CN108069413B

CN108069413B - 一种制备红绿光双发射碳点的方法及应用

Info

Publication number: CN108069413B
Application number: CN201711144713.5A
Authority: CN
Inventors: 陈兴国; 刘娟娟; 董炎炎
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2037-11-17
Also published as: CN108069413A

Abstract

在本发明中，以2，5‑二氨基甲苯硫酸盐为碳源，一步法合成了水溶性的具有红/绿光双发射的碳点(RGDE CDs)。与已有的方法相比，该方法避免了多步骤的材料制备过程。该方法制备的RGDE CDs具有优异的抗光漂白能力、良好的生物兼容性和低细胞毒性。在单一激发波长下，RGDE CDs的绿色荧光(525nm)强度在加入OONO^‑后被淬灭，而红色荧光(603nm)强度基本不发生变化。在此基础上，本发明建立了一种比率法测定OONO^‑的荧光新方法。

Description

一种制备红绿光双发射碳点的方法及应用

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种一步法制备红/绿光双发射碳点(RGDE CDs)的方法及其应用。

背景技术

碳点(CDs)是一种近球形结构的离散的纳米粒子，尺寸通常小于10nm，具有光致发光特性。自2004年研究者们利用电弧放电法制备得到CDs以来，因其发光范围可调、光稳定性好、斯托克斯位移大、毒性低、生物相容性好等优点，已在分析检测、生物成像、光动力治疗以及光催化等领域得到了广泛的应用，成为一种备受关注的碳纳米材料。

目前已报道的大多数CDs的荧光发射波长较短，对组织的穿透性较差，生物组织背景干扰大，限制了其在生物成像等方面的应用。而红光的能量较低，生物组织背景干扰小，因此，合成具有红光发射的荧光CDs对于生物样品分析具有极其重要的意义。研究发现，N、S、O等元素的掺杂、表面金属离子的修饰、体系共轭程度的增加往往能够提高CDs的荧光量子产率，同时，也可能使得其发射波长红移。然而，这些方法合成的CDs大多需要借助硅胶柱层析法进行分离纯化后才可以使用。更重要的是，这些CDs在最佳的激发波长下都呈单发射状态。因此，以这些CDs开展的检测应用几乎都是基于单发射波长对应的荧光强度的变化对目标分子进行分析检测。然而，在这种检测模式下，荧光强度通常会受到一些不可避免因素的影响，如探针的不均匀分布、光漂白及光源强度的波动等，因此，在单一波长处测量荧光强度时，在实际应用中往往会产生荧光信号数据失真，使得检测结果误差较大，准确率有所下降。为了解决这种基于单一波长荧光强度变化的荧光测量方法所面临的荧光信号假象问题，比率荧光探针的设计和合成日益成为人们关注的焦点。通常情况下，传统的比率荧光探针的合成需要将两种具有不同荧光发射波长的材料通过化学或物理的方法结合在一起，过程比较繁琐。因此，通过简便的方法构建一种基于双发射CDs的比率荧光探针仍然具有极其重要的研究意义。

过氧亚硝酸根(OONO^-)作为一种内源性的高活性氧化物，由于其强的生物活性，能与DNA、蛋白质、脂质类等发生反应，导致细胞的严重损伤，从而引起一系列疾病，如发炎、缺血再灌注损伤、动脉硬化症等。因此，发展简便、快速、准确测定OONO^-的方法对于深入研究一些疾病的病理、采取有效措施预防和治疗这些相关的疾病具有重要的意义，是生命科学研究中的重要课题之一。

发明内容

在本发明中，以2，5-二氨基甲苯硫酸盐为碳源，一步法合成了水溶性的具有红/绿光双发射的碳点(RGDE CDs)。与已有的方法相比，该方法避免了多步骤的材料制备过程。该方法制备的RGDE CDs具有优异的抗光漂白能力、良好的生物兼容性和低细胞毒性。在单一激发波长下，RGDE CDs的绿色荧光(525nm)强度在加入OONO^-后被淬灭，而红色荧光(603nm)强度基本不发生变化。在此基础上，本发明建立了一种比率法测定OONO^-的荧光新方法。此外，RGDE CDs 可成功用于细胞成像实验中。为达到上述目标，具体步骤如下：

将2，5-二氨基甲苯硫酸盐、无水乙醇加入反应釜中，于150℃下反应12h，冷却至室温，加入水稀释，于12000r/min离心10min，上清液即为RGDE CDs；最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

进一步的，2，5-二氨基甲苯硫酸盐与无水乙醇的摩尔比为0.0132-0.0529。

进一步的，2，5-二氨基甲苯硫酸盐与无水乙醇的摩尔比为0.0265。

进一步的，制得的RGDE CDs作为比率荧光探针用于检测OONO^-。

进一步的，制得的RGDE CDs用于细胞成像实验中。

进一步的，检测OONO^-使用比率法，具体步骤为：

(a)将30.0μL RGDE CDs溶液、2.90mL 10mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液加入离心管中；在上述溶液中加入70μL不同浓度的OONO^-溶液，摇匀，放置2min；固定激发波长为370nm，在525nm和603nm处分别测定溶液的荧光强度。以F₅₂₅/F₆₀₃为纵坐标、c_(OONO-)为横坐标制作标准曲线；其中F₅₂₅：RGDE CDs溶液在525nm波长处的荧光强度，F₆₀₃：RGDE CDs溶液在603nm波长处的荧光强度；按同样步骤测定样品溶液的F₅₂₅/F₆₀₃，根据工作曲线确定OONO^-的浓度。

(b)RGDE CDs对OONO^-的选择性按照如下过程测定：将30.0μL RGDE CDs溶液、2.90mL 10mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液加入离心管中；在上述溶液中加入70μL不同浓度的潜在干扰物溶液，摇匀，放置2min；按照(a)中设定的参数测定荧光强度。所有实验均在室温条件下进行。

进一步的，制得的RGDE CDs在细胞成像实验中步骤为：

(a)将含10％胎牛血清的培养液配成细胞悬液；将细胞接种到12孔板中，每个孔中加入的体积为1mL；培养箱中培养24h；

(b)吸弃孔内上清培养液；每孔加入新的含10％胎牛血清的培养液；设置空白对照孔不加 RGDE CDs溶液；实验孔每孔加入30μg/mL RGDE CDs溶液；培养箱中培养30min；

(c)吸弃孔内上清培养液；每孔加入1mL无菌PBS溶液；

(d)荧光显微镜下观察并记录成像结果。

本发明的益处在于，本制备方法操作简便，所制备的RGDE CDs具有优异的抗光漂白能力、良好的生物兼容性和低细胞毒性；所建立的比率测定OONO^-的方法选择性好、灵敏度高；所制备的RGDE CDs可成功用于细胞成像实验中。

附图说明

图1(A)RGDE CDs的透射电镜图；(B)RGDE CDs的尺寸分布图；

图2(A)C 1s；(B)N 1s；(C)O 1s；(D)S 2p的高分辨x射线光电子能谱图；

图3(A)RGDE CDs的红外光谱图；(B)RGDE CDs的紫外吸收光谱图；

图4RGDE CDs在不同激发波长下的的荧光发射光谱图；其中图A为330nm-460nm；图B 为460nm-530nm；

图5(A)光照时间；(B)温度；(C)盐浓度；(D)pH与RGDE CDs的荧光强度的关系图；

图6RGDE CDs对OONO^-响应的荧光光谱图；

图7潜在干扰物质对检测OONO^-的影响；

图8RGDE CDs对细胞成活率的影响；

图9(A)空白对照组；(B)加入30μg/mL RGDE CDs后培养30min；(C)加入30μg/mLRGDE CDs培养30min后，再加入15μM OONO^-后培养30min的HeLa细胞的荧光显微镜照片。

图10RGDE CDs的制备及其检测OONO^-的示意图。

具体实施方式

本发明的目的在于：

利用简便的新方法一步合成了荧光RGDE CDs，RGDE CDs可作为比率荧光探针用于检测 OONO^-。此外，利用该RGDE CDs具有良好的生物兼容性和低细胞毒性等优异性能，将其成功用于细胞成像实验中。

实施例1

(1)RGDE CDs的合成

将0.1g 2，5-二氨基甲苯硫酸盐、1mL无水乙醇加入20mL反应釜中，于150℃下反应12h，冷却至室温，加入20mL水稀释，于12000r/min离心10min，上清液即为RGDE CDs。最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

(2)用TEM、XPS、FT-IR等方法对RGDE CDs的结构和形貌进行表征。

(3)对RGDE CDs的抗光漂白性、热稳定性、耐盐性以及不同pH值时的荧光强度进行考察。确定测定条件，建立比率检测OONO^-的荧光新方法。

(4)比率法检测OONO^-

(a)将30.0μL RGDE CDs溶液、2.90mL 10mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液加入离心管中；在上述溶液中加入70μL不同浓度的OONO^-溶液，摇匀，放置2min；固定激发波长为370nm，在525nm和603nm处分别测定溶液的荧光强度。以F₅₂₅/F₆₀₃为纵坐标、c_(OONO-)为横坐标制作标准曲线(其中F₅₂₅：RGDE CDs溶液在525nm波长处的荧光强度，F₆₀₃：RGDE CDs溶液在603nm波长处的荧光强度)。按同样步骤测定样品溶液的F₅₂₅/F₆₀₃，根据工作曲线确定OONO^-的浓度。

(5)细胞毒性实验

(a)边缘孔每孔加入100μL无菌PBS溶液；将含10％胎牛血清的培养液配成细胞悬液；以每孔1-5×10⁵个细胞接种到96孔板中，每孔加入的体积为100μL；培养箱中培养24h(5％ CO₂，37℃)。

(b)吸弃孔内上清培养液；每孔加入新的含10％胎牛血清的培养液；每孔加入不同浓度的 RGDE CDs(0,50,100,200,400μg/mL)；培养箱中培养24h(5％CO₂，37℃)。

(c)吸弃孔内上清培养液；每孔加入新的含10％胎牛血清的培养液；每孔加入10μLMTT (5mg/mL)；培养箱中培养4h(5％CO₂，37℃)。

(d)吸弃孔内上清培养液；每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)；培养箱中培养5min(5％CO₂，37℃)。

(e)酶标仪测定各孔的吸光度值。

(f)计算细胞成活率。

(6)细胞成像实验

(a)将含10％胎牛血清的培养液配成细胞悬液；将细胞接种到12孔板中，每个孔中加入的体积为1mL；培养箱中培养24h(5％CO₂，37℃)。

(b)吸弃孔内上清培养液；每孔加入新的含10％胎牛血清的培养液；设置空白对照孔不加RGDE CDs溶液；实验孔每孔加入30μg/mL RGDE CDs溶液；培养箱中培养30min(5％CO₂， 37℃)。

(c)吸弃孔内上清培养液；每孔加入1mL无菌PBS溶液。

(d)荧光显微镜下观察并记录成像结果。

表1人血清样品中OONO^-的测定结果

实施例2

RGDE CDs的合成

将0.1g 2，5-二氨基甲苯硫酸盐、0.5mL无水乙醇加入20mL反应釜中，于120-180℃下反应12h，冷却至室温，加入20mL水稀释，于12000r/min离心10min，上清液即为RGDE CDs。最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

实施例3

将0.1g 2，5-二氨基甲苯硫酸盐、2mL无水乙醇加入20mL反应釜中，于120-180℃下反应12h，冷却至室温，加入20mL水稀释，于12000r/min离心10min，上清液即为RGDE CDs。最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，制备方法为，将2，5-二氨基甲苯硫酸盐、无水乙醇加入反应釜中，于150 ℃下反应12 h，冷却至室温，加入水稀释，于12000r/min离心10 min，上清液即为红/绿光双发射碳点即RGDE CDs；最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，制备方法为，将0.1 g 2，5-二氨基甲苯硫酸盐、1 mL无水乙醇加入20 mL反应釜中，于150 ℃下反应12 h，冷却至室温，加入20 mL水稀释，于12000 r/min离心10 min，上清液即为RGDE CDs；最后，将该RGDE CDs溶液移出并于4℃冰箱中保存备用。

3. 根据权利要求1所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，制得的RGDE CDs作为比率荧光探针用于检测OONO^-。

4. 根据权利要求1所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，制得的RGDE CDs用于细胞成像实验中。

5.根据权利要求3所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，检测OONO^-使用比率法，具体步骤为：

将30.0 μL RGDE CDs溶液、2.90 mL 10 mM Tris-HCl ，pH = 7.4，缓冲溶液加入离心管中；在上述溶液中加入70 μL不同浓度的OONO^-溶液，摇匀，放置2 min；固定激发波长为370 nm，在525 nm和603 nm处分别测定溶液的荧光强度；以F ₅₂₅/F ₆₀₃为纵坐标、c _(OONO-)为横坐标制作标准曲线；其中F ₅₂₅：RGDE CDs溶液在525 nm波长处的荧光强度，F ₆₀₃：RGDE CDs溶液在603 nm波长处的荧光强度；按同样步骤测定样品溶液的F ₅₂₅/F ₆₀₃，根据工作曲线确定OONO^-的浓度。

6.根据权利要求1所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，2，5-二氨基甲苯硫酸盐与无水乙醇的摩尔比为0.0132-0.0529。

7.根据权利要求1所述的一种制备红/绿光双发射碳点的方法，其特征在于，2，5-二氨基甲苯硫酸盐与无水乙醇的摩尔比为0.0265。