CN110372681B - 一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的应用 - Google Patents

一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型酰肼希夫碱形成的自组装纳米粒子作为荧光探针使用，酰肼希夫碱在PBS缓冲液中自组装形成纳米体系，可用于人血清白蛋白（HSA）定性和定量检测。该探针优点是基于自组装和扭曲的分子内电荷转移机理，探针本身几乎没有荧光信号，与待测物作用后有明显的荧光增强现象，其合成路线简便，产率高，自组装形成纳米体系均匀快速，对待测物选择性好，灵敏度高。本发明的自组装纳米荧光探针可用于生物及临床检验样品中HSA的检测，具有良好的应用前景。

Description

一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的 应用
技术领域
本发明属于荧光探针检测及应用技术领域，更加具体地说，涉及一种酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在检测HSA中的应用。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人体中含量最丰富的转运蛋白，在调节胶体渗透压、传递激素、转运营养物质、代谢产物和药物等多种生物学功能中发挥着重要作用。此外，它也是评估肾脏损害的常规临床生物标志物。健康人血清中HSA浓度约为35-50 g/L，尿液中HSA浓度小于30 mg/L。当肾脏受损时，患者尿液中的HSA水平升高。因此，HSA在临床上是一种合适的诊断慢性肾病的生物标志物，精确检测血清和尿液中HSA的水平，可以有效地早期诊断或预防慢性肾病，以及监测慢性肾病患者的生理状况。因此，HSA含量的测定具有极为重要的研究和应用意义。
目前，检测HSA的方法主要有免疫分析法、液质联用蛋白组学法、电化学和BCG比色法等。然而，这些方法需要昂贵的设备和技术支撑，以及耗费的时间长，流程复杂，不利于HSA的实时快速检测。而荧光探针技术具有成本低，高灵敏度，响应时间迅速和操作流程简单等特点，克服了传统检测手段的缺点，用于HSA检测的有机分子荧光探针技术获得了很大的进展。但是，目前报道的一些HSA荧光探针分子仍有一些局限性，比如检测限高、激发波长在短波长范围、水溶性差等。因此在实际应用中未能满足样品的检测范围，或者不能有效避免样品自发荧光的干扰以及不能用于生物体内目标物的检测。面对这些局限性，设计新型的HSA荧光探针分子是非常有必要的。目前，有机分子自组装纳米粒子由于其光学稳定性、良好的生物相容性、多样性和结构设计的灵活性，在HSA的传感领域引起了广泛的关注。然而，选择性和裸眼快速检测HSA的有机分子自组装纳米探针仍然很少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，可以作为高灵敏度、高选择性的HSA荧光分析手段，和现有文献中的探针（化合物）相比较，本发明的自组装纳米荧光探针水溶性好，检测限低，响应速度快，生物相容性好，稳定性强，制备简单、合成成本低等优势。
本发明作为HSA检测的应用通过下述技术方案予以实现：
用于HSA检测的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，具有如下所示的结构式：
Figure 22312DEST_PATH_IMAGE001
所述酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针用于对HSA的定性和定量检测方面的应用。
所述酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针的合成具体如下：
（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流4-6 h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流20-22 h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；
所述（1）中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:（1.5-5）。
（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流18-20 h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流18-22 h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5左右，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在20-50℃以及氩气保护下搅拌30 min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在60-70℃下搅拌16-20 h后,转移到冰水中用NaOH调节pH为5左右，过滤后得黄色固体产物7-二乙氨基香豆素醛；
所述（2）中4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶投料的物质的量之比为1:1.5:(1-2）。
（3）将（1）和（2）所得终产物溶解于无水甲醇中,加热回流5-8 h至反应完全，待反应液冷却至室温，过滤，用无水甲醇洗涤固体，真空干燥，即得到该酰肼希夫碱荧光探针分子。
所述（3）中吡嗪-2-酰肼和7-二乙氨基香豆素醛的投料物质的量比为1:1。
所述的合成路线如下：
Figure 805329DEST_PATH_IMAGE002
所述酰肼希夫碱在PBS缓冲液中形成自组装纳米荧光探针。
所述PBS缓冲液的pH = 7-8。
所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，通过裸眼观察可对HSA实现快速检测，在365 nm紫外灯下，溶液由无色变为绿色。
所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，在激发波长为450 nm激发下，探针本身几乎没有荧光信号，与HSA作用后，在512 nm处产生很强的荧光信号，且对HSA的定量检测浓度范围为0-5 mM，检测限为8.76 nM。
所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，激发波长为450 nm，发射波长约为512 nm，有效的克服了水溶性差和样品自发荧光的干扰等缺点，对HSA有很好的选择性，可以用于生物体系中HSA的检测。
附图说明
图1为本发明的纳米荧光探针的核磁共振氢谱；
图2为本发明的纳米荧光探针的核磁共振碳谱；
图3为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针的电镜图；
图4为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针对HSA的选择性荧光光谱图；
图5为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在其他干扰物存在时对HSA识别的荧光信号图；
图6为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针的荧光强度与不同浓度的HSA响应的荧光光谱图；
图7为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在512 nm处的荧光强度的变化值与HSA浓度的线性关系图；
图8为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针与HSA在不同时间段的荧光强度变化图；
图9为本发明的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针与HSA在细胞中的荧光成像图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。例如吡嗪-2-羧酸、水合肼、4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯、哌啶等均有市售。
实施例1：荧光探针的合成及其表征
（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流5 h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流21 h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；其中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:2。
（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流20 h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流20 h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5左右，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在30℃以及氩气保护下搅拌30 min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在65℃下搅拌18 h后,转移到冰水中用NaOH调节pH为5左右，过滤后得黄色固体产物7-二乙氨基香豆素醛；其中4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶投料的物质的量之比为1:1.5:2。
（3）将（1）和（2）所得终产物溶解于无水甲醇中,加热回流6 h至反应完全，待反应液冷却至室温，过滤，用无水甲醇洗涤固体，真空干燥，即得到该酰肼希夫碱荧光探针分子。产率85%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm):12.45 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 8.93(s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.68 (d, J = 9.0 Hz, 1H),6.78 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.59 (s, 1H), 3.48 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.14 (t, J= 7.0 Hz, 6H).13C-NMR (101MHz, DMSO-d6): δ (ppm):160.68, 159.34, 156.65,151.41, 147.71, 144.73, 144.44, 144.09, 143.31, 139.10, 131.00, 112.40,109.71, 108.01, 96.34, 44.23, 12.34.
实施例2：自组装纳米荧光探针的形成研究
在2 mL的PBS缓冲溶液中（pH 7.4），加入10μL的探针储备液（10-3 M），在室温下搅拌均匀后，用DLS分析了纳米粒子的溶液。将纳米粒子溶液滴在铜网片上，真空干燥，通过透射电镜(TEM)分析纳米粒子溶液的形成。由图3可知，该探针分子在PBS缓冲溶液中通过自组装形成了方形纳米粒子。
实施例3：纳米荧光探针对HSA的选择性研究
在2 mL的PBS缓冲溶液中（pH 7.4），加入10μL的探针储备液（10-3 M），然后再加入等当量的生物分子储备液(Arg,Asp, Cys, Glu, Gly, GSH, His, Iso, Lys, Met, Pro,Ser, Thr, Tyr, Val)在室温下搅拌均匀后,在激发波长为450 nm激发下，测试其各自的荧光发射光谱。由图4可知，当纳米荧光探针与HSA作用后，荧光光谱发生了明显的变化，而其他生物分子的加入则几乎无变化，说明此纳米荧光探针对HSA具有很好的选择性。
实施例4：不同生物分子对纳米荧光探针检测HSA的影响研究
在2 mL的PBS缓冲溶液中（pH 7.4），加入10μL的探针储备液和其他生物分子储备液（10-3 M），然后再加入10μL的HSA溶液（10-3 M），混合均匀后分别测试其荧光信号变化。由图5可知，在其他干扰物质（生物分子）存在的情况下，纳米荧光探针与HSA作用后，仍有很强的荧光信号产生，这表明纳米荧光探针对HSA的识别不受其他干扰物的影响。
实施例5：纳米荧光探针对不同浓度的HSA响应的研究
在2 mL的PBS缓冲溶液中（pH 7.4），加入10μL的探针储备液（10-3 M），然后再加入不同浓度的HSA溶液（0-5 μM）后，测试其荧光光谱的变化。由图6可知，随着HSA浓度的增加，纳米荧光探针的荧光强度也逐渐增加，并在0-5 μM的浓度范围内呈线性相关（图7），表明该纳米荧光探针分子可以对HSA进行定量检测，其检测限为8.76 nM。
实施例6：纳米荧光探针对HSA响应的稳定性研究
在2 mL的PBS缓冲溶液中（pH 7.4），加入10μL的探针储备液（10-3 M），然后再加入相同浓度的HSA溶液后，测试其在不同时间段内荧光强度的变化。由图8可知，该纳米荧光探针与HSA的响应在70 min内几乎保持不变，表明该探针有较好的稳定性，可以有效地检测HSA。
实施例7：纳米荧光探针对活细胞内HSA成像的研究
将MCF-7细胞在2个细胞培养皿中进行培养。其中一组用10 μM的纳米荧光探针孵育30 min后,再加入等浓度的HSA继续孵育30 min。而另一组仅用纳米荧光探针孵育30min。然后用激发共聚焦显微镜对两组细胞进行成像分析。如图9所示，单独用纳米荧光探针孵育过的细胞内有微弱的绿色荧光产生，表明该纳米荧光探针有良好的生物相容性，可以穿过细胞膜进入细胞。而继续用HSA孵育过的细胞内产生明显的绿色荧光信号，说明该纳米荧光探针可以在活细胞内检测HSA。
实施例8：纳米荧光探针对尿液样品中HSA检测的研究
分别使用健康人的尿液制备三个已知加入HSA浓度(0.5, 1.0, 2.5 µM)的尿液样本；以及通过临床实验方法测得三个肾病病人尿液样本的HSA含量。用荧光法测定样品，用标定方程计算HSA含量。如下表所示：
表一、健康人尿液样本HSA含量检测结果
Figure 735239DEST_PATH_IMAGE003
表二、肾病病人尿液样本HSA含量检测结果与临床实验方法检测结果对照表
Figure 961821DEST_PATH_IMAGE004
三个健康尿液样本的回收率均获得较好的结果，三个病人尿液样本通过临床方法与本荧光法相比，本荧光法与临床方法效果相近，说明该纳米荧光探针可很好的检测尿液中HSA的含量，具有应用于临床疾病诊断及监测的潜力。

Claims (7)

1.酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构式：
Figure 902538DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针在制备HSA定性和定量检测试剂中的应用。
3.权利要求2所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针在制备HSA定性和定量检测试剂中的应用，其合成方法按如下反应制备：
（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流4-6 h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流20-22 h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；其中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:1.5-5；
（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流18-20 h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流18-22 h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在20-50℃以及氩气保护下搅拌30 min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在60-70℃下搅拌16-20 h后,转移到冰水中用NaOH调节pH为5-5.5，过滤后得黄色固体产物7-二乙氨基香豆素醛；其中4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶投料的物质的量之比为1:1.5:1-2；
（3）将（1）和（2）所得终产物溶解于无水甲醇中,加热回流5-8 h至反应完全，待反应液冷却至室温，过滤，用无水甲醇洗涤固体，真空干燥，即得到该酰肼希夫碱荧光探针分子；其中吡嗪-2-酰肼和7-二乙氨基香豆素醛的投料物质的量比为1:1。
4.权利要求3所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，化合物在PBS缓冲液中形成自组装纳米荧光探针；PBS缓冲液的pH = 7-8；所述化合物的结构为
Figure 22941DEST_PATH_IMAGE001
。
5.权利要求4所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，将HSA加入到权利要求4所述的PBS缓冲液中形成自组装纳米荧光探针，在365 nm 紫外灯下，溶液由无色变为绿色，可实现对HSA的快速检测。
6.权利要求5所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，在450 nm激发光下，本身几乎没有荧光信号，与HSA作用后，在512 nm处产生很强的绿色荧光信号，且对HSA的定量检测浓度范围为0-5μm，检测限为8.76 nM。
7.权利要求5所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针在制备用于检测活细胞和尿液样品中HSA 试剂方面的应用。
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