CN107266407B - 一种响应硝基还原酶杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药及其制备方法与应用 - Google Patents
一种响应硝基还原酶杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于硝基还原酶、光刺激的药物和荧光双释放体系的设计与应用，以硝基还原酶为药物释放的靶分子，设计合成了硝基还原酶和光刺激的药物和荧光双释放体系。通过测定前药(CM‑3)的荧光性能，发现前药(CM‑3)可以很好地响应硝基还原酶释放荧光；同时，相比于其他光敏感药物，前药具有更好的稳定性及靶向性；利用MTT法测定其抗肿瘤活性研究，发现化合物(CM‑3)具有高于苯丁酸氮芥的抗肿瘤活性，说明化合物(CM‑3)的靶向性比苯丁酸氮芥更高，为细胞研究中药物的释放提供了一种有效的研究工具。
Description
技术领域
本发明涉及光敏感靶向抗肿瘤药物的释放，具体涉及基于过硝基还原酶、光刺激的抗肿瘤药物苯丁酸氮芥和荧光双释放体系的设计与应用。
背景技术
光作为一种“取之不尽，用之不竭”的外界刺激因素，无需依赖机体内部生理环境的变化，能够在特定的时间和空间控制光敏感类前药释放出活性药物，是药物释放领域最受青睐的刺激手段之一。近年来，制备光敏感前药的报道越来越多，其中香豆素类光敏基团具有易合成、易修饰、易检测、光解速度快和明确的光解机理等优势，得到了广泛的应用。氮芥类药物是应用于临床的一类广谱性抗肿瘤药物，对癌细胞的杀灭能力较强，但由于其本身药代动力学性质(毒副作用大、半衰期短、选择性差、治疗效率低等)的局限，使得它在抗肿瘤的临床应用上受到限制。
发明内容
为了克服上述缺陷，本论文以香豆素为母核，针对肿瘤细胞中过量表达的硝基还原酶(NTR)，利用其特有的反应性能，设计光敏感部位的“开-关”，并合成了具有靶向性的光敏感氮芥类衍生物，实现了抗肿瘤药物释放和荧光示踪的双重目的。
本发明采用以下技术方案：
一种式(CM-3)所示的化合物：
进一步，本发明提供一种式(CM-3)所示的化合物的制备方法，
包括以下步骤：
将式(2)所示化合物溶解于DCM中，依次加入DMAP，DCC，活化5～30min后得混合物，将苯丁酸氮芥溶于DCM中，再加入上述混合物中，反应1～48小时，反应全程在惰性气体保护下进行，反应液经分离纯化，得到所述式(CM-3)所示的化合物；
进一步，本发明所述式(2)所示化合物、DMAP、DCC与苯丁酸氮芥物质的量之比为1:0.1-2:1-2:1-2。
通常，本发明所述DCM总体积用量以式(2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol。本发明所述的惰性气体优选为N2。
进一步，本发明所述分离纯化方法为：反应液加入DCM后水洗，取有机相饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离，所用展开剂为DCM/MeOH＝10:1.收集目标组分，干燥，获得式(CM-3)所示的化合物。
本发明所述DCM为二氯甲烷；DMAP为4-二甲氨基吡啶；DCC为二环己基碳二亚胺。
此外，本发明还提供一种式(CM-3)所示的化合物在制备响应硝基还原酶杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药中的应用。
进一步，本发明所述肿瘤细胞优选为子宫颈癌细胞HeLa、HepG2、MFC-7、F9或TE-1细胞。
更进一步，所述硝基还原酶以水溶液形式存在，浓度为0.2～1.25μg/mL。
再进一步，本发明所述硝基还原酶优选为肿瘤细胞内硝基还原酶。
本发明的反应路线如下：
此外，本发明还制备了以下化合物以进一步验证CM-3的选择性及抗肿瘤活性。
本发明所述化合物(CM-3)可作为荧光监测光敏感靶向抗肿瘤前药，应用于肿瘤细胞药物释放时的荧光监测。所述的硝基还原酶浓度的荧光检测的方法为：以化合物(CM-3)作为荧光探针，与PBS缓冲溶液中的硝基还原酶进行反应，产生荧光，测定在激发为365nm下的荧光强度变化，从而获得硝基还原酶浓度。
其次，以化合物(CM-3)作为荧光探针，与HeLa细胞进行孵化，然后加入外源硝基还原酶进行荧光成像。
本发明所述化合物(CM-3)可作为光敏感靶向抗肿瘤前药，应用于光敏感靶向抗肿瘤药物的释放。所述的药物释放过程的检测方法为：以化合物(CM-3)作为光敏感靶向抗肿瘤前药，与PBS缓冲溶液中的硝基还原酶进行反应，随后对反应液进行UV光照，取不同时段反应液进行高效液相色谱分析，从而获得药物释放过程。
其次，针对肿瘤细胞HeLa、HepG2、MFC-7、F9、TE-1给不同浓度前药CM-3光照前后的细胞活性评价采用一种标准的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)方法。
本发明基于香豆素光敏感的特性，成功设计合成了硝基还原酶激活的光刺激苯丁酸氮芥前药的释放体系，改善了药物苯丁酸氮芥的不良药代动力学。
附图说明
图1为本发明实施例2制得的前药(CM-3)的核磁氢谱。
图2为本发明实施例2制得的前药(CM-3)的核磁碳谱。
图3为本发明实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下加入硝基还原酶水溶液的荧光光谱。
图4为本发明实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下的荧光强度与硝基还原酶浓度之间的关系。
图5为本发明实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下与硝基还原酶反应的荧光强度与随时间变化的关系
图6为本发明实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下加入硝基还原酶和不同生物相关活性小分子的荧光光谱。
图6中，1:Gly,2:Ala,3:Ser,4:Cys,5:Thr,6:Val,7:Leu,8:Ile,9:Met,10:Phe,11:Trp,12:Zn(II),13:Na(I),14:Mg(II),15:K(I),16:Fe(III),17:Fe(II),18:Cu(II),19:Ca(II),20:Pb(II),21:Pb(0),22:Cd(II),23:NTR
图7为本发明实施例2制得的前药(CM-3)的抗HeLa细胞增殖活性。
图8为本发明化合物K1和实施例2制得的前药(CM-3)在子宫颈癌细胞(HeLa)中的共聚焦荧光成像效果图；A)HeLa细胞加入K1；B)HeLa细胞加入CM-3
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
将化合物1(200mg)加入到含有20mL DMF的圆底烧瓶中，完全溶解，加入1.2当量碳酸钾固体，将1.2当量4-溴甲基硝基苯溶于10mL DMF中，缓慢滴加到瓶中，常温反应2h。反应结束后，向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，取有机相用饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产物，经薄层层析分离得到化合物2，所用展开剂为D/M＝10:1，收率60％。
实施例2前药(CM-3)的合成
将化合物2(100mg)投入到含有20mL DCM的圆底烧瓶中，待完全溶解后，依次加入2当量DMAP，2当量DCC，活化10min后，将2倍当量苯丁酸氮芥溶于10mL DCM并注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物CM-3，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率88％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝8.7Hz,2H),7.63(d,J＝8.7Hz,2H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.08(d,J＝8.6Hz,2H),6.97(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.91(d,J＝2.5Hz,1H),6.64(d,J＝8.7Hz,2H),6.36(s,1H),5.26(s,4H),3.71(t,J＝6.9Hz,4H),3.63(dd,J＝10.6,3.8Hz,4H),2.60(t,J＝7.4Hz,2H),2.47(t,J＝7.5Hz,2H),2.02–1.94(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ172.67,161.12,160.58,155.39,149.16,147.82,144.46,142.97,130.01,129.69,127.71,124.72,123.98,113.03,112.18,111.30,110.43,102.27,77.29,77.03,76.78,69.05,60.91,53.55,53.44,40.52,33.86,33.26,26.49.
实施例3前药(CM-3)的合成
将化合物2(100mg)投入到含有20mL DCM的圆底烧瓶中，待完全溶解后，依次加入0.1当量DMAP，1当量DCC，活化10min后，将1倍当量苯丁酸氮芥溶于10mL DCM并注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物CM-3，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率53％。
实施例4化合物3的合成
将化合物1(200mg)加入到含有10mL DMF的圆底烧瓶中，完全溶解，加入1.2当量碳酸钾固体，将1.2当量4-溴甲基苯溶于10mL DMF中，缓慢滴加到瓶中，常温反应2h。反应结束后，向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，取有机相用饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产物，经薄层层析分离得到化合物3，所用展开剂为D/M＝10:1，收率78％。
实施例5化合物K1的合成
将化合物3(80mg)投入到含有10mL DCM的圆底烧瓶中，待完全溶解后，依次加入0.2当量DMAP，1.2当量DCC，活化10min后，将1.2倍当量苯丁酸氮芥溶于10mL DCM并注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入DCM，水洗(7×50mL)，饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物K1，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率91％。
实施例6化合物4的合成
将化合物1(200mg)加入到含有10mL DMF的圆底烧瓶中，完全溶解，加入1.2当量碳酸钾固体，将1.2当量4-溴乙基硝基苯溶于10mL DMF中，缓慢滴加到瓶中，常温反应2h。反应结束后，向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，取有机相用饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得到粗产物，经薄层层析分离得到化合物3，所用展开剂为D/M＝10:1，收率78％。
实施例7化合物K2的合成
将化合物4(110mg)投入到含有10mL DCM的圆底烧瓶中，待完全溶解后，依次加入0.2当量DMAP，1.2当量DCC，活化10min后，将1.2倍当量苯丁酸氮芥溶于DCM并注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入20mL DCM，水洗(7×50mL)，饱和氯化钠洗(2×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物K2，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率52％。
实施例8实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下加入硝基还原酶水溶液的荧光光谱检测。
在离心管中分两组，每组设置三个平行，其中一组含有前药(CM-3)和硝基还原酶，另一组含有前药(CM-3)和H2O，在37℃水浴摇床反应1h。用96孔板通过酶标仪检测其荧光强度。
实验结果表明，在波长460nm处，加入化合物(CM-3)和硝基还原酶的实验组的荧光值比仅加入化合物(CM-3)的对照组荧光值高，证明化合物(CM-3)可以被硝基还原酶激活，随后快速发生水解，生成激活型的光敏感前药，因而释放出荧光,如图3所示。
实施例9实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下的荧光强度与硝基还原酶浓度之间的关系检测。
将化合物(CM-3)与不同浓度的硝基还原酶在水浴摇床下反应，通过酶标仪检测荧光强度变化。与此同时，将等量的超纯水与化合物(CM-3)在同等条件下反应，作为空白对照组。从图4中可以看出，荧光强度随硝基还原酶浓度增加而增高。
实施例10实施例5制得的对照样品K1在pH为7.4条件下的荧光强度与硝基还原酶浓度之间的关系检测。
将化合物K1与不同浓度的硝基还原酶在水浴摇床下反应，通过酶标仪检测荧光强度变化。结果发现，K1的荧光强度与硝基还原酶作用前后并无变化，也与酶浓度无关。
实施例11实施例7制得的对照样品K2在pH为7.4条件下的荧光强度与硝基还原酶浓度之间的关系检测。
将化合物K2与不同浓度的硝基还原酶在水浴摇床下反应，通过酶标仪检测荧光强度变化。结果发现，K2的荧光强度与硝基还原酶作用前后并无变化，也与酶浓度无关。
实施例12实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下与硝基还原酶反应的荧光强度与随时间变化的关系检测。
将化合物(CM-3)和硝基还原酶的反应液置于水浴摇床中，反应不同时间，通过酶标仪检测荧光强度变化。与此同时，将等量的超纯水与化合物(CM-3)在同等条件下反应不同时间，作为空白对照组。从图5中可以看出，荧光强度随反应时间增强而增强。
实施例13实施例2制得的前药(CM-3)在pH为7.4条件下加入硝基还原酶和不同生物相关活性小分子的荧光光谱。
将前药(CM-3)和Gly,Ala,Ser,Cys,Thr,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp,Zn(II),Na(I),Mg(II),K(I),Fe(III),Fe(II),Cu(II),Ca(II),Pb(II),Pb(0),Cd(II),反应，所有实验设置三组平行组，通过酶标仪检测其波长为460nm时的荧光强度。从图6中可以发现，化合物(CM-3)对硝基还原酶具有优异的专一性，除了和硝基还原酶会发生作用外，其它氧负离子和氨基酸以及金属离子并不会诱导产生荧光。
实施例14实施例2制得的前药(CM-3)的抗HeLa细胞增殖活性
将实验设置4个浓度梯度，每组设置3个平行(计算误差)，采用三种不同的加药方式：其一，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入化合物(CM-3)，孵育24h；其三，将肿瘤细胞与(CM-3)共同孵育12h后，进行UV照射15min,再孵育12h。同时设置空白对照组，不加入任何药物，UV照射15min后，孵育24h。通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。由图7可以明显看出，修饰后的前药比原药苯丁酸氮芥具有更好的杀灭肿瘤细胞的能力。
实施例15实施例2制得的前药(CM-3)的抗HepG2细胞增殖活性
将实验设置4个浓度梯度，每组设置3个平行(计算误差)，采用三种不同的加药方式：其一，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入(CM-3)，孵育24h；其三，将肿瘤细胞与(CM-3)共同孵育12h后，进行UV照射15min,再孵育12h。同时设置空白对照组，不加入任何药物，UV照射15min后，孵育24h。通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果表明，在相同给药浓度下(12.5UM)，加入苯丁酸氮芥的细胞存活率(64％)比加入CM-3的细胞存活率(92％)低，说明前药的细胞毒性大大降低，而加入化合物(CM-3)后，经UV光照的化合物(CM-3)给药浓度为25μM时，细胞存活率为32％，表现出对肿瘤细胞较强的杀灭能力。
实施例16实施例2制得的前药(CM-3)的抗MFC-7细胞增殖活性
将实验设置4个浓度梯度，每组设置3个平行(计算误差)，采用三种不同的加药方式：其一，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入(CM-3)，孵育24h；其三，将肿瘤细胞与(CM-3)共同孵育12h后，进行UV照射15min,再孵育12h。同时设置空白对照组，不加入任何药物，UV照射15min后，孵育24h。通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果表明，在相同给药浓度下(12.5UM)，加入苯丁酸氮芥的细胞存活率(58％)比加入(CM-3)的细胞存活率(88％)低，说明前药的细胞毒性大大降低，而加入化合物(CM-3)后，经UV光照的化合物(CM-3)给药浓度为25μM时，细胞存活率为27％，表现出对肿瘤细胞较强的杀灭能力。
实施例17实施例2制得的前药(CM-3)的抗F9细胞增殖活性
将实验设置4个浓度梯度，每组设置3个平行(计算误差)，采用三种不同的加药方式：其一，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入(CM-3)，孵育24h；其三，将肿瘤细胞与(CM-3)共同孵育12h后，进行UV照射15min,再孵育12h。同时设置空白对照组，不加入任何药物，UV照射15min后，孵育24h。通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果表明，在相同给药浓度下(12.5UM)，加入苯丁酸氮芥的细胞存活率(67％)比加入化合物(CM-3)的细胞存活率(91％)低，说明前药的细胞毒性大大降低，而加入化合物(CM-3)后，经UV光照的化合物(CM-3)给药浓度为25μM时，细胞存活率为30％，表现出对肿瘤细胞较强的杀灭能力。
实施例18实施例2制得的前药(CM-3)的抗TE-1细胞增殖活性
将实验设置4个浓度梯度，每组设置3个平行(计算误差)，采用三种不同的加药方式：其一，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，将肿瘤细胞在UV照射15min后加入(CM-3)，孵育24h；其三，将肿瘤细胞与(CM-3)共同孵育12h后，进行UV照射15min,再孵育12h。同时设置空白对照组，不加入任何药物，UV照射15min后，孵育24h。通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。结果表明，在相同给药浓度下(12.5UM)，加入苯丁酸氮芥的细胞存活率(66％)比加入化合物(CM-3)的细胞存活率(93％)低，说明前药的细胞毒性大大降低，而加入化合物(CM-3)后，经UV光照的化合物(CM-3)给药浓度为2 5μM时，细胞存活率为37％，表现出对肿瘤细胞较强的杀灭能力。
实施例19荧光成像定位
首先将HeLa细胞在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24小时，(培养基是含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)。细胞培养24小时以后，用胰酶消化细胞，将细胞转移到细胞成像皿中，继续在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养12小时，待细胞贴壁以后，分别在两组成像皿中加入10μM的实施例2制得的化合物(CM-3)和实施例5制得的化合物K1，继续孵化30分钟。然后在360nm紫外照射1小时后，用PBS缓冲液洗去成像皿里的培养基，分别用荧光成像仪进行荧光成像。从图8中可以看出，加入(CM-3)的细胞中出现较强荧光，表明化合物(CM-3)能进入细胞，并被细胞中的硝基还原酶还原后，在紫外刺激后释放出药物。而加入化合物K1的细胞中并没有出现上述现象，进一步证明了前药(CM-3)的定点释放效果。
Claims (9)
1.一种式(CM-3)所示的化合物：
2.一种如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
将式(2)所示化合物溶解于二氯甲烷中，依次加入二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，活化5～30min后得混合物，将苯丁酸氮芥溶于二氯甲烷中，再加入上述混合物中，反应1～48小时，反应全程在惰性气体保护下进行，反应液经分离纯化，得到所述式(CM-3)所示的化合物；
3.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述式(2)所示化合物、二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺与苯丁酸氮芥物质的量之比为1:0.1-2:1-2:1-2。
4.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述二氯甲烷总体积用量以式(2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol。
5.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于分离纯化方法为：反应液加入二氯甲烷后水洗，取有机相饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离，所用展开剂为二氯甲烷/MeOH＝10:1收集目标组分，干燥，获得式(CM-3)所示的化合物。
6.一种如权利要求1所述的化合物在制备响应硝基还原酶杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为子宫颈癌细胞HeLa、HepG2、MFC-7、F9或TE-1细胞。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述硝基还原酶以水溶液形式存在，浓度为0.2～1.25μg/mL。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述硝基还原酶为肿瘤细胞内硝基还原酶。
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| 新型香豆素光扳机的设计、合成以及其在药物释放中的应用;范观水;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20120615;B016-281 * |
| 硝基还原酶荧光探针的研究进展;万琼琼等;《分析科学学报》;20141031;第30卷(第5期);第755-760页 * |
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