CN102443018B - 荧光标记的o6-苄基鸟嘌呤及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤，通过不同长度的醚状连接链，在O6-苄基鸟嘌呤的苄基对位或间位引入了1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY荧光基团。本发明提供了一类用于在活细胞中标记功能态MGMT蛋白的小分子荧光探针。该类探针分子是依据MGMT的催化机理而设计的共价抑制剂，它们具有良好的细胞膜通透性，可对细胞内的MGMT产生抑制作用，并对其进行荧光标记，可在制备用于标记活细胞中活性态MGMT的探针分子中的应用；结构通式为：
Description
技术领域
本发明属化学药物，涉及一类在活细胞中标记功能态MGMT蛋白的小分子荧光探针，其制备方法，以及用其进行标记的方法。该类探针是氟硼荧光染料（boron dipyrromethene BODIPY）荧光基团修饰的O6-苄基鸟嘌呤类化合物，具有良好的细胞膜通透性以及对功能态MGMT蛋白的选择性。在活细胞中，它们可以与功能态的MGMT蛋白结合，MGMT蛋白随即催化探针分子结构中的BODIPY-苄基部分共价结合于MGMT第145位半胱氨酸的巯基上，导致功能态的MGMT失活，同时由于获得BODIPY荧光基团而被标记，并能被定性定量检测。
背景技术
近年来，恶性肿瘤的发病率持续升高，已成为严重威胁人类生命的最大杀手之一。目前，化疗已成为临床治疗肿瘤的重要手段，而烷化剂作为传统的化疗药物之一，因其低廉的价格而受到患者青睐，多年来仍然活跃在临床抗肿瘤一线，是临床化疗方案中不可或缺的药品。
烷化剂在体内能形成缺电子活泼中间体或其它具有活泼亲电性基团的化合物，进而与DNA中富电子基团发生共价结合，使DNA分子丧失活性或发生断裂，从而诱导细胞凋亡。DNA结构中有许多可被烷基化的位点，各位点的反应活性不同，烷基化后所造成的损伤程度亦不相同，其中以鸟嘌呤O6-位烷基化所造成的损伤最为严重，是细胞中主要的致突变、致凋亡损伤。
O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6- methylguanine DNAmethyltransferase，MGMT）是从细菌到哺乳动物细胞中广泛存在的DNA损伤修复酶，特异性修复DNA结构中鸟嘌呤O6-位的烷基化损伤。活性态MGMT在不需任何辅助因子或其它蛋白质的条件下，不可逆地催化DNA分子中鸟嘌呤O6-位上的烷基转移至其第145位的半胱氨酸巯基上，使DNA的结构和功能恢复正常，同时自身获得烷基而失活。
MGTM的修复作用是细胞对烷化剂药物产生耐药性的根本原因。肿瘤细胞中MGMT酶活性水平与细胞对烷化剂药物的敏感性直接相关。因此，检测并确定细胞中MGMT酶活水平的高低，有可能预见烷化剂类药物的治疗效果。但由于不同肿瘤细胞中MGMT的酶活水平差异较大，而同种肿瘤组织中MGMT酶活水平也存在显著的个体差异，因此，建立分析肿瘤细胞中MGMT酶活水平的方法，对于实施肿瘤预见性个体化化疗方案，合理使用化疗药物，提高疗效，具有重要的参考意义。
已报导的MGMT酶活水平检测方法包括标记DNA法、标记寡核苷酸法及单克隆抗体法。
标记DNA法和标记寡核苷酸法利用[3H]标记的DNA或[3H]标记的寡核苷酸对MGMT蛋白进行放射性标记。虽然这两种方法都具有较高的灵敏性，但由于用到了放射性同位素，因而对实验条件要求较高，必须在专业实验室内进行；另外，放射性同位素对环境产生的污染危害极大；再者，DNA及寡核苷酸作为生物分子，细胞膜通透性差，使得标记实验只能在细胞匀浆液中进行；其次，标记DNA及标记寡核苷酸的制备过程复杂，稳定性差，不易于长期保存，这些都制约了上述两种方法的广泛应用。
单克隆抗体法虽然避免了放射性同位素的应用，但抗体作为生物分子同样具有细胞膜通透性差、稳定性差的缺点；更重要的是，抗体通过识别抗原表位与蛋白结合，因而结果并不能反映蛋白质的功能状态。
上述3种检测方法，均由于检测试剂的体积大、膜通透性差的缺点而被限制了在活细胞中的应用。与之相反，荧光标记的小分子探针则具有良好的细胞膜通透性，适宜在活细胞中的应用；荧光检测基团与放射性同位素相比，无毒无害且灵敏性高；不仅如此，基于蛋白质的强效抑制剂而设计的小分子荧光探针将特异结合功能态的蛋白质，因而检测结果能真实反映蛋白质在细胞中的功能态水平。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤，具有以下式I通式：
其中：
荧光基团的修饰位置位于苄基的间位或对位；m 代表0-5 的自然数；修饰用的荧光基团氟硼荧光染料（boron dipyrromethene, BODIPY）选用1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY。
本发明的又一个目的是提供式I代表的荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤的制备方法，通过以下2种制备方法实现：
制备方法（1），m代表 1-5：
（A）苄位引入叠氮基醚链的苯甲酸乙酯中间体II的制备：称取适量叠氮基单取代的缩乙醇，溶于干燥四氢呋喃，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量对（或间）溴甲基（或氯甲基）苯甲酸乙酯，继续于室温下反应3小时后，加水焠灭，粗产品以乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后硅胶柱层析纯化，体积比为3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱，得无色油状物II；
（B）苄醇中间体III的制备：称取适量的苯甲酸乙酯中间体II，溶于干燥四氢呋喃中，加入1.5当量LiAlH4，回流搅拌反应3小时后，自然冷至室温，加水焠灭，产品以乙酸乙酯萃取，减压旋除溶剂后，滤液减压浓缩得淡黄色油状物。该油状物继而溶于无水乙醇中，依次加入1当量三乙胺及1当量三氟乙酸乙酯，室温搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，粗产品以硅胶柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯（V/V = 1:1）洗脱，得无色油状物III；
（C）苄基的对/间位引入醚状连接链的O6-苄基鸟嘌呤中间体IV的制备：称取适量中间体III，溶于干燥DMF中，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的6-氯鸟嘌呤，继续于室温搅拌反应5小时，减压蒸除溶剂，所得粗产品以硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（V/V = 30:1）洗脱，得无色胶状物，即为中间体IV；
（D）探针分子I的合成：称取适量中间体IV溶于甲醇中，搅拌溶解后加入5当量的碳酸钾，反应液于60oC搅拌2小时后，冷至室温，减压蒸除溶剂，加入少量无水甲醇，滤除固体不溶物，滤液中依次加入1当量1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯及1当量三乙胺，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，粗产品硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（V/V = 8:1）洗脱，得目的化合物Ia-Ij，为砖红色固体。
合成路线如下：
修饰用的荧光基团氟硼荧光染料（boron dipyrromethene BODIPY）选用1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY；
Ia-Ie：BODIPY荧光基团的修饰位置位于苄基的对位，m 依次为1-5；
If-Ij：BODIPY荧光基团的修饰位置位于苄基的间位，m 依次为1-5。
制备方法（2）：
称取适量O6-[4-(氨甲基)苄基]鸟嘌呤（或O6-[3-(氨甲基)苄基]鸟嘌呤）溶于干燥甲醇中，加入1当量1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯及1.5当量三乙胺，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，甲醇重结晶，得目的化合物Ik-Il，为砖红色固体。合成路线如下：
修饰用的荧光基团氟硼荧光染料（boron dipyrromethene BODIPY）选用1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY，m代表0；
Ik：BODIPY荧光基团的修饰位置位于苄基的对位；
Il：BODIPY荧光基团的修饰位置位于苄基的间位。
本发明的再一个目的是提供所述一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤在制备用于标记活细胞中活性态MGMT的探针分子中的应用。
利用本发明提供的荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤标记活细胞中活性态MGMT通过以下步骤实现：
取待检测细胞接种于培养板，置37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育，至细胞贴壁；加入本发明的荧光探针分子I，使其在培养基中的终浓度为5 μM，细胞继续于37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育5 分钟后，移去培养基，细胞以冷PBS冲洗2次后，置荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm。细胞中荧光信号的分布部位及强弱，与细胞中活性态MGMT蛋白的分布及表达量呈正相关；可同时采用流式细胞仪记录荧光强度，该荧光强度与细胞内活性态MGMT蛋白的表达量呈正相关。
根据文献报导，O6-苄基鸟嘌呤是MGMT蛋白的强效共价抑制剂，它作为MGMT的模拟底物与之结合，并在MGMT的催化作用下将O6-位的苄基部分共价转移至MGMT蛋白结构中第145位半胱氨酸巯基，使MGMT失活。另有文献报导，O6-苄基鸟嘌呤的苄基对位或间位被取代后的类似物，同样具有强效的MGMT蛋白抑制活性。基于此，本发明通过不同长度的醚状连接链，在O6-苄基鸟嘌呤的苄基对位或间位引入了1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY荧光基团，提供了一类用于在活细胞中标记功能态MGMT蛋白的小分子荧光探针。该类探针分子是依据MGMT的催化机理而设计的共价抑制剂，它们具有良好的细胞膜通透性，可对细胞内的MGMT产生抑制作用，并对其进行荧光标记。
鉴于此，本发明提出了一类在活细胞中标记功能态MGMT蛋白的小分子荧光探针。本发明中的荧光探针是MGMT蛋白的强效抑制剂O6-苄基鸟嘌呤的类似物，能特异性识别功能态的MGMT蛋白；探针法分子制备方法简单、稳定性好、具有良好的细胞膜通透性；探针以BODIPY荧光基团作为标记基团，避免了放射性同位素的应用，大大简化了检测方法。
附图说明
图1是荧光探针分子（O6- (3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤）（即Ih）标记Hela S3细胞中活性态的MGMT蛋白；1A图为实验组细胞荧光图像，1B图为竞争组细胞的荧光图像。
图2是荧光探针分子（O6- (3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤）（即Ih）标记HT 29细胞中活性态的MGMT蛋白；2A图为实验组细胞荧光图像，2B图为竞争组细胞的荧光图像。
图3是荧光探针分子（O6- (4-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤）（即Ic）标记HT 29细胞中活性态的MGMT蛋白；3A图为实验组细胞荧光图像，右3B图为竞争组细胞的荧光图像。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1：4-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苯甲酸乙酯的制备(IIc)
称取2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙醇(1.060 g, 6mmol)，溶于干燥四氢呋喃(25 mL)，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的对氯甲基苯甲酸乙酯(1.200 g, 6 mmol)，继续于室温下反应3小时后，加水(10 mL)焠灭，粗产品以乙酸乙酯萃取(50 mL)，有机相经无水硫酸钠干燥10分钟后浓缩，经硅胶柱层析纯化，以石油醚/乙酸乙酯（3:1）洗脱，获得无色油状物(0.950 g, 2.8 mmol)，产率为47%。
δ H (500 MHz, CDCl3) 8.02 (2 H, d, J =8.0), 7.41 (2 H, d, J =8.0), 4.63 (2 H, s), 4.37 (2 H, q, J =7.1), 3.73 – 3.64 (10 H, m), 3.38 (2 H, t, J =5.0), 1.39 (3 H, t, J =7.1)。
实施例2：3-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苯甲酸乙酯的制备(IIh)
称取2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙醇(1.260 g, 7.2 mmol)，溶于干燥四氢呋喃(35 mL)，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的间溴甲基苯甲酸乙酯(1.750 g, 7.2 mmol)，继续于室温下反应3小时后，加水(10 mL)焠灭，粗产品以乙酸乙酯萃取(50 mL)，有机相经无水硫酸钠干燥10分钟后浓缩，经硅胶柱层析纯化，以石油醚/乙酸乙酯（3:1）洗脱，获得无色油状物(1.400 g, 4.1 mmol)，产率为58%。
δ H (500 MHz, CDCl3) 8.01 (1 H, s), 7.96 (1 H, d, J =7.7), 7.56 (1 H, d, J =7.7), 7.42 (1 H, t, J =7.7), 4.61 (2 H, s), 4.38 (2 H, q, J= 7.1), 3.72 – 3.65 (10 H, m), 3.38 (2 H, t, J =5.1), 1.40 (3 H, t, J =7.1)。
实施例3：4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基-苄醇的制备(IIIc)
称取4-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苯甲酸乙酯(0.950 g, 2.8 mmol)，溶于干燥四氢呋喃(40 ml)中，加入1.5 当量的LiAlH4 (0.160 g, 4.2 mmol)，体系于回流条件下搅拌反应3小时后，停止加热，待其自然冷至室温后，加水(5 mL)焠灭，产品以乙酸乙酯(50 mL)萃取，乙酸乙酯相以饱和食盐水(10 mL)洗涤一次后，加入无水硫酸钠干燥10分钟，过滤，滤液减压浓缩得淡黄色油状物。该油状物继而溶于无水乙醇(20 mL)中，依次加入1当量三乙胺(0.280 g, 2.8 mmol)及1当量三氟乙酸乙酯(0.400 g, 2.8 mmol)，室温搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，浓缩后的粗粗产品以硅胶柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯（1:1）洗脱，获得无色油状物(0.530 mg, 1.4 mmol)，两步产率51%。
δ H (500 MHz, CDCl3) 7.36 (2 H, d, J =8.4), 7.33 (2 H, d, J =8.4), 4.69 (2 H, s), 4.55 (2 H, s), 3.69 (2 H, m), 3.65 (4 H, s), 3.64 (4 H, m), 3.49 (2 H, m)。
实施例4：3-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基-苄醇的制备(IIIh)
称取3-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苯甲酸乙酯(1.690 g, 5.0 mmol)，溶于干燥四氢呋喃(50 ml)中，加入1.5 当量的LiAlH4 (323 mg, 7.5 mmol)，体系于回流条件下搅拌反应3小时后，停止加热，待其自然冷至室温后，加水(5 mL)焠灭，产品以乙酸乙酯(50 mL)萃取，乙酸乙酯相以饱和食盐水(10 mL)洗涤一次后，加入无水硫酸钠干燥10分钟，过滤，滤液减压浓缩得淡黄色油状物。该油状物继而溶于无水乙醇(40 mL)中，依次加入1当量三乙胺(0.500 g, 5.0 mmol)及1当量三氟乙酸乙酯(0.710 g, 5.0 mmol)，室温搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，浓缩后的粗粗产品以硅胶柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯（1:1）洗脱，获得无色油状物(1.610 g, 4.4 mmol)，两步产率87 %。
δ H (500 MHz, CDCl3) 7.75 (1 H, m), 7.28 (4 H, m), 4.64 (2 H, s), 4.54 (2 H, s), 3.61 (10 H, m), 3.47 (2 H, m)。
实施例5：O6- (4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(IVc)
称取中间体4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基-苄醇(0.530 g, 1.4 mmol)，溶于干燥DMF(7 mL)，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的6-氯鸟嘌呤(0.120 g, 0.7 mmol)，继续于室温下搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，所得粘稠状粗产品以硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（30:1）洗脱，获得无色胶状物(193 mg, 0.4 mmol)，即为中间体O6- (4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤，产率55 %。
δ H (500 MHz, DMSO) 12.44 (1 H, brs), 9.51 (1 H, brs), 7.81 (1 H, s), 7.48 (2 H, d, J = 8.0), 7.34 (2 H, d, J = 8.0), 6.33 (2 H, brs), 5.47 (2 H, s), 4.49 (2 H, s), 3.57 – 3.48 (10 H, m), 3.35 (2 H, t, J = 5.7)。
实施例6：O6- (3-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(IVh)
称取中间体3-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基-苄醇(0.520 g, 1.4 mmol)，溶于干燥DMF(7 mL)，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的6-氯鸟嘌呤(0.120 g, 0.7 mmol)，继续于室温下搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，所得粗产品以硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（30:1）洗脱，获得无色胶状物(0.205 mg, 0.4 mmol)，即为中间体O6- (4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤，产率58 %。
δ H (500 MHz, DMSO) 12.45 (1 H, brs), 9.51 (1 H, brs), 7.81 (1 H, s), 7.45 (1 H, s), 7.42 (1 H, d, J =7.5), 7.38 (1 H, t, J =7.5), 7.30 (1 H, d, J =7.5), 6.33 (2 H, brs), 5.48 (2 H, s), 4.51 (2 H, s), 3.56 (4 H, s), 3.52 – 3.48 (6 H, m), 3.32 (2 H, t, J =5.7)。
实施例7：O6- (4-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(Ic)
称取O6- (4-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(0.096 g, 0.19 mmol)，溶于甲醇中（10 mL，含2%水），搅拌溶解后加入碳酸钾(0.138 g, 1.0 mmol)，反应液于60oC搅拌2小时后，冷至室温，减压蒸除溶剂，加入少量无水甲醇溶解，过滤除去固体不溶物，滤液中依次加入1,3,5,7-四甲基--8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯(0.086 g, 0.2 mmol)及1当量三乙胺(0.020 g, 0.2 mmol)，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，粗产品硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（8:1）洗脱，获得荧光探针O6- (4-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(0.130 g)，为砖红色固体，产率95%。
δ H (400 MHz, DMSO) 12.43 (1 H, s), 7.85 (1 H, m), 7.81 (1 H, s), 7.49 (2 H, d, J =7.2), 7.35 (2 H, d, J =7.2), 6.44 (1 H, s), 6.37 (1 H, s), 6.32 (2 H, s), 5.47 (2 H, s), 4.50 (2 H, s), 4.29 (1 H, s), 4.12 (1 H, s), 3.56 (4 H, s), 3.52 (4 H, s), 3.39 (2 H, m), 3.18 (2 H, q, J =6.4), 3.08 (1 H, m), 2.79 (1 H, m), 2.58 (1 H, m), 2.05 (2 H, t, J =6.8), 1.59 (1 H, m), 1.48 (3 H, m), 1.29 (2 H, m)。
实施例8：O6- (3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(Ih)
称取O6- (3-(2-(2-(2-(三氟乙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(0.102 mg, 0.2 mmol)，溶于甲醇中（10 mL，含2%水），搅拌溶解后加入碳酸钾(0.138 g, 1.0 mmol)，反应液于60oC搅拌2小时后，冷至室温，减压蒸除溶剂，加入少量无水甲醇溶解，过滤除去固体不溶物，滤液中依次加入1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯(0.086 g, 0.2 mmol)及1当量三乙胺(0.020 g, 0.2 mmol)，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，粗产品硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇（8:1）洗脱，获得荧光探针O6- (3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(0.130 g)，为砖红色固体，产率90%。
δ H (400 MHz, DMSO) 12.45 (1 H, s), 8.06 (1 H, m), 7.81 (1 H, s), 7.45 – 7.33 (3 H, m), 7.28 (1 H, d, J =6.9), 6.32 (2 H, s), 6.22 (2 H, s), 5.47 (2 H, s), 4.47 (2 H, s), 3.53 (4 H, s), 3.50 (4 H, s), 3.41 (2 H, t, J =5.2), 3.21 (2 H, q, J =5.2), 2.92 (2 H, m), 2.50 (6 H, s), 2.39 (6 H, s), 2.28 (2 H, t, J =6), 1.76 (2 H, s)。
实施例9：O6- (4-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-氨甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(Ik)
称取适量O6-[4-(氨甲基)苄基]鸟嘌呤(50 mg, 0.19 mmol)溶于干燥甲醇(10 mL)中，加入1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯(0.086 g, 0.2 mmol)及1.5当量三乙胺(0.030 g, 0.3 mmol)，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，粗产品以甲醇重结晶，获得荧光探针O6-(4-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-氨甲基)苄基-鸟嘌呤(0.070 g)，为砖红色固体，产率63%。
δ H (400 MHz, CDCl3) 8.41 (1 H, m), 7.70 (1 H, s), 7.43 (2 H, d, J =7.4), 7.26 (2 H, d, J =7.4), 6.13 (2 H, s), 6.09 (2 H, s), 5.44 (2 H, s), 4.26 (2 H, s), 2.94 (2 H, m), 2.38 (6 H, s), 2.37 (6 H, s), 2.34 (2 H, t, J =7.2), 1.82 (2 H, m)。
实施例10：O6- (3-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-氨甲基)苄基-鸟嘌呤的制备(Il)
称取适量O6-[4-(氨甲基)苄基]鸟嘌呤(50 mg, 0.19 mmol)溶于干燥甲醇(10 mL)中，加入1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯(0.086 g, 0.2 mmol)及1.5当量三乙胺(0.030 g, 0.3 mmol)，室温搅拌3小时后，减压蒸除易挥发性溶剂，粗产品以甲醇重结晶，获得荧光探针O6-(4-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-氨甲基)苄基-鸟嘌呤(0.059 g)，为砖红色固体，产率52%。
δ H (400 MHz, CDCl3) 8.47 (1 H, m), 7.70 (1 H, s), 7.43 (1 H, s), 7.38 (1 H, d, J =6.8), 7.32 (1 H, d, J =6.8), 7.25 (1 H, d, J =6.8), 6.12 (2 H, s), 5.99 (2 H, s), 5.48 (2 H, s), 4.33 (2 H, s), 2.96 (2 H, m), 2.54 (2 H, m), 1.86 (2 H, m)。
实施例11：利用荧光探针分子O6-(3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ih)标记Hela S3细胞中活性态的MGMT
取对数生长期的Hela S3 细胞，调整浓度后接种于96孔培养板，置37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育，至细胞贴壁；细胞分三组：实验组、阴性对照组、竞争组。实验组细胞中加入终浓度为5 μM的荧光探针分子O6-(3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ih)，继续于37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育5 分钟后，移去培养基，细胞以冷PBS冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm；对于阴性对照孔，加入不含探针的空白溶液孵育；对于竞争组，细胞首先于37oC，5％CO2及饱和湿度下在含有O6-苄基鸟嘌呤（浓度为50 μM）的培养基中孵育30 分钟，然后加入荧光探针分子Ih，保持其终浓度为5 μM，孵育5分钟后，小心移去培养基，细胞以冷PBS小心快速冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm。
从图1中观察，实验组细胞呈现出明亮的荧光，说明探针分子Ih对Hela S3细胞中MGMT蛋白的标记结果非常明显；而竞争组细胞的荧光强度非常弱，这是因为细胞中的MGMT蛋白因其活性位点已被O6-苄基鸟嘌呤占据而失活，使其无法与荧光探针分子作用，从而无法被标记，从而说明荧光探针分子Ih在细胞中是通过特异性结合活性态的MGMT蛋白而使细胞被标记。
实施例12：利用荧光探针分子O6-(3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ih)标记HT 29细胞中活性态的MGMT
取对数生长期的HT 29 细胞，调整浓度后接种于96孔培养板，置37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育，至细胞贴壁；细胞分三组：实验组、阴性对照组、竞争组。实验组细胞中加入终浓度为5 μM的荧光探针分子O6-(3-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ih)，继续于37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育5 分钟后，移去培养基，细胞以冷PBS小心快速冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm；对于阴性对照孔，加入不含探针的空白溶液孵育；对于竞争组，细胞首先于37oC，5％CO2及饱和湿度下在含有O6-苄基鸟嘌呤（浓度为50 μM）的培养基中孵育30 分钟，然后加入荧光探针分子Ih，保持其终浓度为5 μM，孵育5分钟后，小心移去培养基，细胞以冷PBS小心快速冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm。
从图2中观察，实验组细胞呈现出明亮的荧光，说明探针分子Ih对HT 29细胞中MGMT蛋白的标记结果非常明显；而竞争组细胞的荧光强度非常弱，这是因为细胞中的MGMT蛋白因其活性位点已被O6-苄基鸟嘌呤占据而失活，使其无法与荧光探针分子作用，从而无法被标记，从而说明荧光探针分子Ih在细胞中是通过特异性结合活性态的MGMT蛋白而使细胞被标记。
实施例13：利用荧光探针分子O6-(4-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ic)标记HT 29细胞中活性态的MGMT
取对数生长期的HT 29 细胞，调整浓度后接种于96孔培养板，置37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育，至细胞贴壁；细胞分三组：实验组、阴性对照组、竞争组。实验组细胞中加入终浓度为5 μM的荧光探针分子O6-(4-(2-(2-(2-N-(1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄基-鸟嘌呤(Ic)，继续于37oC，5％CO2及饱和湿度下孵育5 分钟后，移去培养基，细胞以冷PBS冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm；对于阴性对照孔，加入不含探针的空白溶液孵育；对于竞争组，细胞首先于37oC，5％CO2及饱和湿度下在含有O6-苄基鸟嘌呤（浓度为50 μM）的培养基中孵育30 分钟，然后加入荧光探针分子Ic，保持其终浓度为5 μM，孵育5分钟后，小心移去培养基，细胞以冷PBS小心快速冲洗2次，置Leica DMI4000B荧光倒置显微镜下观察，激发波长为488 nm，检测波长为525 nm。
从图3中观察，实验组细胞呈现出明亮的荧光，说明探针分子Ic对HT 29细胞中MGMT蛋白的标记结果非常明显；而竞争组细胞的荧光强度非常弱，这是因为细胞中的MGMT蛋白因其活性位点已被O6-苄基鸟嘌呤占据而失活，使其无法与荧光探针分子作用，从而无法被标记，从而说明荧光探针分子Ic在细胞中是通过特异性结合活性态的MGMT蛋白而使细胞被标记。
Claims (3)
1.一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤，具有以下式I通式：
其中：
荧光基团的修饰位置位于苄基的间位或对位，m 代表1-5的自然数；
修饰用的荧光基团选用1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-氟硼荧光染料。
2.根据权利要求1所述的一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤的制备方法，通过以下步骤实现：
（1）苄位引入叠氮基醚链的苯甲酸乙酯中间体II的制备：称取叠氮基单取代的缩乙醇，溶于干燥四氢呋喃，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量对或间溴甲基苯甲酸乙酯或者对或间氯甲基苯甲酸乙酯，继续于室温下反应3小时后，加水焠灭，粗产品以乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后硅胶柱层析纯化，体积比为3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱，得无色油状物II；
（2）苄醇中间体III的制备：称取苯甲酸乙酯中间体II，溶于干燥四氢呋喃中，加入1.5当量LiAlH4，回流搅拌反应3小时后，自然冷至室温，加水焠灭，产品以乙酸乙酯萃取，减压旋除溶剂后，滤液减压浓缩得淡黄色油状物，该油状物继而溶于无水乙醇中，依次加入1当量三乙胺及1当量三氟乙酸乙酯，室温搅拌反应5小时后，减压蒸除溶剂，粗产品以硅胶柱层析纯化，用体积比为1:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱，得无色油状物III；
（3）苄基的对/间位引入醚状连接链的O6-苄基鸟嘌呤中间体IV的制备：称取中间体III，溶于干燥DMF中，加入1当量NaH，室温搅拌5分钟后，加入1当量的6-氯鸟嘌呤，继续于室温搅拌反应8小时，减压蒸除溶剂，所得粗产品以硅胶柱层析纯化，用体积比为30:1的二氯甲烷/甲醇洗脱，得无色胶状物，即为中间体IV；
（4）探针分子I的合成：称取中间体IV溶于甲醇中，搅拌溶解后加入5当量的碳酸钾，反应液回流搅拌2小时后，冷至室温，减压蒸除溶剂，加入少量无水甲醇，滤除固体不溶物，滤液中依次加入1当量1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY-N-琥珀酰亚胺酯及1当量三乙胺，室温搅拌3小时后，减压蒸除溶剂，粗产品硅胶柱层析纯化，用体积比为8:1的二氯甲烷/甲醇洗脱，得目的化合物Ia-Ij，为砖红色固体，合成路线如下：
修饰用的荧光基团选用1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-氟硼荧光染料；
Ia-Ie：氟硼荧光染料荧光基团的修饰位置位于苄基的对位，m 依次为1-5 ；
If-Ij：氟硼荧光染料荧光基团的修饰位置位于苄基的间位，m 依次为1-5 。
3.根据权利要求1所述的一种荧光标记的O6-苄基鸟嘌呤在制备用于标记活细胞中活性态MGMT的探针分子中的应用。
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