CN114105823A - 一种荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种荧光探针及其制备方法和应用，涉及环境分析、生物分析检测技术领域，荧光探针化合物具有如式(Ⅶ)所示的结构式，且该荧光探针的制备包括：合成2‑(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯基)‑丙二腈；2‑(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯基)‑丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛反应，合成2‑(3‑(4‑氨基苯乙烯基)‑5,5‑二甲基环己‑2‑烯基)‑丙二腈；2‑(3‑(4‑氨基苯乙烯基)‑5,5‑二甲基环己‑2‑烯基)‑丙二腈和4‑(苄氧基)‑2‑((叔丁氧基羰基)氨基)‑4‑氧代丁酸反应，合成荧光探针。将该荧光探针用于检测白三烯A4水解酶能够提高生物样本中白三烯A4水解酶的检测灵敏度和检测速度。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及环境分析、生物分析检测技术领域，尤其涉及一种荧光探针 及其制备方法和应用。
背景技术
白三烯A4水解酶(简称LTA4H)是具有环氧化水解酶和氨肽酶活性的含 锌的双功能金属蛋白酶。作为一种氨基肽酶，LTA4H能降解多肽的N-末端， 而作为一种环氧化物水解酶，它也能将不稳定的等位基因环氧化物白三烯 A4(LTA4)转化为白三烯B4(LTB4)介导单核细胞上调TNF-β、IL-1β和IL-6， 以及诱导p27的泛素化。
现有研究证明，LTA4H广泛参与诸多炎症的发生，例如LTA4H被发现 在急性肺损伤、特发性肺纤维化、肝炎、肺炎等疾病中高表达，因此，近年 来LTA4H也被视为炎症标志物。此外，LTA4H还被发现在甲状腺、皮肤癌、 食管癌和喉癌等多种癌症中高表达，其与多种肿瘤的发生密切相关，因此 LTA4H也是研发抗肿瘤药物的新靶点。
因此，提高体外和活体的生物样本中白三烯A4水解酶的检测灵敏度对 白三烯A4水解酶的基础发展和临床研究具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供一种荧光探针，用以解决 现有技术中白三烯A4水解酶的检测灵敏度不够高的缺陷，提高对体外和活 体的生物样本中白三烯A4水解酶检测的灵敏度。
为解决上述问题，本发明提供一种荧光探针，所述荧光探针的结构式如 式(Ⅶ)所示：
Figure BDA0003180464840000021
本发明还提供了一种荧光探针的制备方法，用于制备如上所述的荧光探 针，包括如下步骤：
步骤S1、合成2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S2、所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛 反应，合成2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S3、所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈和 4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸反应，合成所述荧光探针。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述步骤S1中合成所述 2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈采用如下方法：以异佛尔酮和丙二腈为 反应原料，乙醇为溶剂，在哌啶催化下进行反应，得到所述2-(3,5,5-三甲基 环己-2-烯基)-丙二腈。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述异佛尔酮和丙二腈的 摩尔比在1:1至1:3范围内，所述反应的温度在80至100℃范围内，所述反 应的时间在6至12h范围内。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述步骤S2中合成所述 2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈采用如下方法：在惰性 气体保护下，以乙酸和哌啶为催化剂，所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙 二腈和所述对乙酰氨基苯甲醛在甲苯中进行反应，得到所述2-(3-(4-氨基苯 乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈，且所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5- 二甲基环己-2-烯基)-丙二腈的构型为E构型。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述2-(3,5,5-三甲基环己 -2-烯基)-丙二腈和所述对乙酰氨基苯甲醛的摩尔比在1:1至1:3范围内，所 述反应温度在100至130℃范围内，所述反应的时间在6至12h范围内。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述步骤S3中合成所述 荧光探针采用如下方法：将所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代 丁酸、N,N-二异丙基乙胺和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷 酸酯在二氯甲烷中反应第一预设时长后，加入所述2-(3-(4-氨基苯乙烯 基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈，并反应第二预设时长，得到粗产物，将 所述粗产物经过分离和纯化后，得到所述荧光探针。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述4-(苄氧基)-2-((叔丁 氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸、所述N,N-二异丙基乙胺和所述2-(7-氮杂苯并 三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比在1:1:1至1:2:2范围内，且 所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸的构型为S构型，所述 反应的温度为常温，所述第一预设时长在6至12h范围内。
根据本发明提供的一种荧光探针的制备方法，所述2-(3-(4-氨基苯乙烯 基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈的加入量为所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基 羰基)氨基)-4-氧代丁酸摩尔量的0.5倍，所述反应的温度为常温，所述第二 预设时长在12至24h范围内。
本发明还提供了一种荧光探针的应用，所述荧光探针用于生物样本中的 白三烯A4水解酶的活性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的荧光探针，具有近红外荧光发射，组织穿透力强，染料 稳定性好，且该荧光探针为靶向白三烯A4水解酶的荧光探针，对白三烯A4 水解酶的选择性高，灵敏度高，检测速度快，将该荧光探针用于检测白三烯 A4水解酶能够提高对体外和活体的生物样本中白三烯A4水解酶的检测灵 敏度和检测速度，对白三烯A4水解酶的基础发展和临床研究具有重要的意 义。
(2)本发明所述的荧光探针的制备方法，合成工艺简单，分离纯化过程简 便，反应条件温和，易于实现规模化生产。
(3)本发明所述的荧光探针，基于白三烯A4水解酶在部分肿瘤细胞中过 量表达的特点，在高度表达白三烯A4水解酶的肿瘤细胞中，经白三烯A4 水解酶的催化水解，能够使肿瘤细胞内具有较高荧光强度，而表达量较低的 非肿瘤细胞中荧光信号较弱，从而能够实现对肿瘤细胞的特异性的标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或 现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出 创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2荧光探针化合物Ⅶ及荧光团化合物Ⅴ的荧光发射 光谱图；
图2是本发明实施例3荧光探针化合物Ⅶ与LTA4H反应体系在不同反 应时间的表征结果图；
图3是本发明实施例4荧光探针化合物Ⅶ对不同浓度的LTA4H响应表 征图，其中，图3(a)为荧光探针化合物Ⅶ与LTA4H反应体系随LTA4H浓度 变化的荧光强度变化图，图3(b)为荧光强度与LTA4H浓度在0至6μg/mL范 围内的线性关系图；
图4是本发明实施例5荧光探针化合物Ⅶ对不同抑制剂的表征结果图；
图5是本发明实施例6荧光探针化合物Ⅶ在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的荧 光成像图，其中，图5(a)为荧光成像图，图5(b)为细胞荧光强度的量化图；
图6是本发明实施例7荧光探针化合物Ⅶ在阳性细胞中加入抑制剂的荧 光成像图，其中，图6(a)为荧光成像图，图6(b)为细胞荧光强度的量化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的 附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，应当说明的是，在本发明的实施例中所提到的术语 “第一”、“第二”仅用于描述目的，并不能理解为指示或暗示相对重要性或者 隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可 以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
在本申请实施例的描述中，术语“一些具体实施方式”的描述意指结合该 实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个 实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相 同的实施或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
荧光探针具有无损、易操作、可实现可视化检测等特点而受到普遍重视； 相比于紫外可见方法，荧光探针具有更高的灵敏度以及高时空分辨率，被广 泛应用于分子靶标的检测及示踪。
本发明的实施例提供了一种荧光探针，该荧光探针为靶向白三烯A4水 解酶的荧光探针，该荧光探针的结构式如式(Ⅶ)所示：
Figure BDA0003180464840000061
具体地，该荧光探针的分子式为C30H30N4O3，分子量为494.2318。
本实施例提供的结构式为式(Ⅶ)的荧光探针，其具有近红外荧光发射， 组织穿透力强，染料稳定性好，且该荧光探针为靶向白三烯A4水解酶的荧 光探针，对白三烯A4水解酶的选择性高，灵敏度高，检测速度快，将该荧 光探针用于检测白三烯A4水解酶能够提高对体外和活体的生物样本中白三 烯A4水解酶的检测灵敏度和检测速度，对白三烯A4水解酶的基础发展和 临床研究具有重要的意义。
本发明的实施例还提供了该荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、合成2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S2、2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛反应， 合成2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S3、2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈和4-(苄 氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸反应，合成荧光探针。
本实施例提供的合成荧光探针的方法，合成工艺简单，分离纯化过程简 便，反应条件温和，易于实现规模化生产。
具体地，步骤S1中合成2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈(以下简称 化合物Ⅲ)采用如下方法：以异佛尔酮(以下简称化合物Ⅱ)和丙二腈(以下简 称化合物Ⅰ)为反应原料，乙醇为溶剂，在哌啶催化下进行反应，得到2-(3,5,5- 三甲基环己-2-烯基)-丙二腈，合成路径如下：
Figure BDA0003180464840000071
其中，异佛尔酮和丙二腈的摩尔比在1:1至1:3范围内，反应的温度在 80至100℃范围内，反应的时间在6至12h范围内。
反应结束后，将反应产物经过减压蒸馏，脱除反应溶剂后，得到粗产物， 将粗产物用硅胶柱层析分离纯化，得到2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈。
具体地，步骤S2中合成2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)- 丙二腈(以下简称化合物V)采用如下方法：在惰性气体保护下，以乙酸和哌 啶为催化剂，将2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛(以 下简称化合物Ⅳ)在甲苯中进行反应，得到构型为E构型的2-(3-(4-氨基苯乙 烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈，合成路径如下：
Figure BDA0003180464840000081
其中，2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛的摩比 在1:1至1:3范围内，反应温度在100℃至130℃范围内，反应的时间在6h 至12h范围内。
反应结束后，将反应产物经过减压蒸馏脱除反应溶剂，再经过萃取和硅 胶柱层析分离纯化后，得到构型为E构型的2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲 基环己-2-烯基)-丙二腈。
具体地，步骤S3中合成该荧光探针(以下简称化合物Ⅶ)采用如下方法：
将4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸(以下简称化合物Ⅵ)、 N,N-二异丙基乙胺和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 在二氯甲烷中反应第一预设时长后，加入2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基 环己-2-烯基)-丙二腈，并反应第二预设时长，得到粗产物，将粗产物经过分 离和纯化后，得到荧光探针，合成路径如下：
Figure RE-GDA0003464561070000082
其中，4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸、N,N-二异丙基乙 胺和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比在1:1:1 至1:2:2范围内，且4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸的构型为 S构型，优选地，4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸、N,N-二异 丙基乙胺和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比 为1:1.5:1.5。
整个步骤S3均在常温下进行，且第一预设时长在6h至12h范围内，第 二预设时长在12h至24h范围内。
2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈的加入量为4-(苄 氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸摩尔量的0.5倍。
反应结束后，经过减压蒸馏得到粗产物，向粗产物中加入二氯甲烷和三 氟乙酸，且二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1:1，并继续在常温下反应2-6h 后，加入碱溶液将反应产物的pH调节至中性，再经过萃取和硅胶柱层析分 离纯化后，得到荧光探针。
本发明的实施例还提供了该荧光探针的应用，该荧光探针用于生物样本 中的白三烯A4水解酶的活性检测，且该荧光探针能够用于对肿瘤细胞的特 异性标记。
本实施例中提供的荧光探针为以异佛尔酮为母体的近红外荧光探针，其 对白三烯A4水解酶具有较高的选择性，能提高体外和活体的生物样本中的 白三烯A4水解酶的检测灵敏度，且基于白三烯A4水解酶在部分肿瘤细胞 中过量表达的特点，在高度表达白三烯A4水解酶的肿瘤细胞中，在白三烯 A4水解酶的催化水解下，能够使肿瘤细胞内具有较高荧光强度，而表达量 较低的非肿瘤细胞中荧光信号较弱，从而能够实现对肿瘤细胞的特异性的标 记。
在上述实施例的基础上，本实施例还提供如下多个具体实施方式，对本 实施例进行更进一步地说明。
实施例1
一种荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、合成化合物Ⅲ：
Figure BDA0003180464840000101
将化合物Ⅰ丙二腈(2.64g,40mmol)和化合物Ⅱ异佛尔酮(2.76g, 20mmol)加入到含20ml乙醇的反应瓶中，再加入哌啶(0.085g,1mmol)作为催 化剂，并在氮气保护下，在100℃下加热回流反应16h，反应结束后，将反 应产物经过减压蒸馏，脱除反应溶剂，得到粗产物，将粗产物经柱层析分离 纯化后，得到化合物Ⅲ，收率为65％，其中，柱层析分离纯化中洗脱剂为石 油醚和乙酸乙酯，且石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:1。
步骤S2、合成化合物V：
Figure BDA0003180464840000102
将化合物Ⅲ(0.93g,5mmol)和化合物Ⅳ对乙酰氨基苯甲醛(0.99g,6mmol) 加入到含20ml甲苯的反应瓶中，然后依次加入0.5ml哌啶和0.5ml乙酸，在 氮气保护下，于120℃回流反应12h，反应结束冷却至常温后，抽滤脱除反 应产物中的溶剂，将得到的固体溶于60ml乙醇和盐酸的混合溶液中(乙醇和 盐酸的体积比为1比1)，加热回流反应6h，反应结束并冷却至室温后，用 氢氧化钠将反应产物中和至弱碱性(pH为7至8的范围内)，再将反应产物经过乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，并用无水硫酸钠干燥去除水分后，将有 机向经柱层析分离纯化后，得到化合物V，收率为75％，其中，柱层析分离 纯化中洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，且二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为 100:1。
步骤S3、合成化合物Ⅶ：
Figure BDA0003180464840000111
将构型为S构型的化合物Ⅵ(S)-4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧 代丁酸(0.32g,1mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.26g,2mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮 唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.57g,1.5mmol)依次加入含有10ml二氯 甲烷的反应容器中，常温反应6小时后，加入化合物V(0.145g,0.5mmol)，常 温继续反应12小时后，经过减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物，向粗产物中 依次加入5ml二氯甲烷和5ml三氟乙酸，常温继续反应2小时后，加入氢氧 化钠溶液将反应产物的pH调至中性，并用二氯甲烷萃取三次，合并有机相， 将有机向经柱层析分离纯化后，得到荧光探针化合物Ⅶ，收率为38％，其中， 柱层析分离纯化中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，且石油醚和乙酸乙酯的体积 比为1:1。
通过核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱表征对本发明实施例1中合成的荧光 探针的结构进行分析，证明采用实施例1中的方法制备得到的物质确实为式 (Ⅶ)所示的结构，具体结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ7.68(dd,J＝16.6,8.6Hz,4H),7.34(dt,J＝ 17.2,8.1Hz,7H),6.85(s,1H),5.10(s,2H),3.81–3.72(m,1H),2.81(dd,J＝ 15.9,5.7Hz,1H),2.65–2.56(m,3H),2.53(d,J＝15.7Hz,2H),1.01(s,6H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.97,169.51,160.71,147.24,138.81, 137.77,134.85,133.92,131.95,129.30,129.12,128.30,128.23,123.76,121.08, 113.13,71.34,66.62,48.96,40.53,37.23,36.25,32.43,28.47。
HRMS(ESI):calcd.for[C30H30N4O3-H]+495.2318；found 495.2320。
实施例2
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ及荧光团化合物V的光学性质进 行分析，具体采用如下方法：
将实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ以及荧光团化合物Ⅴ加入到 100mmol/L的pH为7.4的Tris-HCl溶液中，探针化合物Ⅶ及荧光团化合物 Ⅴ的终浓度为10μmol/L。并用SpectraMax iD5酶标仪测定混合液在500nm 处的荧光发射强度，得到如图1所示的结果。图1为荧光探针化合物Ⅶ以及 荧光团化合物Ⅴ在Tris-HCl溶液中的荧光发射光谱图，由图1可以看到，相 对荧光团化合物Ⅴ，化合物Ⅶ荧光强度显著降低。
实施例3
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ的性能进行测定，测定荧光探针 化合物Ⅶ与LTA4H的时间依赖性，具体采用如下方法：
用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液对LTA4H储液进行稀释，使其浓度为2μg/ml， 于LTA4H储液中加入相同体积的20μmol/L的荧光探针化合物Ⅶ溶液，并在 37℃下进行混合，得到混合溶液，并使混合溶液中的LTA4H的终浓度为 1μg/mL，荧光探针化合物Ⅶ的终浓度为10μmol/L；用SpectraMax iD5酶标 仪每隔15min对混合溶液在500nm处的荧光强度进行一次测试，得到如图2 所示的结果图。
图2为荧光探针化合物Ⅶ与LTA4H反应体系在不同反应时间的表征结 果图，从图2中可以看出，将20μmol/L荧光探针化合物Ⅶ与LTA4H溶液在37℃下共孵育时，随着时间的增加，反应体系中650nm处的荧光强度逐渐 增强，也说明了，在整个过程中，反应体系的荧光强度呈现时间依赖性，荧 光强度不断增强说明了荧光探针化合物Ⅶ能较好的检测LTA4H。
实施例4
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ的性能进行测定，测定荧光探针 化合物Ⅶ与LTA4H的浓度依赖性，具体采用如下方法：
用缓冲溶液对LTA4H储液进行稀释，得到不同浓度的LTA4H溶液 (0μg/mL至10μg/mL)，接着配制20μmol/L荧光探针化合物Ⅶ溶液，向荧光 探针化合物Ⅶ溶液中等体积加入2μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、18μg/ml、 20μg/ml的LTA4H溶液，得到不同的反应体系，每个反应体系反应时间控制 在90min(37℃)，用SpectraMax iD5酶标仪测定各反应体系在500nm处的荧 光发射强度，得到如图3(a)和图3(b)所示的结果。
图3(a)为荧光探针化合物Ⅶ与LTA4H反应体系随LTA4H浓度变化的荧 光强度变化图，图3(b)为荧光强度与LTA4H浓度在0至6μg/mL范围内的线 性关系图。
从图3(a)中我们可以看到，反应体系的荧光强度随着LTA4H浓度的增加 而增强，从图3(b)我们可以看出，在一定线性范围内(LTA4H浓度在1至6 μg/mL)，反应体系的荧光强度与LTA4H的含量成正比，表明化合物Ⅶ可用 于反应体系中LTA4H的定量检测，据此得到的线性方程为 F＝111603×C(μg/mL)-88963(R2＝0.98)，且经过计算得到，荧光探针化合物Ⅶ 对LTA4H的检测限(LOD＝3σ/k)为0.024μg/mL。
实施例5
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ的选择性进行测定，具体采用如 下方法：
将浓度为20μmol/L的荧光探针化合物Ⅶ和浓度为2μg/mL的LTA4H以 及浓度为2μg/ml的各类蛋白酶抑制剂共同孵育90min(37℃)。蛋白酶抑制剂 类型分别为：第二组-磷酸酶抑制剂以及第五组-LTA4H抑制剂(即乌苯美司)、 第三组-COMPLETE的蛋白酶抑制剂(可抑半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶及 金属蛋白酶)、第四组-苯甲基磺酰氯(即PMSF,可抑制丝氨酸蛋白酶，胰蛋白 酶和糜蛋白酶)，并设置第一组空白对照-仅浓度为20μmol/L的荧光探针化合 物Ⅶ和浓度和2μg/mL的LTA4H共同孵育90min(37℃)，用SpectraMax iD5 酶标仪测定各组在500nm处荧光强度值，得到如图4所示的结果。图4为 化合物Ⅶ-LTA4H体系与不同抑制剂反应后的相对荧光强度图。
从图4中我们可以看出，在几种抑制剂中，加入乌苯美司后荧光探针化 合物Ⅶ与LTA4H反应之后的荧光信号明显降低，而加入其它抑制剂后荧光 强度变化不明显。这说明相较于其它抑制剂而言，探针化合物Ⅶ对LTA4H 的响应最好，同时也说明了探针化合物Ⅶ对LTA4H的选择性很好，因此荧 光探针化合物Ⅶ可以实现LTA4H活性的选择性检测。
实施例6
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中的荧 光成像进行测定，具体采用如下方法：
肺腺癌细胞(A549 cells)、肺正常细胞(Beas-2B cells)、人肝癌细胞(Huh-7cells)、人正常肝细胞(L02-cells)和结直肠癌细胞(HCT-116cells)等细胞生长 于含10％FBS胎牛血清的DMEM培养基中，当细胞密度达到70-80％时， 消化处理，并以1×105/皿的密度接种到共聚焦小皿中，置于含5％CO2的培 养箱中，37℃过夜培养，16至20h后，用无血清的DMEM润洗细胞2至3 遍后加入10μmol/L用无血清DMEM配制的荧光探针化合物Ⅶ溶液。将小 皿放回培养箱继续培养50min，随后取出小皿，加入终浓度1μmol/L的核 染料Hoechst33342，5min后，用PBS润洗细胞2至3次，之后向小皿中加 入1mL PBS后，盖好皿盖，于荧光显微镜下成像，得到图5(a)和图5(b)所 示的结果，图5(a)和图5(b)的收集波段为645至700nm。
从图5(a)中我们可以看出：相比于其他细胞，化合物Ⅶ在肝癌、肺癌和 结直肠细胞(A549、Huh7和HCT-116)中荧光强度很高；将Beas-2B细胞中 的荧光强度归一化为1，其他细胞的荧光强度如图5(b)所示，从图5(b)中可 以直观的看到，肝癌、肺癌和结直肠细胞中LTA4H的含量较高，证明化合 物Ⅶ在细胞内可以很好的检测出LTA4H。
实施例7
对实施例1中合成的荧光探针化合物Ⅶ在阳性细胞内的抑制剂进行测试， 具体采用如下方法：
A549、Huh-7、HCT-116等细胞生长于含10％FBS胎牛血清的DMEM 培养基中，当细胞密度达到70-80％时，消化处理，并以1×105/皿的密度接 种到共聚焦小皿中，置于含5％CO2的培养箱中，37℃过夜培养，16至20h 后，加入5μmol/L的抑制剂溶液乌苯美司。孵育4h后，去除含抑制剂的培 养液，用PBS润洗细胞用无血清的DMEM润洗细胞2至3遍后加入10μmol/L用无血清DMEM配制的荧光探针化合物Ⅶ溶液。将小皿放回培养箱继续培 养90min，随后取出小皿，加入终浓度1μmol/L的核染料Hoechst 33342，5 min后，用PBS润洗细胞2至3次，之后向小皿中加入1mL PBS后，盖好 皿盖，于荧光显微镜下成像，得到图6(a)和图6(b)所示的结果，图6(a)和图 6(b)的收集波段为645至700nm。
从图6(a)中可以看出，加入抑制剂后化合物Ⅶ在各细胞中的荧光成像情 况，将加入抑制剂的A549细胞中的荧光强度归一化为1，其它反应体系细 胞的荧光强度如图6(b)所示，从图中可以直观的看到加入抑制剂对体系的荧 光强度有明显影响，说明体系中荧光的增强的确来自于化合物Ⅶ与LTA4H 的相互作用，这也在细胞层面上进一步佐证了化合物Ⅶ对LTA4H的高选择 性。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步 的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法 仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(Ⅶ)所示：
Figure FDA0003180464830000011
2.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1所述的荧光探针，包括如下步骤：
步骤S1、合成2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S2、所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛反应，合成2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈；
步骤S3、所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈和4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸反应，合成所述荧光探针。
3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中合成所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈采用如下方法：以异佛尔酮和丙二腈为反应原料，乙醇为溶剂，在哌啶催化下进行反应，得到所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈。
4.根据权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述异佛尔酮和丙二腈的摩尔比在1:1至1:3范围内，所述反应的温度在80至100℃范围内，所述反应的时间在6至12h范围内。
5.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中合成所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈采用如下方法：
在惰性气体保护下，以乙酸和哌啶为催化剂，所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和所述对乙酰氨基苯甲醛在甲苯中进行反应，得到所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈，且所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈的构型为E构型。
6.根据权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和所述对乙酰氨基苯甲醛的摩尔比在1:1至1:3范围内，所述反应的温度在100℃至130℃范围内，所述反应的时间在6至12h范围内。
7.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中合成所述荧光探针采用如下方法：
将所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸、N,N-二异丙基乙胺和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯在二氯甲烷中反应第一预设时长后，加入所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈，并反应第二预设时长，得到粗产物，将所述粗产物经过分离和纯化后，得到所述荧光探针。
8.根据权利要求7所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸、所述N,N-二异丙基乙胺和所述2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比在1:1:1至1:2:2范围内，且所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸的构型为S构型，所述反应的温度为常温，所述第一预设时长在6至12h范围内。
9.根据权利要求7所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)-丙二腈的加入量为所述4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸摩尔量的0.5倍，所述反应的温度为常温，所述第二预设时长在12至24h范围内。
10.一种荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针用于生物样本中的白三烯A4水解酶的活性检测。
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