CN105732564B - 一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新的双分子荧光探针,其化学名称为6‑((4‑硝基苄基)氧基)‑2,3,4,4a‑四氢‑呫吨‑1‑酮,本发明还公开了所述双光子荧光探针在检测细胞中硝基还原酶的应用。本发明的探针随硝基还原酶含量的增加荧光强度显著增强,使用本发明公开的探针可通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量,从而评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针,同时涉及其在检测缺氧区域硝基还原酶 (NTR) 中的应用,属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
恶性肿瘤在生长过程中,会存在一种无限制疯狂生长的状态,致使血管中的血液提供的氧气不足以支持细胞的生长,进而形成高度缺氧区域,即为肿瘤乏氧区域。缺氧是实体肿瘤微环境的一个很重要的特征。一般情况下,大部分实体肿瘤内氧含量在5 % 左右,有的肿瘤区域中氧含量甚至能够下降到1 % 左右。缺氧区域的形成使得肿瘤微血管异常,导致癌症化疗药物难以进入该区域,进而降低了抗癌药物的疗效。基于此,评估肿瘤内缺氧区域的缺氧程度在预测癌症治疗的效果和相关研究中非常重要。
目前已报到的检测肿瘤区域缺氧程度的方法有:氧压力测量、血流速度、缺氧标记法等,但是这些检测操作很繁琐,应用不便。由于缺氧生物标记法具有较高的选择性和灵敏度,使其成为一种极为重要的乏氧检测方法。一般而言,缺氧环境中随着氧含量下降会导致生物体内一些还原性酶的含量和活性增加,例如:硝基还原酶、偶氮还原酶和心肌黄酶等。研究也证实,在实体肿瘤内,硝基还原酶的含量增加与缺氧程度密切相关,因此,借助检测硝基还原酶的含量可以用于评价肿瘤区域的缺氧程度。
近几年,科研工作者开发了许多硝基还原酶的荧光探针,但所述大部分探针是激发光波长处于见光区的单分子荧光探针,应用时多有背景干扰、散射干扰等缺陷,灵敏度不高。而双光子荧光探针具有近红外激发、背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择性更高,避免光漂白和光致毒现象产生,以及对生物体伤害小等优点,在生物活体分析检测中显示出很大的优越性,引起科研工作者的广泛关注。但检索发现有关检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针还很稀缺,未见广泛报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种双光子荧光探针,可以用于检测缺氧区域硝基还原酶。利用本发明的探针通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量可于评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。
一种双光子荧光探针,其化学式如下所示:
。
该荧光探针命名为6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮,简称GCTPOC-HY。
上述双光子荧光探针 (GCTPOC-HY) 的制备方法如下:
1)化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 的合成:
在100 mL圆底烧瓶中,加入2,4-二羟基苯甲醛10 mmol,环己烯酮 15 mmol 和三乙烯二胺25 mmol,再加入体积比为1:1的水和1,4-二氧六环混合溶剂60 mL,氮气氛围下,加热回流两天,减压下蒸除溶剂,残渣通过硅胶柱,用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱剂洗脱分离,真空干燥得淡黄色固体6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 ;简称GCTPOC;
。
2)化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 的合成:
将化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 0.3 mmol与4-硝基苄溴0.6 mmol,碳酸钾0.6 mmol溶解在N,N-二甲基甲酰胺3 mL中,室温过夜搅拌,减压下蒸除溶剂,残渣通过硅胶柱,用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱剂洗脱分离,真空干燥,得到化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮。简称:GCTPOC-HY;
。
本发明制备的荧光探针GCTPOC-HY可以应用于检测缺氧区域硝基还原酶,其在缺氧状态下能专一识别硝基还原酶,并以荧光增强方式实现对硝基还原酶的识别。
本发明所述检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针GCTPOC-HY本身由于硝基的强吸电子能力导致d-PET效应而淬灭分子的荧光,当在硝基还原酶作用下,化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮GCTPOC-HY的硝基还原成氨基,并发生1,6-质子转移后,释放出化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (GCTPOC),荧光强度得到大幅度提升。
识别机理如下:
本发明提供的检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针属双光子类荧光探针,其与功能相近的硝基还原酶荧光探针比具有显著优势,且所述探针在水相中的选择性和合成手段也具有新颖性和简便性。
实验证实,本发明提供的检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针制备的溶液,当向其加入硝基还原酶后荧光显著增强,该结果及现象为生物学成像应用奠定了理论基础,预示其在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。相应的,利用本发明的探针通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量可于评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。
附图说明
图1:探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图,探针的浓度:5 µM;
图2:探针在水相中的选择性,其中激发波长为450 nm;探针的浓度:5 µM,选择性例子的浓度为2.5 mM;
图3:探针与硝基还原酶作用的滴定实验,其中激发波长为450 nm;探针的浓度:5µM;
图4:探针与硝基还原酶作用的动力学实验。其中激发波长为450 nm;探针的浓度:5 µM。硝基还原酶浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2.5 µg/mL,测试时间:1 h,测试间隔:5 min;
图5:探针的单光子细胞成像应用,激发波长:488 nm, 发射波段:500-550 nm;
图6:探针的双光子细胞成像应用,激发波长:760 nm, 发射波段:500-550 nm;
图7:探针的核磁1H NMR图谱;
图8:探针的核磁13C NMR图谱;
图9:探针的高分辨质谱图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明.
实施例1
双光子荧光探针的合成工艺为:
1)化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (3) 的合成:
在100 mL圆底烧瓶中,加入2,4-二羟基苯甲醛 (1) 10 mmol,环己烯酮 (2) 15mmol 和三乙烯二胺25 mmol,再加入水/1,4-二氧六环混合溶剂60 mL(V/V=1:1),氮气氛围下,加热回流两天,减压下蒸除溶剂,残渣通过柱层析分离,得淡黄色固体6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (3),简称GCTPOC。产率:15 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 10.17 (s, 1H), 7.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H),7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.41 (dd, J 1=8.0 Hz, J 2 = 2.0 Hz, 1H), 6.29 (d, J =2.4 Hz, 1H), 4.94 (m, 1H), 2.36 (m, 3H), 1.91 (m, 2H), 1.67 (m, 1H); HR-MScalculated for C13H12O3 [M-H]- m/z 215.0703, found 215.0747。
化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (5) 的合成:
将化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (3) 0.3 mmol与4-硝基苄溴 (4) 0.6 mmol,碳酸钾0.6 mmol溶解在N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 3 mL中,室温过夜搅拌,减压下蒸除溶剂,残渣通过柱层析分离,得到化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮 (5)。产率:35 %。其结果简单如图7-图9所示,图7为双光子乏氧荧光探针GCTPOC-HY的核磁1H NMR图谱,确定了化合物中氢原子的数量;图8为双光子乏氧荧光探针GCTPOC-HY的核磁13C NMR图谱,确定了化合物中非对称碳原子的数量;图9为双光子乏氧荧光探针GCTPOC-HY的高分辨质谱图谱,确定了化合物分子量。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 8.27 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.37 (m, 2H), 6.70 (dd, J 1=8.4 Hz, J 2 = 2.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 2.4Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.00 (m, 1H), 2.38 (m, 3H), 1.93 (m, 2H), 1.68 (m,1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): 196.68, 161.61, 157.46, 147.55, 145.00,131.75, 130.58, 128.72, 128.38, 124.12, 116.06, 109.94, 102.48, 75.04, 68.71,38.70, 29.48, 17.79; HR-MS calculated for C20H17NO5 [M-H]- m/z 350.1023, found350.1085。
具体反应式如下:
实施例2
化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针的吸收光谱变化
预先准备1份5 mL的1 mM 本发明制备的双光子荧光探针GCTPOC-HY的二甲基亚砜(DMSO) 溶液,然后分别取25 μL加入2个相同的5 mL容量瓶中,加入DMSO 溶液225 μL,再都加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 500 μM。其中一个加入硝基还原酶磷酸缓冲溶液 (10μg/mL,500 μL),两个容量瓶都用磷酸缓冲液 (PBS,pH = 7.4) 定容到5 mL,37 ℃作用50min,然后进行吸收光谱测试。加入硝基还原酶的一组化合物吸收变强 ,结果见图1,其中,(A)为探针与1.0 μg/mL硝基还原酶作用50 min的吸收曲线;(B)为探针本身的吸收曲线。
实施例3
化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针对不同分子或离子的选择性
配制5 mL浓度为40 mM的各种常规的离子及氨基酸的PBS水溶液及浓度为1 mM的双光子荧光探针作为母液备用;加入25 μL探针母液、225 μL DMSO和500当量的各离子 (或氨基酸) 溶液,用磷酸缓冲液定容至5 mL,摇匀后进行荧光检测(λex = 450 nm, λem= 511nm),建立荧光强度与各离子 (或氨基酸) 的曲线图 (结果见图2)。50 min后检测溶液的荧光发射光谱变化,由图2可以发现,其他离子 (或氨基酸) 对化合物GCTPOC-HY的荧光几乎没有影响,而硝基还原酶的加入使化合物GCTPOC-HY的荧光显著增强。图2中,1-21加入的离子分别为:探针、Na2SO3、NaNO2、NaNO3、NaClO、CaCl2、Na2S、FeSO4、KBr、H2O2、NO、过氧化二叔丁基、过氧化叔丁醇、羟基自由基、叔丁基氧基、MgSO4、LiCl+、Cys、HCy、KI、NTR。
实施例4
不同浓度的硝基还原酶对化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针的荧光滴定检测
配制5 mL浓度为10 μg/mL硝基还原酶的水溶液及浓度为1 mM的双光子荧光探针作为母液备用;配制探针浓度为5 μM,分别与不同浓度的硝基还原酶(0 - 4.0 μg/mL)相互作用,并进行荧光检测(λex = 450 nm, λem= 511 nm),计算各体系中荧光强度,建立荧光强度与硝基还原酶浓度标准曲线。如图3所示,随着硝基还原酶浓度的增加,反应体系荧光强度逐渐增加,当硝基还原酶浓度达到1.5 μg/mL时,反应体系荧光强度达到饱和状态。
实施例5
化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针与硝基还原酶相互作用的动力学测试
配制5 mL浓度为10 μg/mL硝基还原酶的水溶液及浓度为1 mM的本发明的双光子荧光探针作为母液备用;配制探针和硝基还原酶的溶液,其浓度分别为:探针5 μM;硝基还原酶:0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2.5 μg/mL。进行荧光检测(λex = 450 nm, λem= 511nm),每隔5 min测试一次,测试60 min,计算各体系中随时间变化的荧光强度,建立荧光强度与作用时间标准曲线。如图4所示,大约反应50 min,反应体系荧光强度达到饱和状态。
实施例6
化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针的单光子细胞成像测试
将密度为3 × 105 个/mL的癌细胞接种到灭菌的铺有盖玻片 (22 mm × 22 mm)的35 mm培养皿中,在CO2培养箱(温度为37 ℃,5 % CO2)中培养,待细胞贴壁后,分成两组培养,一组在常氧条件(温度为37 ℃,5 % CO2)中培养;另一组在乏氧条件(温度为37 ℃,5 %CO2,1 % O2)中培养,均培养12 h。待培养结束后,向两种条件下的培养皿中加入本发明的双光子荧光探针,使其终浓度分别为20 μM。继续分别在两种条件下培养0.5 h,然后将细胞培养液弃去,用PBS缓冲液冲洗细胞3次,将培养皿中长有细胞的盖玻片取出,制样,用荧光显微镜在单光子条件下分别拍摄两种条件下培养的细胞的荧光照片,发现在乏氧条件下生长的癌细胞发出的荧光明显增强。结果见图5,其中:a) HeLa细胞正常状态下的荧光图; e)HeLa细胞正常状态下的明场图; b) HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的荧光图; f) HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的明场图; c)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞正常状态下的荧光图; g)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞正常状态下的明场图; d)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的荧光图; h)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞乏氧(氧气含量1 %) 的明场图。
实施例7
化合物GCTPOC-HY双光子乏氧荧光探针的双光子细胞成像测试
将实施例6所培养的细胞用荧光显微镜在双光子条件下分别拍摄两种条件下培养的细胞的荧光照片,发现在乏氧条件下生长的癌细胞发出的荧光明显增强。结果见图6,其中:a) HeLa细胞正常状态下的明场图; e) HeLa细胞正常状态下的荧光图; b) HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的明场图; f) HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的荧光图; c)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞正常状态下的明场图; g)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞正常状态下的荧光图; d) 含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的明场图; h)含有探针浓度为20 μM的HeLa细胞乏氧 (氧气含量1 %) 的荧光图。
Claims (2)
1.一种双光子荧光探针,其特征在于,化学式如下所示:
。
2.根据权利要求1所述的双光子荧光探针,其特征在于,采用如下制备方法制备而成:
1)化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮的合成:
在100 mL圆底烧瓶中,加入2,4-二羟基苯甲醛10 mmol,环己烯酮 15 mmol和三乙烯二胺25 mmol,再加入体积比为1:1的水和1,4-二氧六环混合溶剂60 mL,氮气氛围下,加热回流两天,减压下蒸除溶剂,残渣通过硅胶柱,用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱剂洗脱分离,真空干燥得淡黄色固体6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮;
2)化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮的合成:
将化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮0.3 mmol与4-硝基苄溴0.6mmol,碳酸钾0.6 mmol溶解在N,N-二甲基甲酰胺3 mL中,室温过夜搅拌,减压下蒸除溶剂,残渣通过硅胶柱,用石油醚:乙酸乙酯=2:1的洗脱剂洗脱分离,真空干燥,得到化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮。
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