.3g(6.8×10- 2mol)KI，1.78g(6.8×10-2mol)PPh3，4.00mLHAc，500mL丙酮及少量催化剂Aliquat336，加入到250mL的圆底烧瓶中，剧烈搅拌下，70-80℃回流反应约3-4天，薄层色谱跟踪反应完全，加水进行多次洗涤，无水硫酸镁干燥有机层，浓缩，然后用苯重结晶得白色固体7.00g。
d、称取中间体Ⅲ3.11g(4.8×10-3mol)，3-羟基-4-硝基苯甲醛0.802g(4.8×10- 3mol)，K2CO30.221g(1.6×10-3mol)及少量催化剂Aliquat336，20mLDMA做溶剂，135-145℃下回流30h，薄层色谱跟踪反应完全，抽滤，滤液用二氯甲烷萃取三次，干燥有机层，柱层析法分离(展开剂比例正己烷：乙醇＝100:1)，得到红色固体0.753g。
e、称取1g(2.45×10-3mol)硝基化合物(中间体Ⅳ)，3.03g(2.2×10-2mol)K2CO3，少许Aliquat336，0.84g(4.90×10-3mol)1-溴-2-甲烷吡啶于圆底烧瓶中,5ml乙醇做溶剂，70-80℃下回流搅拌2-3h，TLC示踪反完全，抽滤，浓缩，二氯甲烷萃取三次，干燥有机层，柱层析法分离(展开剂比例石油醚：二氯甲烷＝20:1)。得到橘黄色固体0.7g，产率为57.2％。
d、250mL的三口圆底烧瓶中加入0.40g(8×10-4mol)中间体Ⅲ和150mL的甲醇，升温至70-80℃下，加入0.009g(8×10-5mol)Pd/C催化剂，并逐滴滴加0.5mL水合肼的10mL甲醇溶液，滴加完毕后，继续回流反应2h，薄层色谱法判定反应完全后。趁热抽滤，滤液中有大量的固体析出，抽滤得乳黄色固体，后旋出滤液中绝大部分乙醇，冷却，有大量固体析出，抽滤，两次抽滤共得到0.29g乳黄色固体。
e、250mL圆底烧瓶中将中间体Ⅳ0.10g(2.1×10-4mol)胺基化合物，溶于30mL乙腈中，常温搅拌2-3h，再逐滴加入0.03g(2.5×10-4mol)2-吡啶甲醛，至固体不再析出，抽滤，重结晶得0.09g黄色粉末。
f、100mL圆底烧瓶中将硼氢化钠0.02g(5.4×10-4mol)分批加到中间体Ⅶ0.1g(1.8×10-4mol)的25mL乙醇溶液中。室温下搅拌反应1-2h，有黄色固体逐渐析出，薄层色谱法判定反应完全后，抽滤，乙醇重结晶，得到0.10g黄色固体。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针，其特征在于：所述双光子荧光探针的结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：按以下步骤操作：
1)、中间体Ⅰ的制备
冰浴下向容器中依次加入DMF、三氯氧磷和三苯胺，在40-80℃下回流2-3h，得到的反应液经分离、洗涤、抽滤，并干燥得淡黄色中间体Ⅰ；
2)、中间体Ⅱ的制备
将中间体Ⅰ溶于乙醇中，然后加入硼氢化钠，搅拌半小时，旋干，水洗，抽滤，并干燥得白色中间体Ⅱ；
3)、中间体Ⅲ的制备
将4-(N,N-二苯基氨基)苯甲醇、KI、三苯基膦以及HAc溶于丙酮中，加入Aliquat336，在60-100℃下回流反应2-5天，洗涤，干燥，浓缩，重结晶得到白色中间体Ⅲ；
4)、中间体Ⅳ的制备
将3-羟基-4-硝基苯甲醛、K2CO3、中间体Ⅲ以及少量催化剂Aliquat336溶于DMA中，120-160℃下回流反应22-30h，反应结束后冷却至室温，洗涤，干燥重结晶得红色中间体Ⅳ；
5)、中间体Ⅴ的制备
将中间体Ⅳ、K2CO3、1-溴-2-甲烷吡啶溶于乙醇中，在50-90℃下回流反应1-3h，反应完全后，浓缩，洗涤，干燥重结晶得黄色中间体Ⅴ；
6)、中间体Ⅵ的制备
将中间体Ⅴ溶解在甲醇溶液中，在催化剂Pd/C的作用下，加入水合肼，50-90℃下，回流反应1-3h结束后，过滤，浓缩重结晶得黄白色中间体Ⅵ；
7)、中间体Ⅶ的制备
将中间体Ⅵ和2-吡啶甲醛溶于乙腈中，搅拌1-4h，抽滤，干燥得黄色中间体Ⅶ；
8)、目标产物L的制备
将中间体Ⅶ、硼氢化钠溶解在乙醇中，常温下搅拌1-3h后，抽滤，重结晶，得到淡黄色目标产物L。
3.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，DMF、三氯氧磷和三苯胺的摩尔用量比为1：1：1。
4.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛、硼氢化钠摩尔用量比为1：1.5。
5.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醇、KI、三苯基膦的摩尔用量比为1：2：2。
6.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，3-羟基-4-硝基苯甲醛、K2CO3、中间体Ⅲ的摩尔用量比为3：1：3。
7.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，中间体Ⅳ、K2CO3、1-溴-2甲烷吡啶的摩尔用量比为1：9：2。
8.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中，中间体Ⅴ、Pd/C的摩尔用量比为10：1。
9.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤7)中，中间体Ⅵ、2-吡啶苯甲醛的摩尔用量比为1：1.2。
10.根据权利要求2所述的一种继发性识别铜离子和Hcy的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤8)中，硼氢化钠、中间体Ⅵ的摩尔用量比为3：1。
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