CN110194900B - 一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于荧光的光学成像技术领域，尤其涉及一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法。该荧光染料由强给体“二乙基氨基”和强受体“三氟甲基”、“丙二腈”共轭组成，分子内电荷转移作用非常强烈，使得荧光染料的最大吸收波长和最大发射波长均达到600nm以上。在磷酸盐缓冲溶液中进行测试发现，其最大吸收波长为602nm，最大发射波长为667nm，达到了近红外光的范畴。其突出的较大的激发波长和发射波长，使得该染料作为细胞或组织成像的染色剂使用时，能有效降低生物体的背景信号干扰，增加信号穿透深度，提高成像质量。同时，因分子内还保留有一个活性的羟基基团，该染料也可作为前体化合物来构建一系列检测细胞内活性组分的荧光探针。

Description

一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法
技术领域
本发明涉及基于荧光的光学成像技术领域，尤其涉及一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法。
背景技术
荧光技术由于具有操作简单，灵敏度高，能实现可视化、无损检测等优势，在生命分析领域被广泛地研究和应用。如细胞成像、活性氧和活性氮的检测、以及肿瘤细胞的可视化诊疗等等方面，荧光染料都发挥了巨大的作用。目前应用较多的荧光染料为荧光素、香豆素、罗丹明、和萘酰亚胺等的衍生物，尽管它们来源丰富，性质研究较为透彻，但是它们普遍都具有一个缺点，即最大吸收波长和最大发射波长均不够长，使得其应用于活细胞、组织或活体的成像时，激发波长较短，难以有较深的组织穿透深度，同时发射波长也大多小于550nm，容易受到生物体背景荧光的干扰，综合起来使得染料难以发挥荧光技术的最优效果。
因此，开发出一种在生物体系中激发波长和发射波长均较长的荧光染料意义重大，这样能充分发挥荧光染料的优势，体现出荧光技术灵敏度高、空间分辨率好的特点。
发明内容
本发明要解决上述问题，提供一种激发波长和吸收波长均较大，可以达到近红外光的范畴的荧光染料及其制备方法和应用方法。
本发明解决问题的技术方案是，提供一种发射近红外光的荧光染料，该荧光染料的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明的另一个目的是提供一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：反应物1和反应物2在弱碱催化剂下发生Knoevenagel缩合反应，得到反应产物；反应流程如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
优选地，于惰性气体保护下进行反应。
优选地，所述反应物1、反应物2和弱碱催化剂的投料摩尔比为1 :（0.8-1.2）:（0.05-1）。
优选地， Knoevenagel缩合反应的反应温度为20-50℃，反应2-24h。
优选地，反应溶剂为有机溶剂。
优选地，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮和乙腈中的一种或多种。
优选地，所述弱碱催化剂包括三乙胺、醋酸铵、醋酸钠、碳酸钾、二异丙基乙基氨、二异丙基氨、吡啶和哌啶中的一种或多种。
优选地，还包括以下步骤：将反应产物纯化后，得到发射近红外光的荧光染料。
优选地，采用硅胶柱层析进行纯化。
本发明还有一个目的是提供一种发射近红外光的荧光染料的应用方法，用于活细胞荧光成像，步骤为：将细胞于荧光染料培养基中培养15-25min后，在激光共聚焦显微镜下观察，激发波长为543nm，荧光收集波长为650-750nm。
本发明的有益效果：
1.荧光染料由强给体“二乙基氨基”和强受体“三氟甲基”、“丙二腈”共轭组成，分子内电荷转移作用非常强烈，使得荧光染料的最大吸收波长和最大发射波长均达到600nm以上。在磷酸盐缓冲溶液中进行测试发现，其最大吸收波长为602nm，最大发射波长为667nm，达到了近红外光的范畴。其突出的较大的激发波长和发射波长，使得该染料作为细胞或组织成像的染色剂使用时，能有效降低生物体的背景信号干扰，增加信号穿透深度，提高成像质量。
2.此外，由于该荧光染料分子内还保留有一个活性的羟基基团，该荧光染料可作为前体化合物来构建一系列检测细胞内活性组分的荧光探针，实用性强。
3.由相对便宜的原料在常规的条件下合成，制备工艺简单，成本较低。
附图说明
图1是一种发射近红外光的荧光染料的合成反应流程图；
图2是一种发射近红外光的荧光染料的质谱图；
图3是一种发射近红外光的荧光染料于磷酸盐缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱图；
图4是一种发射近红外光的荧光染料于磷酸盐缓冲溶液中的荧光光谱图；
图5是一种发射近红外光的荧光染料作为HeLa细胞染色剂的细胞成像图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施方式，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
一种发射近红外光的荧光染料，由图1所示的反应路线图制备。其制备步骤如下：
（1）氩气保护下，将反应物1（0.20 g，1.03 mmol）和反应物2（0.26 g，1.03 mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸钠（4.1mg，0.05 mmol）做催化剂，然后加入3 mL四氢呋喃作反应溶剂，20 ℃下搅拌24h。
（2）旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯（18/1，v/v）。得到一种发射近红外光的荧光染料0.32 g，收率73%。
得到的荧光染料质谱图如图2所示。
得到荧光染料于磷酸盐缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱图和荧光光谱图如图3和图4所示。由图3和图4可知，其最大吸收波长为602nm，最大发射波长为667nm，达到了近红外光的范畴。
这种发射近红外光的荧光染料可用于活细胞的荧光成像实验：
将HeLa细胞于含该荧光染料的培养基中培养20min后，在荧光共聚焦显微镜下观察，激发波长为543nm，荧光收集波长为650-750nm，比例尺20 μm。得到如图5所示的细胞成像图。
由图5所示，经本发明的荧光染料培养的HeLa细胞可见明亮的红色荧光，成像亮度高、质量好。
实施例2
一种发射近红外光的荧光染料，其制备步骤如下：
氩气保护下，将反应物1（0.20 g，1.03 mmol）和反应物2（0.30 g，1.20 mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸铵（38.5 mg，0.50 mmol）做催化剂，然后加入3 mL四氢呋喃和1mL乙醇作反应溶剂，30 ℃下搅拌12h。
旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯（18/1，v/v）。得到一种发射近红外光的荧光染料0.38 g，收率85%。
实施例3
一种发射近红外光的荧光染料，其制备步骤如下：
氩气保护下，将反应物1（0.20 g，1.03 mmol）和反应物2（0.20 g，0.80 mmol）在Schlenk管中混合，并加入三乙胺（0.10 g，1.03 mmol）做催化剂，然后加入3 mL三氯甲烷和1mL乙腈作反应溶剂，50 ℃下搅拌2h。
旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯（18/1，v/v）。得到一种发射近红外光的荧光染料0.27 g，收率62%。
实施例4
一种发射近红外光的荧光染料，其制备步骤如下：
氩气保护下，将反应物1（0.20 g，1.03 mmol）和反应物2（0.27 g，1.05 mmol）在Schlenk管中混合，并加入醋酸铵（38.5mg，0.50 mmol）做催化剂，然后加入3 mL二氯甲烷和1mL丙酮作反应溶剂，25 ℃下搅拌4h。
旋蒸除掉溶剂后，用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯（18/1，v/v）。得到一种发射近红外光的荧光染料0.34 g，收率78%。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种发射近红外光的荧光染料，其特征在于：该荧光染料的结构式如下：
Figure 766990DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种根据权利要求1所述的发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：反应物1和反应物2在弱碱催化剂下发生Knoevenagel缩合反应，得到反应产物；反应流程如下：
Figure 77886DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：于惰性气体保护下进行反应。
4.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：所述反应物1、反应物2和弱碱催化剂的投料摩尔比为1 :（0.8-1.2）: （0.05-1）。
5.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：Knoevenagel缩合反应的反应温度为20-50℃，反应2-24h。
6.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：反应溶剂为有机溶剂。
7.根据权利要求6所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮和乙腈中的一种或多种。
8.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：所述弱碱催化剂包括三乙胺、醋酸铵、醋酸钠、碳酸钾、二异丙基乙基胺 、二异丙基胺 、吡啶和哌啶中的一种或多种。
9.根据权利要求2所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：将反应产物纯化后，得到发射近红外光的荧光染料。
10.根据权利要求9所述的一种发射近红外光的荧光染料的制备方法，其特征在于：采用硅胶柱层析进行纯化。
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