CN108997312B - 一种定位线粒体的rna荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定位线粒体的RNA荧光探针：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；可用于检测溶液或细胞中的RNA。本发明的定位线粒体的RNA荧光探针是一种新型的识别RNA并定位线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。可以单一性识别RNA，实现检测RNA的作用，并可以定位在线粒体。

Description

一种定位线粒体的RNA荧光探针
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种RNA荧光探针，尤其涉及一种能够定位线粒体的RNA荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
生物细胞内存在着各种各样的细胞器，它们有着特殊的生理功能，对生命过程起着至关重要的作用。线粒体是众多的细胞器中一个非常重要的动态细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被誉为细胞的“动力工厂”，在细胞生命活动中起着重要的作用。线粒体在细胞生理和稳态中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍会导致固有的凋亡途径，导致各种神经退行性疾病。因此，要进一步了解线粒体功能，就需要在体内成像线粒体。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用——其中转运核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。
RNA主要存在细胞核的核仁去和细胞质中，其在生物体的生长、发育及凋亡的整个过程都起着重要的调控作用，并且许多疾病的发生都与RNA有关。同时，RNA的定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息。目前，与众多商业探针相比，只有分子探针公司提供的典型的商业探针SYTO RNA-Select可用于RNA成像。因此，发展新型结构和功能的RNA探针是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种定位线粒体的RNA荧光探针，该探针选择性好、可专一识别RNA，并定位线粒体。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种定位线粒体的RNA荧光探针，简称MPI，其化学结构式如式（I）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式（I）。
其中，吡啶盐作为线粒体定位基团，通过探针与RNA沟槽区域的嵌合作用识别RNA分子。
一种上述RNA荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）将4-甲基吡啶（1）与碘甲烷在甲醇中加热回流；反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤后过滤，得到黄色固体，即化合物2：
Figure 448217DEST_PATH_IMAGE002
；
（2）化合物2和化合物3在甲醇中，以哌啶为催化剂，保护气氛下加热回流反应；反应结束后冷却到室温，乙酸乙酯萃取，萃取液用二氯甲烷和甲醇混合溶液为淋洗液过层析柱，得RNA荧光探针：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
步骤（1）中，所述4-甲基吡啶与碘甲烷的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。
步骤（2）中，所述化合物2与化合物3的摩尔比为1-1.2:1。反应时间为10-15h。
步骤（2）中，所述淋洗液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。
一种上述RNA荧光探针在检测溶液或细胞中RNA的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述的定位线粒体的RNA荧光探针是一种新型的识别RNA并定位线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。可以单一性识别RNA，实现检测RNA的作用，并可以定位在线粒体。
附图说明
图1是荧光探针MPI的1H NMR图谱；
图2是荧光探针MPI对RNA/DNA的响应；
图3是荧光探针MPI的选择性；
图4是荧光探针MPI对活细胞成像图像；
图5是荧光探针MPI对固定细胞成像图像；
图6是荧光探针MPI对RNase处理后固定细胞成像图像；
图7是荧光探针MPI与商业探针MTR对线粒体的共定位荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 RNA荧光探针MPI的合成
（1）将1.0 g(10.7 mmol)的4-甲基吡啶（1），溶于20mL甲醇中，将碘甲烷0.7mL(10.7 mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为黄色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到黄色固体（2）：
Figure 249951DEST_PATH_IMAGE002
；
（2）将0.28g(1.2mmol)化合物2和0.11g(1mmol)化合物3，溶于20mL甲醇中，加入3滴哌啶做催化剂，在氮气保护下回流反应12h。反应结束后，冷却到室温，EA萃取，用DCM：MeOH（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体（荧光探针MPI），其1H NMR图谱见图1：
Figure 736427DEST_PATH_IMAGE003
。
实施例2 荧光探针MPI对RNA/DNA的响应
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMF母液，浓度为1mM。然后分别取5μL探针母液加入5mL容量瓶中，每个容量瓶中加入同浓度不同体积的RNA或DNA溶液，最后用HEPES缓冲液定容到5mL，使RNA或DNA的浓度与探针浓度的当量比分别为0，26，52，78，104，156，208，260，312，364，416，468，572，624，676，728，780，832，884，936，988，1040，1092。然后进行荧光检测（激发波长460nm）。以RNA或DNA的浓度为横坐标，以525nm处相对荧光强度为纵坐标作图2；由图2可知，RNA或DNA的浓度与探针浓度的当量比均为1092时，与探针本身的相对荧光强度相比，加入RNA后荧光强度增强了6倍，而加入同当量的DNA只增强了两倍。
实施例3 荧光探针MPI的选择性
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMF母液，浓度为1mM；再稀释为浓度为1μM的稀释液。取5mL的MPI稀释液，加入探针和各种干扰物质（氨基酸：Arg、Ser、Ile、Phe、Asp、Val、Ala、His、Thr；GSH、Hcy、Glucose，S2O3 2-；醋酸，NO2 -，N3 -，Br-；Ca2+，K+，Na+，Al3+，Fe2+，Cu2 +；G-M（抗体），LPS（脂多糖），FBS（胎牛血清蛋白））的溶液，再以PBS缓冲液定容，使探针和各种干扰物质的最终浓度分别为1mM，然后进行荧光检测（激发460nm）；不同干扰物质525nm处的相对荧光强度如图3所示。图3结果表明，加入RNA后，探针响应倍数为探针本身的6倍左右，探针MPI对RNA具有高选择性。
实施例4 荧光探针MPI对活细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMF母液，浓度为1 mM。再取20μL用1mL培养基稀释，得终浓度为20μM的探针稀释液。
将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图4所示：荧光探针MPI能够染色活细胞的细胞质和核仁，发出绿色荧光。
实施例5 荧光探针MPI对固定细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMF母液，浓度为1mM。再取20μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为20μM的探针稀释液。
将接种好的细胞用1mL多聚甲醛处理30min后用PBS洗3次，然后用0.5mL 5%的TritonTMX-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图5所示：荧光探针MPI能够染色固定细胞的细胞质和核仁，发出绿色荧光。
实施例6 荧光探针MPI对RNase处理后固定细胞的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMF母液，浓度为1mM。再取20μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为20μM的探针稀释液。
将接种好的细胞用1mL多聚甲醛处理30min后用PBS洗3次，然后用0.5mL 5%的TritonTMX-100处理3min，再加入3μL的RNase（5mg/mL）处理2h，最后在探针稀释液中室温孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图6所示：与图5相比，用RNase处理固定细胞后，细胞内的绿色荧光明显变弱。
实施例7 荧光探针MPI与商业探针MTR定位于线粒体的荧光成像
配制实施例1中制备的荧光探针MPI的DMSO母液，浓度为1 mM。再取5μL母液用培养基稀释至1mL，得终浓度为5μM的探针稀释液。
商业探针MTR配制为1mM的DMSO母液。再取1μL母液用培养基稀释成终浓度为1μM的探针稀释液。
分别将接种好的细胞在两种探针稀释液中37℃孵育30min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（MPI激发波长488nm，发射波段500-550nm；MTR激发波长561nm，发射波段570-620nm），结果如图7所示：商业探针MTR能够定位线粒体中，发出红色荧光；荧光探针MPI能够在线粒体中发出绿色荧光；两者的荧光图像叠加后计算得共定位系数达0.8以上，说明探针MPI能够成功定位于线粒体中。

Claims (1)

1.一种如式（I）所示的RNA荧光探针在制备检测溶液或细胞中RNA试剂中的应用，其特征在于，用于定位线粒体：
Figure 725186DEST_PATH_IMAGE001
式（I）。
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