CN113072534B - 一种rna荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RNA荧光探针及其制备方法和应用，可用于快速的检测、标记或显示细胞中RNA的存在与分布。本发明提供的荧光探针是一类新型的RNA荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，具有低生物毒性、良好的膜通透性的特点，作为RNA荧光探针具有广泛的应用；本发明提供的制备方法简单、纯化方便，并且产率较高。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针制备技术领域，具体涉及一种RNA荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
RNA是细胞代谢的产物，具有蛋白质合成、基因调控、反应催化剂等多种功能。RNA主要包括mRNA、tRNA和rRNA，其中转移RNA(tRNA)携带和转移活化氨基酸；信使RNA(mRNA)是合成蛋白质的模板；核糖体RNA(rRNA)，是细胞合成蛋白质的主要场所。rRNA是最丰富的RNA，产生于核仁，在所有生物体内都可以与核糖体蛋白组装成核糖体。与DNA、mRNA、tRNA相比，rRNA具有更复杂、更复杂的三维结构，由更多样的二维结构折叠而成，如单链、内环、凸起等。RNA主要存在于细胞核的核仁区和细胞质中，其定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息，这些信息与医学诊断和治疗息息相关。因此，活细胞内核糖核酸(RNA)的荧光成像对于了解健康和疾病条件下的生物学和生物化学行为具有重要意义。
荧光成像技术具有高检测灵敏度、生物样品低损伤以及可以动态分析活的样品等优势，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点，受到了生物、生命、医学等学科研究者们的青睐。近年来，人们致力于探索小分子有机荧光探针在生物系统中的RNA成像。目前，唯一的商业化RNA成像染料是所谓的SYTO RNA-select，它发出绿色荧光。由于SYTO RNA-select的结构未知，研究人员很难设计和修改RNA荧光探针的类似物。与其他商业化探针相比，RNA探针应用的非常少。目前已有的RNA探针一般都只通过静电引力实现RNA定位，但是这种探针一般选择性较低，对DNA也有较强的选择性，高效RNA探针的缺乏极大地限制了RNA及其生理上的研究。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种RNA荧光探针，所述RNA荧光探针具有高选择性、良好细胞膜通透性的优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种RNA荧光探针，其结构式如下：
其中，R1＝-H、-CH3O、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-NCH2COOH或
R2＝-NH2或-OH；
本发明还要求保护所述RNA荧光探针的制备方法，其合成路线如下：
进一步的，所述探针的制备包括如下步骤：将化合物A、化合物B溶解于甲醇溶剂中，随后加入乙酸，室温下搅拌反应0.5～2h，反应完成后加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有固体析出，抽滤、层析处理后即得RNA荧光探针。
进一步的，化合物A与化合物B的摩尔比为1：1，甲醇与乙酸的体积比为10：1。
进一步的，层析处理的步骤为：以体积比为20：1的二氯甲烷与甲醇的混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。
本发明还要求保护上述方法制备得到的RNA荧光探针在检测、标记或显示细胞内RNA存在与分布的应用。
进一步的，所述应用包括如下步骤：
(1)将制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液；
(2)将步骤(1)所得的探针母液加入到待测液或生物样品中；
(3)加入RNA后，用荧光光谱仪观察含有RNA荧光探针的待测液的荧光光谱变化；或者将生物样品中的细胞与RNA荧光探针共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内RNA的荧光图像。
进一步的，所述生物样品为活细胞。
进一步的，所述荧光光谱变化指的是：荧光光谱中，648nm处的荧光强度的变化。
进一步的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱，荧光光谱仪激发波长为600nm。
进一步的，所述荧光成像图指的是所述RNA荧光探针能对细胞内RNA进行良好的成像与跟踪。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供的荧光探针是一类新型的RNA荧光探针分子，与功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有低生物毒性、良好的膜通透性，对RNA具有高选择性的特点，作为RNA荧光探针具有广泛的应用，有望开发为RNA的商业定位探针。
(2)本发明提供的一种RNA荧光探针的制备方法，其合成步骤简单、纯化方便，并且产率较高。
(3)本发明提供的一种RNA荧光探针的制备方法，在合成过程中严格控制物质的量，特别是高氯酸，既要缓慢加入，又要控制高氯酸不能过量，否则会破坏荧光探针的结构。
(4)本发明提供的RNA荧光探针，实现了活细胞水平的RNA的标记和跟踪研究。
附图说明
图1是实施例1制得的探针的1H NMR图谱；
图2是实施例1制得的探针的13C NMR图谱；
图3是实施例1制得的探针对RNA的紫外滴定和荧光谱图的变化情况；
图4是实施例1制得的探针和商业探针SYTO RNA select对细胞的荧光成像对比；
图5是实施例1制得的探针对不同细胞的荧光成像；
图6是实施例1制得的探针、DNase和RNase处理后活细胞成像图；
图7是本发明制得的探针的细胞毒性测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
需要说明的是，按照本申请所述的基团的组合，本发明可以至少提供如下9种RNA荧光探针，为了命名方便，其结构式和相应的探针编号如下：
无特殊说明外，本发明中所有试剂均通过市场购买。其中，商业探针SYTO RNA-select购买自赛默飞世尔科技公司。
实施例1
一种RNA荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在圆底烧瓶中，将560mg的化合物A3(分子式为：C13H14BrNO，用量2mmol)和250mg的3-氨基苯硫酚(分子式为：C6H7NS，用量2mmol)溶解于50mL甲醇溶剂中，随后加入5mL乙酸，氮气保护、室温条件下搅拌1h，反应完成后，向圆底烧瓶中加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有沉淀析出，静置一会，抽滤得到粗产品；随后，以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱对所得粗产品进行纯化，得红色固体，即为探针Probe 3。
制备得到的RNA荧光探针的1H NMR谱如图1。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.19(s,1H),7.88(dd,J＝8.9,5.5Hz,2H),7.20(d,J＝1.2Hz,1H),7.15(d,J＝8.9Hz,1H),6.86(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),6.72(s,1H),3.22(d,J＝8.9Hz,6H),3.02(td,J＝6.4,2.6Hz,4H)。
13C NMR如图2。13C NMR(150MHz,CD3OD)δ160.10,155.22,154.49,146.21,143.01,142.51,135.31,129.74,128.95,121.56,119.65,119.18,112.16,110.26,106.03,39.00,28.78,27.91.HRMS(ESI)Calcd for C19H19N2S+([M]+):307.1263,Found,307.1258。
实施例2
一种RNA荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在圆底烧瓶中，将522mg的化合物A1(分子式为：C13H9BrO，用量2mmol)和250mg的3-氨基苯硫酚(分子式为：C6H7NS，用量2mmol)溶解于50mL甲醇溶剂中，随后加入5mL乙酸，氮气保护、室温条件下搅拌1h，反应完成后，向圆底烧瓶中加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有沉淀析出，静置一会，抽滤得到粗产品；随后，以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱对所得粗产品进行纯化，即得探针Probe 1。
实施例3
一种RNA荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在圆底烧瓶中，将560mg的化合物A3(分子式为：C13H14BrNO，用量2mmol)和252mg的3-羟基苯硫酚(分子式为：C6H6OS，用量2mmol)溶解于50mL甲醇溶剂中，随后加入5mL乙酸，氮气保护、室温条件下搅拌1h，反应完成后，向圆底烧瓶中加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有沉淀析出，静置一会，抽滤得到粗产品；随后，以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱对所得粗产品进行纯化，即得探针Probe 9。
实施例4
接着，探究本发明制备得到的Probe 3对RNA的响应光谱。测试方法如下：将实施例1制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液，浓度为10mM。然后在紫外和荧光皿中加入2mL液体(由体积比为8:2的PBS和甲醇溶液混合而成)和2μL探针母液，在皿中不停的加入RNA，直至化合物的紫外和吸收不再改变为止。
当加入150mg/mL的RNA时发现化合物的紫外光谱红移了40nm，荧光光谱中荧光强度增强了4倍，结果如图3所示。
实施例5
接着，比较本发明制备得到的Probe 3和商业探针SYTO RNA-select对细胞的荧光成像。测试方法如下：将实施例1制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液，浓度为1mM。在共聚焦皿中加入1mL细胞培养液，加入3μL配置的探针母液和0.5μL浓度为1mM的商业探针SYTO RNA-select；接着在细胞培养箱中孵育30min，取出后用PBS洗涤2-3次即可。
随后分别用激光共聚焦显微镜对细胞荧光成像，探针Probe 3使用激发波长为638nm的光源激发，收集650-780nm范围，探针Probe与商业探针SYTO RNA-select的皮尔森相关系数为0.90，结果如图4所示。
实施例6
接着，探究本发明制备得到的Probe 3对不同细胞的荧光成像。测试方法如下：将实施例1制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液，浓度为1mM。在共聚焦皿中加入1mL细胞培养液，加入3μL的探针母液，在细胞培养箱中孵育15min。随后分别用激光共聚焦显微镜对细胞荧光成像，探针Probe 3使用激发波长为638nm的光源激发，收集650-780nm范围，结果见图5。
从图中可以看出，探针Probe 3能对细胞内的RNA进行快速的成像，表明Probe 3有较好的膜透过性，且对不同细胞的成像效果无差别。
实施例7
接着，探究本发明制备得到的Probe 3的成像选择性。测试方法如下：将实施例1制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液，浓度为1mM。取出1个共聚焦皿，在其中加入1mL的细胞培养液和3μL的探针母液，共同孵育15min作为对照组；取出1个共聚焦皿在其中加入1mL的细胞培养液，再加入3μL浓度为5mg/mL的DNase处理2h，取出皿用PBS清洗2-3次，再在其中加入1mL的细胞培养液和3μL的探针母液，孵育15min，用PBS洗涤作为实验组1；取出1个共聚焦皿在其中加入1mL的细胞培养液，再加入3μL浓度为5mg/mL的RNase处理2h，取出皿用PBS清洗2-3次，再在其中加入1mL的细胞培养液和3μL的探针母液，孵育15min，用PBS洗涤作为实验组2。试验结果如图6所示。
从图中可以看出本发明制备得到的RNA荧光探针对细胞内的RNA具有较高的选择性。
实施例8
最后，对本发明制备得到的Probe 3进行细胞毒性测试。测试方法如下：分别将消化好的HeLa细胞悬浮液以每孔1×105个细胞180μL-1的密度接种于96孔培养板中，放入细胞培养箱培养24小时。在显微镜观察细胞密度为80～90％时，向每个孔中分别加入20μL实施例1制备得到的Probe 3(浓度分别为0、5、10、15、20和25μM)，然后继续培养24小时，接着加入10μL 5mg/mL的MTT试剂，孵育4-6小时。除去细胞上清液，每孔加入100mL DMSO，放置于摇床上低速震荡10-15min以充分溶解紫色的甲瓒结晶物，通过酶标仪测试甲瓒在570nm处的吸光度并计算细胞的存活率，其中细胞存活率表示为实验组平均值与空白组平均值的百分比。测试结果如图7所示。
从图中可以看到，本发明制备得到的多种RNA荧光探针在细胞内的细胞毒性较弱。
最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。
Claims (6)
1.一种RNA荧光探针，其特征在于，合成路线如下：
具体包括如下步骤：将化合物A、化合物B溶解于甲醇溶剂中，随后加入乙酸，室温下搅拌反应0.5～2h，反应完成后加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有固体析出，抽滤、层析处理后即得所述RNA荧光探针；
其中，R1＝-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或
R2＝-NH2。
2.一种RNA荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
具体包括如下步骤：将化合物A、化合物B溶解于甲醇溶剂中，随后加入乙酸，室温下搅拌反应0.5～2h，反应完成后加入蒸馏水，随后滴加高氯酸至有固体析出，抽滤、层析处理后即得所述RNA荧光探针；
其中，R1＝-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2或
R2＝-NH2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物A与化合物B的摩尔比为1：1，甲醇与乙酸的体积比为10：1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，层析处理的步骤为：以体积比为20：1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。
5.一种权利要求2～4任一项所述方法制备得到的RNA荧光探针在检测、标记或显示细胞内RNA存在与分布的非疾病诊断或治疗的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将制备得到的RNA荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂，制成探针母液；
(2)将步骤(1)所得的探针母液加入到待测液中；
(3)加入RNA后，用荧光光谱仪观察含有RNA荧光探针的待测液的荧光光谱变化。
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