CN107056618B - 一种检测硝基还原酶的荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可以检测硝基还原酶的聚集诱导发光(AIE)型荧光探针，所述荧光探针命名为[2‑(4‑硝基苯基)‑1,1,2‑三苯基]乙烯，简称TPE‑NO2。其化学结构式如(I)所示，本发明提供法人硝基还原酶荧光探针对细胞中的硝基还原酶有响应，本发明的探针可以通过荧光成像对肿瘤细胞乏氧状态下的硝基还原酶进行检测。。

Description

一种检测硝基还原酶的荧光探针
技术领域
本发明涉及一种检测硝基还原酶 (NTR) 的荧光探针，属于有机小分子荧光探针技术领域。
背景技术
乏氧即供氧量不足，是很多疾病的重要特征，比如急性心肌梗死、炎症性疾病以及肿瘤疾病。目前，乏氧状态在临床上已经被作为肿瘤恶化的一种指标，因为恶性肿瘤在生长过程中，其对氧的需求量会增加，而肿瘤组织内的血液供氧不足，最终导致这部分肿瘤组织缺氧，在临床上大部分恶性肿瘤在生长过程中存在缺氧区。这些乏氧细胞不仅减弱了放疗、化疗的疗效，同时也成为了肿瘤复发的根源。因此，评估肿瘤内的缺氧程度在预测癌症治疗的效果和相关研究中至关重要。
检测肿瘤区域缺氧的方法有：血流速度、氧压力测量、缺氧标记法等，但这些检测方法在操作过于繁琐。因此，发展一种简单快捷、灵敏、高效的测试方法尤为重要。荧光探针具有广泛性、高灵敏性和专一性等优点，因而受到广泛关注。研究证明，缺氧环境会导致生物体内硝基还原酶的含量及活性增加。因此，通过检测硝基还原酶含量可以评价肿瘤区域的缺氧程度。
目前，国内外报道了许多检测硝基还原酶的荧光探针，但是这些荧光探针往往在稀溶液状态时具有较强的荧光信号，而在聚集状态或者浓溶液的状态下荧光强度会较小甚至完全淬灭，这就是所说的分子聚集诱导荧光淬灭现象(Aggregation-caused quenching，ACQ)，目前基于分子聚集诱导发光机制的硝基还原酶荧光探针还未曾有人报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明设计了一种检测硝基还原酶的聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE) 型荧光探针，在生物体内聚集，并且在与硝基还原酶作用前后荧光信号发生显著变化。本发明所报道的AIE型硝基还原酶荧光探针在生物活体检测中显示出很大的优越性，本发明的AIE型荧光探针，通过荧光成像技术检测硝基还原酶可用于评价肿瘤区域缺氧程度。
本发明所述的AIE型硝基还原酶荧光探针，命名为[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯，简称TPE-NO2，其化学结构式如式（I）所示：
TPE-NO2的制备反应式如下：
上述检测缺氧区硝基还原酶的AIE型荧光探针 (TPE-NO2) 制备方法如下：将0.01mmol锌粉加入到80 mL重蒸的四氢呋喃溶液中，0℃，氮气保护下搅拌10分钟，缓慢滴加0.055 mmol四氯化钛到上述溶液中，加热回流2小时后，再向其中缓慢滴加0.03 mmol二苯甲酮 (A) 的四氢呋喃 (20 mL) 溶液，继续加热回流12小时。反应结束后加入100 mL 5 %氯化铵水溶液淬灭反应，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂，经过乙醇重结晶后得到灰白色固体粉末1,1,2,2-四苯乙烯 B；将1,1,2,2-四苯乙烯 (B) 10 mmol溶于25 mL二氯甲烷中，0℃下，缓慢加入0.72 mL 浓硝酸和1 mL冰乙酸，0℃下搅拌30分钟后置于室温搅拌6小时，反应结束后加入水，抽滤，水洗至中性，粗产物经过柱层析提纯 (淋洗剂为石油醚：乙酸乙酯=50:1)，得到产物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯C。
识别机理如下：
实验证实，本发明提供的AIE型硝基还原酶荧光探针，在硝基还原酶作用下，其荧光逐渐消失，该结果说明了本发明所述AIE型荧光探针针对硝基还原酶有响应，为生物学成像应用奠定了理论基础，预示着在荧光生物标记领域内具有潜在的应用价值。
附图说明
图1：探针TPE-NO2的核磁表征：1H NMR谱和13C NMR谱；
图2：探针在不同水含量中的荧光光谱图。其中激发波长为405 nm，发射波长为500-550 nm，探针的浓度：10 µM；
图3：探针检测硝基还原酶的动力学实验：激发波长为405 nm，发射波长为500-550nm，探针浓度为10 µM，硝基还原酶浓度分别为0、1、10 µg/mL，测试时间：60 min；
图4：探针检测硝基还原酶浓度的滴定实验。激发波长为405 nm，发射波长为500-550 nm，探针浓度为10 µM，硝基还原酶浓度分别为0、0.25、1、5、10 µg/mL ；
图5：探针在水相中的选择性。激发波长为405 nm，发射波长为500-550 nm，探针浓度为10 µM；
图6：探针的生物活性检测；
图7：探针的细胞成像应用。激发波长：405 nm，发射波长：500-550 nm。
具体实施方式
下面通过实例和附图对本发明进行说明，但本发明不受实例的限制，实例中的化合物号码对应上述化合物中的号码。
实施例1
化合物四苯乙烯(B)的合成：
将0.01 mmol锌粉加入到80 mL重蒸的四氢呋喃溶液中，0℃下，氮气保护下搅拌10分钟后，缓慢滴加0.055 mmol四氯化钛到上述溶液中，加热回流2小时后，再向其中缓慢滴加0.03 mmol二苯甲酮 (A) 的四氢呋喃 (20 mL) 溶液，继续加热回流12小时。反应结束后加入100 mL 5 % 氯化铵水溶液淬灭反应，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂，经过乙醇重结晶后得到灰白色固体粉末1,1,2,2-四苯乙烯 B，简称TPE。产率：90%。
1H NMR (400MHz，CDCl3) δ 7.02-7.04 (m, 8H), 7.09-7.11 (m, 12H)；13C NMR(400MHz，CDCl3) δ 143.75, 140.99, 131.35, 127.67, 126.43.
化合物 [2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯（TPE-NO2）的合成：
将1,1,2,2-四苯乙烯 (B) 10 mmol溶于25 ml二氯甲烷中，0℃下，缓慢加入0.72mL 浓硝酸和1 mL冰乙酸，0℃下搅拌30分钟后置于室温搅拌6小时，反应结束后加入水，抽滤，水洗至中性，粗产物经过柱层析提纯 (淋洗剂为石油醚：乙酸乙酯=50:1)，得到产物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯C，简称TPE-NO2。产率：80%。核磁共振图如图1所示。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.00-7.96 (m, 2H)，7.22-7.21 (m, 1H)，7.19-7.12(m, 10H)，7.07-7.00 (m, 6H)；13C NMR (400MHz, CDCl3) δ 151.05, 145.98, 143.89,142.74, 142.68, 142.54, 138.83, 132.10, 131.27, 131.20, 128.24, 128.12,127.8, 127.57, 127.37, 127.13, 123.05。
实施例2
探针在不同水含量中的荧光光谱图
预先准备1份浓度为1 mM本发明所述的AIE型荧光探针，分别取20 μL于2 mL离心管中，磷酸缓冲液 (PBS，pH=7.4)体积分数分别为：1%、80%、90%、99%用乙腈将体系定容至2mL，进行荧光检测，建立荧光强度随水含量变化的荧光光谱图，如图2所示，PBS为99%时，荧光强度明显增加，说明本发明所述的AIE型荧光探针在水相中聚集发光。
实施例3
探针TPE-NO2与硝基还原酶作用的动力学实验
配制浓度为1 mM本发明所述的AIE型荧光探针、100 μg/mL硝基还原酶水溶液及浓度为1 mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)水溶液作为母液。探针浓度为10 μM，NADH浓度为300 μM，硝基还原酶浓度分别为0、1、10 μg/mL。记录各体系中随时间变化的荧光强度，建立荧光强度随时间变化的标准曲线。如图3所示，反应20 min，反应体系荧光强度达到饱和状态。
实施例4
探针与不同浓度硝基还原酶浓度的滴定实验
配制探针终浓度为10 μM，NADH终浓度为300 μM，分别与不同浓度的硝基还原酶(0-10 μg/mL) 在37 ℃下充分作用30 min后，进行荧光检测 (λex = 405 nm，λem= 500-550nm)，记录各体系中荧光强度，建立不同硝基还原酶浓度与荧光强度的标准曲线。如图4所示。
实施例5
探针对不同离子、活性小分子及氨基酸的选择性
配制4 mL浓度为1 mM本发明所述的AIE型荧光探针，浓度为100 mM的各种常规的离子以及氨基酸的PBS水溶液母液作为备用。
加入20 μL探针母液及500当量的各离子、氨基酸于2 mL磷酸缓冲液中，作用30min后进行荧光检测 (λex = 405 nm，λem= 500-550 nm)，记录各体系荧光强度。如图5所示，本发明所述AIE型探针对其他离子及氨基酸均没有响应，1-15号加入的离子分别是：探针TPE-NO2，H2O2，NaNO2，CaCl2，Cys，FeSO4，GSH，KI，KNO3，MgCl2，Na2S，NaClO，NaHSO3，过氧化叔丁基，NTR (含NADH)。其中激发波长为405nm，发射波长为500-550 nm。
实施例6
探针的生物活性检测
将密度为5×104 个/mL的Hela细胞接种到96孔板中，置于培养箱 (温度为37 ℃，5% CO2) 中培养，待细胞贴壁后，弃掉上清液，分别加入本发明所述AIE型荧光探针，是其终浓度分别为0 μM，1 μM，2 μM，5 μM，10 μM，20 μM，孵育24小时后，每孔加入10 μL浓度为10mg/mL的MTT，继续培养4小时后，弃掉上清液，加入100 μL二甲基亚砜，酶标仪检测吸光度值。由图6可知，本发明所述的AIE型荧光探针生物相容性良好。
实施例7
探针的细胞成像应用
将密度为2×104 个/mL的Hela细胞接种到35 mm培养皿中，置于培养箱 (温度为37 ℃，5% CO2) 中培养，待细胞贴壁后，分成两组培养：一组氧气含量20%，另一组氧气含量1%。培养12小时后，分别向两种培养条件下的细胞加入本发明所述AIE型荧光探针，使其终浓度分别为10 μM，继续培养30分钟，将细胞培养液弃掉，PBS洗3次，用共聚焦显微镜分别拍摄两种培养条件下的细胞如图7所示，其中，(A) Hela细胞在常氧条件下 (20% O2) 培养的荧光成像； (B) Hela细胞加入10 μM本发明所述的AIE型荧光探针在常氧条件下 (20% O2)培养的荧光成像； (C) Hela细胞加入探针 (10 μM) 在乏氧状态 (1% O2) 培养的荧光成像； (D) Hela细胞加入200 μM双香豆素作用30 min后，再加入10 μM探针在乏氧状态 (1%O2) 培养的荧光成像； (E-H) 分别为 (A-D) 的明场成像；(I-L) 分别为 (A-D) 与 (E-H)的组合图。 标尺：20 μm。在含氧量为1%条件下的细胞与探针作用后荧光强度明显降低。而加入硝基还原酶抑制剂——双香豆素后，发现荧光并没有降低，因此证实该探针能够识别细胞内的硝基还原酶。

Claims (1)

1.一种式（I）的化合物在检测硝基还原酶的荧光探针上的应用，其特征在于，所述荧光探针命名为[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯，简称TPE-NO2
式（I）。
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