CN110283583B - γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ‑谷氨酰转肽酶响应型分子探针及其应用。本发明设计合成了一种激活型小分子荧光探针，能够专一性检测体内外γ‑谷氨酰转肽酶水平，不受其他生物分子及酶等干扰。同时，本发明中目标探针被γ‑谷氨酰转肽酶剪切后，荧光强度实现“OFF”到“ON”的转变，且发射波长位于近红外波段，能量低，组织穿透能力强，可以应用于活体荧光成像。通过本发明的制备方法获得γ‑谷氨酰转肽酶响应型探针，酶切后吸收波长显著红移至690 nm，能够实现活体光声成像，为相关疾病的早期诊断提供有效的手段。
Description
技术领域
本发明属于响应型分子探针功能化修饰技术领域，具体涉及一种γ-谷氨酰转肽酶响应型荧光分子探针的制备方法，以及该探针在活体荧光及光声成像上的应用。
背景技术
近年来，随着对肿瘤细胞和肿瘤组织研究的加深，肿瘤已不再被认为是无限恶性增殖的孤立细胞群，而是由多种不同类型的细胞组成的复杂组织。肿瘤组织生长与其周围环境密切相关，肿瘤组织以其独特的代谢方式，形成了多种多样的标志物，从而共同形成了肿瘤微环境。肿瘤特征酶作为最重要的肿瘤标志物之一，参与了多种生物代谢过程，因此，研究肿瘤特征酶具有重要临床价值。
γ-谷氨酰转肽酶作为重要的肿瘤特征酶，其异常的高表达反映出机体的功能障碍和代谢异常，如：肝胆功能异常，糖尿病和宫颈癌等。目前，在众多检测γ-谷氨酰转肽酶的分析方法中，小分子荧光探针大多检测限较高，难以检测低剂量的酶水平，同时探针的激发及发射波段较短，组织穿透能力弱，无法进行活体荧光或光声成像。因此，开发新型近红外发射的激活型小分子荧光探针，应用于活体γ-谷氨酰转肽酶检测，具有重要的科研及临床价值。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明构建一种肿瘤特征酶—γ-谷氨酰转肽酶激活型小分子荧光探针，酶切引发荧光增强，利用其近红外发射的优势，进行深组织活体荧光及光声双模态成像，为肿瘤的早期诊断提供有效手段。
本发明采用以下技术方案：
一种γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针，其具有如下化学结构式：
上述γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷发生甲基化反应，得到化合物1；
（2）在N,N-二甲基甲酰胺存在下，环己酮与三氯氧磷反应，得到化合物2；
（3）化合物1与化合物2发生缩合反应，得到化合物3；
（4）化合物3与间硝基苯酚发生亲核取代反应，得到化合物4；化合物4与无水氯化亚锡发生还原反应，得到化合物5（Indol-NH2）；化合物5与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯发生酰胺化反应，得到化合物6（Indol-Glu-Boc）；
（5）化合物6脱保护，得到γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针，称为Indol-Glu。
上述技术方案中，步骤（1）中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的甲基化反应在乙腈中进行，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷的摩尔比为1∶3。优选的，甲基化反应在氮气保护下进行，甲基化反应为回流反应12 h。
上述技术方案中，步骤（2）中，环己酮与三氯氧磷在N,N-二甲基甲酰胺以及二氯甲烷存在下反应，环己酮、三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：3.75：5。优选的，所述反应为冰浴反应3小时。
上述技术方案中，步骤（3）中，化合物1与化合物2的反应在甲苯/正丁醇的混合溶剂中进行，化合物1与化合物2的摩尔比为2.2：1。优选的，缩合反应在氮气保护下进行，缩合反应为回流反应8h。
上述技术方案中，步骤（4）中，亲核取代反应在碳酸钾存在下、乙腈中反应，化合物3、间硝基苯酚和碳酸钾的摩尔比为1：2.5：2.5；还原反应在浓盐酸存在下、甲醇中进行，化合物4与无水氯化亚锡的摩尔比为1：20；酰胺化反应在缩合剂、有机碱存在下、无水二氯甲烷中进行，化合物5、N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯、缩合剂、有机碱的摩尔比为1：4：5：4.5。优选的，亲核取代反应为室温反应4小时；还原反应在氮气保护下进行，还原反应为回流反应12 h；酰胺化反应为室温反应4 h。
上述技术方案中，缩合剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU），有机碱为N,N-二异丙基乙胺（DIPEA），无水二氯甲烷作为溶剂。
上述技术方案中，步骤（5）中，化合物Indol-Glu-Boc的脱保护反应在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中进行。优选的，脱保护为冰水浴反应1小时，然后室温反应4小时。
上述技术方案中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物5、化合物Indol-Glu（γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针）的化学结构式分别如下：
本发明公开了上述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在细胞荧光成像或者活体荧光成像或者光声成像中的应用；或者上述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备细胞荧光成像试剂、活体荧光成像试剂或者光声成像试剂中的应用；或者上述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备γ-谷氨酰转肽酶检测剂中的应用；或者上述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在检测γ-谷氨酰转肽酶中的应用；或者上述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
（1）本发明中设计合成了一种激活型小分子荧光探针，可定性/定量的检测体内外γ-谷氨酰转肽酶水平，检测限低至0.059 U/L；
（2）本发明中目标探针被γ-谷氨酰转肽酶剪切后，荧光强度实现“OFF”到“ON”的转变，且发射波长位于近红外波段，能量低，组织穿透能力强，可用于活体荧光成像。
（3）本发明中目标探针被γ-谷氨酰转肽酶剪切后，紫外-可见吸收波长显著红移至680 nm，可实现小动物活体光声成像。
附图说明
图1为实施例1中γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子探针的合成示意图；
图2为实施例2中（a）目标探针Indol-Glu与Indol-NH2的紫外可见吸收及荧光光谱，（b）目标探针Indol-Glu和对照组探针Indol-Glu-Boc在γ-谷氨酰转肽酶存在及抑制剂同时存在时的荧光光谱，（c）目标探针Indol-Glu在γ-谷氨酰转肽酶切前后的高效液相色谱变化；（d）目标探针的选择性实验；
图3为实施例3中（a）目标探针Indol-Glu随γ-谷氨酰转肽酶浓度增加荧光光谱变化，（b）对应（a）中荧光强度与γ-谷氨酰转肽酶浓度的线性关系，（c）时间及浓度依赖的目标探针Indol-Glu的最佳发射变化，（d）目标探针Indol-Glu随γ-谷氨酰转肽酶浓度增加紫外-可见吸收光谱变化；
图4为实施例4中（a）目标探针Indol-Glu对不同细胞及抑制剂的共聚焦荧光图像，（b）目标探针Indol-Glu、对照组探针Indol-Glu-Boc与HCT116细胞共培养下的流式细胞分析；
图5为实施例5中目标探针Indol-Glu随γ-谷氨酰转肽酶浓度增加体外光声信号的变化；
图6为实施例6中（a）目标探针Indol-Glu、对照组探针Indol-Glu-Boc以及抑制剂存在下，不同时间点的荧光照片，（b）对应（a）中不同时间点的定量荧光强度，（c）对应（a）中目标探针Indol-Glu在不同时间点相对肌肉荧光强度；
图7为实施例7中（a）目标探针Indol-Glu、对照组探针Indol-Glu-Boc在不同时间点的光声照片，（b）对应（a）中不同时间点的定量光声强度，（c）对应（a）中在不同时间点相对肌肉光声强度。
具体实施方式
下文将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释和说明本发明中的技术方案，而并非旨在限制本发明的范围。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得。
本发明构建、合成γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针：
按照合成步骤：首先，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与碘甲烷发生甲基化反应，得到中间体化合物1；N,N-二甲基甲酰胺存在下，环己酮与三氯氧磷在N，N-二甲基甲酰胺存在下发生反应，得到中间体化合物2；化合物1与化合物2在甲苯/正丁醇的混合溶剂中反应，得到中间体化合物3；化合物3与间硝基苯酚反应在碳酸钾存在的乙腈溶剂中反应，得到中间体化合物4；化合物4与无水氯化亚锡在溶剂甲醇中反应，得到中间体化合物Indol-NH2；化合物Indol-NH2与N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯反应在缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）及有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）存在下反应，得到中间体化合物Indol-Glu-Boc；化合物Indol-Glu-Boc的脱保护基反应在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中进行，得到目标探针Indol-Glu。
γ谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针的细胞成像：
将上述获得的目标探针Indol-Glu溶于含1vol%的DMSO的水中，加入到细胞富集程度达60 %的HCT116细胞培养皿中（5 μM），放置在恒温培养箱孵化30 min，随后吸去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍（2 × 1 mL），最后将每个孔注入1 mL的PBS缓冲液。抑制剂实验中，γ-谷氨酰转肽酶抑制剂GGsTop预先与HCT116细胞共培养30 min后，随后洗去培养液，并将介质换成Indol-Glu（5 μM）再共培养30 min，洗去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍（2 × 1mL），最后将培养皿中注入1 mL的PBS缓冲液并进行共聚焦成像。
（3）γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针的活体荧光成像：
将上述获得的目标探针Indol-Glu及对照组探针Indol-Glu-Boc溶于PBS溶液中（浓度：50 μM，体积：100 μL），以原位注射的方式将探针注入荷瘤（HCT116结肠癌）的BALB/c/nu雌性裸鼠体内，随后置于小动物IVIS Lumina XRMS活体成像系统中（激发波长：690nm，发射波长730 nm），实时观察成像效果，最终通过IVIS活体成像分析软件计算裸鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。抑制剂实验中，相同的荷瘤小鼠预先原位注射γ-谷氨酰转肽酶抑制剂GGsTop（浓度：5 mM，体积：50 μL），30 min后原位注射探针Indol-Glu，随后置于小动物IVIS Lumina XRMS活体成像系统中（激发波长：690 nm，发射波长730 nm），实时观察成像效果，最终通过IVIS活体成像分析软件计算裸鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。
（4）γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子荧光探针的活体光声成像：
将上述获得的目标探针Indol-Glu及对照组探针Indol-Glu-Boc溶于PBS溶液中（浓度：100 μM，体积：200 μL），以尾静脉注射的方式将探针注入荷瘤（HCT116结肠癌）的BALB/c/nu雌性裸鼠体内，同时打开小动物光声断层扫描成像系统，待光声成像仪水浴池中的水温达37 oC时，放入麻醉好的裸鼠，扫描裸鼠的肿瘤部位图像。之后将获得的光声成像数据使用MSOT InSight/inVision分析软件进行重建分析。
实施例1：γ-谷氨酰转肽酶响应型小分子探针的合成与表征
（1）氮气保护下，100 mL圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚（2.09 g，10.0mmol）、碘甲烷（4.26 g，30.0 mmol）以及50 mL乙腈作为溶剂，混合液磁力搅拌并回流12 h。反应完成，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到浅黄色固体产物化合物1（3.16 g，产率：90%），不需进一步处理直接作为下一步原料。
（2）冰浴条件下，100 mL圆底烧瓶中加入16 mL的N,N-二甲基甲酰胺（200 mmol）和16 mL的二氯甲烷混合溶剂，使用恒压滴液漏斗逐滴加入三氯氧磷（24.5 g，150 mmol），滴加完毕后再加入环己酮（4.0 g，40.0 mmol），同时撤去冰浴，混合液回流搅拌反应3 h。反应完成，混合液倒入冰水浴中，搅拌过夜，析出鲜黄色固体后，抽滤，冰丙酮洗涤，得浅黄色固体化合物2（1.90 g，产率：27 %），产物低温冻存，不需进一步处理直接作为下一步原料。
（3）氮气保护下，250 mL圆底烧瓶中加入化合物1（4.46 g，12.7 mmol）、化合物2（1.00 g，5.78 mmol）以及9.0 mL甲苯和67.0 mL正丁醇作为混合溶剂，混合液回流搅拌8h。反应完成，旋转蒸发除去正丁醇，搅拌条件下，将剩余混合物逐滴滴入300 mL石油醚中，静置过夜，待析出红色固体，抽滤，产物使用甲醇重结晶，产物为亮红色晶体化合物3（3.00 g，产率：72 %）。
1H-NMR (d 6 -DMSO, 600 MHz, ppm) δ = 8.34 (d, J = 14.2 Hz, 2H), 8.27 (d,J = 8.6 Hz, 2H), 8.06 (dd, J = 21.6, 8.5 Hz, 4H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 2H),7.63 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 6.32 (d, J = 14.3 Hz,2H), 3.79 (s, 6H), 2.73 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 1.93 (s, 12H), 1.87 (t, 2H). 13C-NMR (d 6 -DMSO, 150 MHz, ppm) δ = 174.25, 142.15, 140.91, 133.87, 131.91,130.78, 130.37, 128.22, 127.83, 126.51, 125.40, 122.72, 112.17, 101.96,51.03, 32.34, 27.31, 26.37. Maldi-Tof: m/z, cal: 583.29, found: 583.23 [M+].
（4）氮气保护下，50 mL圆底烧瓶中加入间硝基苯酚（0.35 g，2.50 mmol）、碳酸钾（0.35 g，2.50 mmol）以及15.0 mL乙腈作为溶剂，常温搅拌15 min，随后加入化合物3（0.71g，1.00 mmol），继续室温反应4 h。反应结束，旋转蒸发除去溶剂，剩余物溶解在适量二氯甲烷中，水洗，真空干燥，得深色产物化合物4（0.74 g，90%），不需进一步处理直接作为下一步原料。
（5）氮气保护下，50 mL圆底烧瓶中加入化合物4（0.74 g, 0.91 mmol）、无水氯化亚锡（4.00 g, 21.10 mmol）、4.0 mL浓盐酸以及30 mL甲醇作为溶剂，混合液回流搅拌反应12 h。反应结束，碳酸钠水溶液调节pH为中性，减压抽滤，浓缩滤液，硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 100：1，v/v），产物为蓝色固体化合物Indol-NH2（0.37 g，产率：66 %）。
1H-NMR (d 6 -DMSO, 600 MHz, ppm) δ = 8.53 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 8.22 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 21.3, 8.5 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.9 Hz, 1H),7.67 (t, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.52 (t, 1H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75-6.68(t,4H), 6.28 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.70-2.65 (m, 4H), 1.95 (s,6H), 1.81 (t, 2H). 13C-NMR (d 6 -DMSO, 150 MHz, ppm) δ = 175.60, 162.65, 156.06,140.57, 138.43, 131.98, 130.77, 130.37, 130.02, 128.13, 127.77, 125.32,122.74, 122.35, 114.92, 114.26, 113.27, 112.00, 97.88, 51.12, 32.31, 28.51,27.86, 20.75. Maldi-Tof: m/z, cal: 433.23, found: 433.17 [M+].
（6）冰水浴条件下，100 mL圆底烧瓶中加入N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯（0.49 g，1.60 mmol）、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（0.76 g，2.00 mmol）、N,N-二异丙基乙胺（0.29 g, 1.80 mmol）以及40 mL无水二氯甲烷作为溶剂，磁力搅拌反应1 h，随后加入化合物Indol-NH2（0.22 g, 0.40 mmol），室温反应4 h。反应结束，减压抽滤，浓缩滤液，硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 100：1，v/v），产物为蓝色固体化合物Indol-Glu-Boc（0.08 g，产率：24 %）。
1H-NMR (CD3OD, 600 MHz, ppm) δ = 8.86 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 8.37 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 8.13-8.06 (m, 3H), 7.79 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.4Hz, 1H), 7.60 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.27 (m, 2H),6.60 (d, J = 15.0 Hz,1H), 4.06 (m, 1H), 3.99 (s, 3H), 2.78-2.72 (m, 4H), 2.56(d, J = 7.2 Hz,2H), 2.25 (m,2H), 2.09 (s, 6H), 1.94 (m, 2H), 1.34 (s, 18H).13C-NMR (d 6 -DMSO, 150 MHz, ppm) δ = 179.53, 171.52, 159.96, 153.39, 144.19,142.76, 140.26, 135.96, 132.79, 131.09, 130.43, 128.34, 127.42, 126.50,123.09, 117.44, 116.63, 114.28, 112.98, 105.45, 83.67, 80.91, 52.59, 33.72,33.28, 29.09, 28.63, 28.17, 27.27, 26.48, 24.12. Maldi-Tof: m/z, cal: 718.38,found: 718.29 [M+].
（7）冰水浴条件下，50 mL圆底烧瓶中加入Indol-Glu-Boc（0.08 g, 1.60 mmol）、10.0 mL干燥的二氯甲烷以及10.0 mL三氟乙酸作为混合溶剂，磁力搅拌反应1 h，随后撤去冰浴，继续室温反应4 h。反应结束，混合液减压浓缩，得到蓝色油状物，硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 10：1，v/v），产物为蓝色固体化合物Indol-Glu（0.02 g，产率：31 %）。
1H-NMR (CD3OD, 600 MHz, ppm) δ = 8.85 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 8.36 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.09-8.07 (m, 2H), 7.80 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.74 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.61 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.8 Hz,1H), 7.29 (s, 1H), 6.60 (d, J = 15.0 Hz, 1H),4.00 (s, 3H), 3.91 (m,1H), 2.79-2.73 (m,4H), 2.54 (m, 2H), 2.18 (m, 2H), 2.09(s, 6H), 1.95 (t, J = 6.0 Hz, 2H). 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz, ppm) δ = 179.85,174.69, 171.74, 160.46, 153.47, 144.85, 144.91, 139.60, 135.37, 133.86,131.80, 130.83, 129.87, 127.74, 127.55, 126.07, 122.18, 117.76, 116.49,114.18, 111.42, 105.70, 104.09, 52.42, 32.35, 31.83, 29.30, 28.78, 26.34,25.50, 23.60. Maldi-Tof: m/z, cal: 562.27, found: 562.20 [M+].
上述反应示意图如图1中的所示。
实施例2：目标探针Indol-Glu的光物理性质及酶切实验
如图2（a）所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu及中间体Indol-NH2用PBS缓冲液稀释至浓度为5 μM，并使用紫外可见分光光度计及荧光分光光度计测其紫外可见光谱及荧光光谱。结果表明，Indol-Glu的最佳吸收波长在585 nm附近，而Indol-NH2的最佳吸收则位于690 nm附近；同时，荧光光谱也具有显著差异，目标探针Indol-Glu无显著荧光发射，而相同条件下，中间体Indol-NH2具有显著的荧光发射。目标探针Indol-Glu、对照组探针Indol-Glu-Boc对γ-谷氨酰转肽酶及其抑制剂的荧光光谱改变如图2（b）所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu用PBS缓冲液稀释至浓度为5 μM，并加入0.1 mM的抑制剂GGsTop，30 min后再加入100 U/L的γ-谷氨酰转肽酶，并于37 °C恒温震荡反应2 h。随着γ-谷氨酰转肽酶的加入，探针Indol-Glu的荧光强度显著增强，而同时加γ-谷氨酰转肽酶及其抑制剂GGsTop，又使荧光强度恢复到本底水平。对照组探针随γ-谷氨酰转肽酶的加入，荧光强度几乎没有变化。如图2（c）所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu用PBS缓冲液稀释至浓度为5 μM，并加入100 unit L-1的γ-谷氨酰转肽酶，并于37 °C恒温震荡反应2 h，随后取80 μL反应液进行高效液相色谱分析。同时将化合物Indol-Glu和化合物Indol-NH2的甲醇溶液进行高效液相色谱分析。Agilent 1260高效液相色谱仪对探针Indol-Glu及酶切产物的分析结果表明，单纯的探针Indol-Glu的保留时间在7.02 min，加入γ-谷氨酰转肽酶后，体系的保留时间延长至9.37 min，同时酶切中间体化合物Indol-NH2的保留时间也为9.37 min，验证了酶切过程的存在以及酶切产物的形成。如图2（d）所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu用PBS缓冲液稀释至浓度为5 μM，选用多种代表性生物分子及酶，相同条件下测其荧光光谱的改变。结果表明探针仅对γ-谷氨酰转肽酶具有响应，证实了探针具有对γ-谷氨酰转肽酶的单一选择性。
实施例3：目标探针Indol-Glu对γ-谷氨酰转肽酶的响应性
如图3（a）所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu用PBS缓冲液稀释至浓度为5 μM，并加入不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶（0-100 unit L-1），测试体系的荧光光谱改变。结果表明单纯探针Indol-Glu的荧光强度较低，随着γ-谷氨酰转肽酶的增加，荧光强度依次增大，当γ-谷氨酰转肽酶浓度达到80 unit L-1时，荧光强度达到峰值。图3（b）为3（a）在γ-谷氨酰转肽酶浓度为0-60 unit L-1范围内拟合的线性关系。图3（c）为探针Indol-Glu酶切过程的动力学性质，即随时间和γ-谷氨酰转肽酶浓度变化，荧光强度的改变。图3（d）为探针随着γ-谷氨酰转肽酶浓度的增加，紫外-可见吸收光谱的变化。可以看出，本发明设计合成的激活型小分子荧光探针，可定性/定量的检测体内外γ-谷氨酰转肽酶水平，检测限低至0.059 U/L。
实施例4：目标探针的共聚焦荧光成像及流式细胞分析
采用同样的的培养方法，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu与HCT116细胞/3T3细胞共培养，随后用Olympus显微镜进行观察，如图4（a）所示。实验结果表明探针对于过表达γ-谷氨酰转肽酶的HCT116细胞具有明显的成像效果；而由于正常的3T3细胞内γ-谷氨酰转肽酶水平正常，荧光信号不明显。抑制剂实验表明，预先用GGsTop处理过的HCT116细胞，由于γ-谷氨酰转肽酶活性受抑制，同样不表现明显的荧光信号。图4（b）为相同孵育条件下的流式细胞分析，与空白对照组相比，可直观看出加入目标探针Indol-Glu后荧光信号的增强；抑制剂GGsTop的预处理，使得荧光信号与空白对照组相当。
实施例5：目标探针的体外光声成像
如图5所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu用PBS缓冲液稀释至浓度为5μM，并加入不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶（0-100 unit L-1），使用光声成像系统测试其光声成像效果。实验结果表明，随着γ-谷氨酰转肽酶浓度的增加，波长位于690 nm处的光声信号显著增强。
实施例6：目标探针活体荧光成像
如图6所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu及对照组探针Indol-Glu-Boc溶于PBS溶液中（浓度：50 μM，体积：100 μL），以原位注射的方式将探针注入荷瘤（HCT116结肠癌）的BALB/c/nu雌性裸鼠体内，随后置于小动物IVIS Lumina XRMS活体成像系统中（激发波长：690 nm，发射波长730 nm），实时观察成像效果，最终通过IVIS活体成像分析软件计算裸鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。抑制剂实验中，相同的荷瘤小鼠预先原位注射γ-谷氨酰转肽酶抑制剂GGsTop（浓度：5 mM，体积：50 μL），30 min后原位注射探针Indol-Glu，随后置于小动物IVIS Lumina XRMS活体成像系统中（激发波长：690 nm，发射波长730 nm），实时观察成像效果，最终通过IVIS活体成像分析软件计算裸鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。
实验结果表明，与对照组及抑制剂组相比，实验组在注射探针15 min后在肿瘤部位即显示较强的荧光信号，且荧光信号持续增强，并在1 h达到最强，随后荧光强度逐渐降低，4 h左右恢复至本底水平左右。定量实验结果表明，实验组探针在1 h时，绝对荧光强度是对照组的2.3倍，是抑制剂组的4.9倍。
实施例7：目标探针活体光声成像
如图6所示，将实施例1中制得的目标探针Indol-Glu及对照组探针Indol-Glu-Boc溶于PBS溶液中（浓度：100 μM，体积：200 μL），以尾静脉注射的方式将探针注入荷瘤（HCT116结肠癌）的BALB/c/nu雌性裸鼠体内，同时打开小动物光声断层扫描成像系统，待光声成像仪水浴池中的水温达37 °C时，放入麻醉好的裸鼠，扫描裸鼠的肿瘤部位图像。之后将获得的光声成像数据使用MSOT InSight/inVision分析软件进行重建分析。
实验结果表明，与对照组相比，实验组在注射探针2 h后在肿瘤部位即显示较强的光声信号，且光声信号持续增强，并在8 h达到最强，随后光声强度逐渐降低，24 h时光声信号降至较低水平。定量实验结果表明，实验组探针在8 h时，光声强度是对照组的1.9倍。与肿瘤周围肌肉组织相比，8 h时实验组光声强度是肌肉的5.0倍，对照组光声强度是肌肉的2.3倍。
Claims (8)
1.一种γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针，所述分子探针具有如下化学结构式：
2.权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在细胞荧光成像或者活体荧光成像或者光声成像中的应用。
3.权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备细胞荧光成像试剂、活体荧光成像试剂或者光声成像试剂中的应用。
4.权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备γ-谷氨酰转肽酶检测剂中的应用。
5.权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在检测γ-谷氨酰转肽酶中的应用。
6.权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。
7.利用权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针进行细胞成像的方法，其特征在于，包括以下步骤，将所述γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针溶液加入细胞中，培养孵化后吸去培养液，然后加入缓冲液，进行荧光检测；完成细胞成像。
8.根据权利要求7所述细胞成像的方法，其特征在于，γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针溶液的溶剂为含1%的DMSO的水；细胞为表达γ-谷氨酰转肽酶的细胞。
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