CN113135904B - 羟自由基近红外荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羟自由基近红外荧光分子探针及其制备方法与应用。本发明羟自由基近红外荧光分子探针，选择性强、灵敏度高、响应效果好，并且其近红外吸收与荧光的发射特性使其能避免生物自发荧光干扰，可以检测溶液、细胞中的羟自由基，并很好地运用于细胞成像等。并且，其制备工艺简单，成本低，收率高，具有广阔的应用前景，可以大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明属于荧光分子探针技术，具体涉及一种羟自由基近红外荧光分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
细胞内活性氧是一类反应性物质，主要通过电子转移反应起源于氧，它们在各种细胞过程中起着至关重要的信号传导因子的作用，其中，羟自由基由于具有特别强的氧化性和2.31V的单电子还原电位而备受关注。大量研究证实，羟自由基可以通过碱基的氧化羟基化作用与DNA反应，诱导脂质过氧化，并对蛋白质造成氧化损伤。过量产生的羟自由基与各种氧化应激相关的病理生理过程有关，例如炎症，癌症和心血管疾病等。然而，由于其低浓度，短寿命和高反应性导致的检测困难，在生理和病理过程中羟自由基的性质仍然知之甚少。因此，开发用于生物系统中羟自由基的高灵敏度和选择性检测工具非常重要。
传统检测羟自由基的荧光探针多数都是可见光激发，这种探针在与羟自由基响应后产生的荧光很容易受到生物体自发荧光的干扰。而近红外荧光分子探针具有灵敏度高，选择性好，组织穿透性强，检测方便等优点，相较于传统羟自由基的检测方法具有很大的优势。但是如何得到性能更加优异的近红外荧光分子探针，还需要进一步研究。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种具有良好的选择性的羟自由基近红外荧光分子探针，并提供了其制备方法以及应用。
技术方案：本申请所述一种羟自由基近红外荧光分子探针，其分子式为C35H33INO5 +，结构式如下：
本申请所述的羟自由基近红外荧光分子探针的制备方法，反应路线如下所示：
包括如下步骤：
(1)在惰性气体保护条件下，将化合物1加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，待完全溶解后，加入三乙胺，搅拌反应；
(2)在惰性气体保护条件下，继续加入3,5-二碘水杨酸，搅拌反应；
(3)在惰性气体保护条件下，继续搅拌加热反应；
(4)对步骤(3)得到的反应液进行萃取，合并有机层，减压浓缩，冷冻干燥，所得固体即羟自由基近红外荧光分子探针。
其中，所述化合物1的合成参考文献：J.Huang,Y.Lyu,J.Li,P.Cheng,Y.Jiang,K.Pu,ARenal-Clearable Duplex Optical Reporter for Real-Time Imaging ofContrast-Induced Acute Kidney Injury,Angew Chem Int Ed Engl,131(2019)17960-8.
步骤(1)-(3)中，所述惰性气体优选氮气。
步骤(1)所述化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol:10-15mL。
步骤(1)所述化合物1、三乙胺与步骤(2)所述3,5-二碘水杨酸的优选摩尔比为1:(3-5):(3-5)。
步骤(3)所述搅拌加热至80-90℃进行反应，反应直到溶液变为深蓝色，通常反应10-12h即可。
作为优选，步骤(4)所述萃取的方法为：反应液中加入二氯甲烷和蒸馏水，混匀，震荡，静置，取下层有机溶液层，重复3-4次，合并有机层。
本申请还公开了所述羟自由基近红外荧光分子探针在检测羟自由基中的应用，尤其是在定量检测羟自由基中的应用。
本申请还公开了所述羟自由基近红外荧光分子探针在体外紫外荧光响应和细胞成像中的应用，尤其是在活体细胞的成像中的应用。
本申请的羟自由基近红外荧光分子探针可以制备成用于体外紫外荧光响应和细胞成像的工具或者试剂。
本申请羟自由基近红外荧光分子探针的结构为R-DIOH，其中R基(化合物1)为近红外荧光团，能被近红外光激发并发出波长更长的荧光；DIOH(3,5-二碘水杨酸)作为强吸电子基团，当其与近红外荧光团R基链接后，由于光诱导电子转移效应，DIOH会使荧光团R基的荧光被淬灭，而DIOH基被羟自由基分子进攻后，生成的给电子基羟基会使荧光团R基的荧光恢复。与羟自由基响应前后的荧光变化使其可以实时监测羟自由基分子。并且，荧光分子探针的近红外特性可以使得检测的深度以及分辨率得到提高。通过良好的细胞成像效果，可以看到该探针应用于临床之中的潜力。
有益效果：相比较于现有技术，本申请具有以下优势：提供了一种全新结构的近红外荧光分子探针，以DIOH基团作为响应基团检测羟自由基具有非常优异的选择性；本申请的近红外荧光探针吸收和发射均在近红外区具有较强的生物体穿透性，还能减少生物体自发荧光的干扰；灵敏度高，响应时间短，重复性好，并且其细胞毒性低，生物相容性好，细胞渗透能力强；可以检测溶液中、细胞中的羟自由基，能很好地运用于细胞成像等。此外，本发明合成工艺简单，原料易得，成本低，收率高。
附图说明
图1是本申请羟自由基近红外荧光分子探针的质谱、核磁氢谱表征(氘代甲醇)；
图2是本申请羟自由基近红外荧光分子探针与羟自由基响应的紫外和荧光变化图；
图3是本申请羟自由基近红外荧光分子探针的选择性实验数据图；
图4是本申请羟自由基近红外荧光分子探针的MTT实验数据图；
图5是本申请羟自由基近红外荧光分子探针的共聚焦显微镜细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步说明。
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
实施例中所用化合物1的合成参考文献：J.Huang,Y.Lyu,J.Li,P.Cheng,Y.Jiang,K.Pu,ARenal-Clearable Duplex Optical Reporter for Real-Time Imaging ofContrast-Induced Acute Kidney Injury,Angew Chem Int Ed Engl,131(2019)17960-8.
实施例1
用于检测羟自由基的羟自由基近红外荧光分子探针的制备：
将化合物1(1mmol)加入到圆底烧瓶中，在氮气保护下缓缓加入N,N-二甲基甲酰胺(13mL)，搅拌至完全溶解后，在氮气保护的条件下加入三乙胺(4mmol)，继续搅拌15min，在氮气保护下缓慢加入3,5-二碘水杨酸(4mmol)，搅拌至完全溶解。上述体系在油浴锅中，搅拌加热至85℃，反应10小时，待溶液变为深蓝色后，冷却体系，将圆底烧瓶中的反应液倒入分液漏斗中并加入二氯甲烷和蒸馏水，充分震荡，静置分液漏斗，待分液漏斗中的溶液分层之后，取下层有机层。上述操作重复三次，合并有机层。将得到的溶液减压浓缩，冷冻干燥，得到深蓝色固体，即为目标探针(NRh-DIOH)。
实施例1制备的探针质谱以及核磁氢谱如图1所示，图1A为探针的质谱结果，图1B为探针的核磁氢谱结果。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝8.67-8.54(m,1H),8.28(s,1H),7.97(s,1H),7.69(d,J＝7.2Hz,2H),7.42-7.28(m,3H),7.25-7.20(m,1H),7.09(d,J＝7.8Hz,1H),7.02-6.90(m,1H),6.05-5.93(m,1H),4.01(s,2H),2.71(s,2H),2.57(s,2H),1.89(d,J＝7.2Hz,4H),1.74(s,6H),1.05(t,J＝7.2Hz,3H).[M+]674.3。
实施例2
羟自由基近红外荧光分子探针与羟自由基体外响应紫外和荧光响应实验：
称取6.74mg(10μmol)实施例1制备的探针(NRh-DIOH)溶于1mL DMSO中，配制成10mM探针母液。称取27.8mg FeSO4·7H2O溶于1mL水中(pH＝6)，配制成100mM FeSO4·7H2O母液。芬顿试剂FeSO4·7H2O与H2O2浓度比为1:6，以FeSO4·7H2O的浓度代表羟自由基的浓度。从10mM探针母液中吸取3μL加入到装有3mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)的比色皿中，此时探针浓度为10μM。在比色皿中，加入FeSO4·7H2O(终浓度0-50μM)进行紫外响应实验，加入FeSO4·7H2O(终浓度0-200μM)进行荧光响应实验(激发光波长为650nm)，所得数据经origin软件处理得图2，如图2A所示，探针在加入FeSO4·7H2O前的紫外最大吸收在650nm处，720nm处的荧光发射很低。在加入FeSO4·7H2O之后，650nm处的紫外峰降低，690处的紫外吸收峰逐渐升高，同时，如图2B所示，探针在720nm处的荧光发射极大的增强，结果表明探针与羟自由基具有良好的响应效果，如图2C所示线性结果，经计算得，检测限为5.87nM，检测范围为0.01-30μM。
此外，探针的近红外荧光的发射波长在720nm，组织穿透能力强，在近红外通道的成像时可以有效地避免生物体自发荧光的干扰。
实施例3
羟自由基近红外荧光分子探针对目标物检测的选择性实验：
用DMSO制备实施例1制备的NRh-DIOH探针(1mM)和底物(100mM)。从每个100mM的底物溶液中分别取30μL，分别加入到12个装有2940μL的PBS缓冲液(pH＝7.4)的离心管中混合。然后从1mM的探针溶液中取30μL，分别加入到每个底物溶液中。待测底物为FeSO4·7H2O+H2O2、H2O2、HClO、TBHP、Cys、Hcy、Ser、Pro、GSH、MgCl2、FeCl3、Na2S2O3。用比色皿测定荧光发射光强度。结果如图3所示，只有FeSO4·7H2O+H2O2组显示出了强烈的荧光信号，即本发明的荧光探针对羟自由基有很好的选择性。
实施例4
羟自由基近红外荧光分子探针与HK-2细胞进行MTT生物相容性实验：
在96孔板的外围一圈加入无菌PBS缓冲液(pH＝7.4)，在剩余内部孔中铺满HK-2细胞，在37℃下培养24小时。称取6.74mg实施例1制备的探针溶于1mL生物用DMSO溶液中，配制成10mM生物用探针母液。配制5mg/mL MTT溶液，准备7个5mL无菌离心管，均加入3mL DMEM/F12培养基，依次在离心管中加入0、0.3、0.6、1.5、3、4.5、6μL生物用探针母液。将7个离心管中溶液吸取190μL依次每一横排等浓度加入5排孔中孵育24小时后，在每个孔中加入10μLMTT溶液，37℃继续孵育4小时后，倒掉培养基，在每个孔中均加入100μL DMSO溶液，震摇10分钟，待充分溶解后，进行检测(检测波长为550nm)。用origin软件对数据进行处理得图4，如图所示，在探针浓度达到20μM(6μL生物用探针母液)时，细胞仍有90％以上的存活率，表明探针的生物相容性较好，细胞毒性小。
实施例5
羟自由基近红外荧光分子探针与羟自由基响应的共聚焦显微镜细胞实验：
在两个共聚焦皿中接种适当浓度的HK-2细胞，培养至细胞状态优良，将其中一个共聚焦皿中的培养基吸取干净，加入含有100μM顺铂(CDDP)的DMEM/F12培养基以造模使HK-2细胞过量产生内源性羟自由基，37℃下孵育24小时。将共聚焦皿中的培养基吸取干净，吸取实施例4中生物用探针母液2μL加入到2mL DMEM/F12培养基中充分混匀，并吸入1mL加入到两个共聚焦皿中，37℃下孵育30分钟后，倒掉培养基，加入DAPI染色液分别进行染色30分钟，用无菌PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗3次。共聚焦显微镜拍摄图片如图5，如图所示，未加药物刺激组近红外通道荧光信号较弱，而使用药物刺激组因过量产生羟自由基而出现强烈的荧光信号，表明探针在细胞中能有很好的细胞成像效果。
实施例6
实施例6与实施例1的制备方法相同，化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol:10mL。化合物1、三乙胺、3,5-二碘水杨酸的摩尔比为1:3:3。搅拌加热至80℃进行反应12h，反应直到溶液变深蓝色。
实施例7
实施例7与实施例1的制备方法相同，化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol:15mL。化合物1、三乙胺、3,5-二碘水杨酸的摩尔比为1:5:5。搅拌加热至90℃进行反应10h，反应直到溶液变深蓝色。
Claims (10)
1.一种羟自由基近红外荧光分子探针，其特征在于，分子式为C35H33INO5 +，结构式如下所示：
2.权利要求1所述羟自由基近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在惰性气体保护条件下，将化合物1加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，待完全溶解后，加入三乙胺，搅拌反应；
化合物1
（2）在惰性气体保护条件下，继续加入3,5-二碘水杨酸，搅拌反应；
（3）在惰性气体保护条件下，继续搅拌加热反应；
（4）对步骤(3)得到的反应液进行萃取，合并有机层，减压浓缩，冷冻干燥，所得固体即为羟自由基近红外荧光分子探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）-（3）中，所述惰性气体为氮气。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，每1mmol化合物1对应10-15mLN,N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述化合物1与三乙胺的摩尔比为1:3-5。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述化合物1与3,5-二碘水杨酸的摩尔比为1:3-5。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述反应温度为80-90℃。
8.权利要求1所述羟自由基近红外荧光分子探针在制备检测羟自由基试剂中的应用。
9.权利要求1所述羟自由基近红外荧光分子探针在制备体外紫外荧光响应和细胞成像试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述细胞成像为非疾病的诊断或治疗目的活体细胞成像。
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| CN110540837A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-06 | 湘潭大学 | 一种过氧化氢近红外荧光探针的制备和应用 |
| CN112159396A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-01 | 中国药科大学 | 一种检测γ-谷氨酰转肽酶近红外荧光分子探针及其制备方法与应用 |
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