CN110615786B

CN110615786B - 用于检测粘度的近红外荧光化合物及其制备与应用

Info

Publication number: CN110615786B
Application number: CN201910644471.9A
Authority: CN
Inventors: 朱勍; 付曼琳; 蔡春晖; 易文君
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110615786A

Abstract

本发明涉及一种可以用于检测粘度的高灵敏度近红外荧光化合物(I)，及其制备方法与应用。本发明化合物(I)可作为一种检测粘度的荧光探针，其荧光性能激发为ex＝510nm，em＝675nm，具有较大的斯托克位移，具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点，对粘度敏感性高，为研究细胞中粘度的生理作用提供了一种有效的研究工具。

Description

用于检测粘度的近红外荧光化合物及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种可以用于检测粘度的高灵敏度近红外荧光化合物，及其制备方法与应用。

(二)背景技术

随着现代人高血压、动脉硬化等疾病的发生率逐年增加，医学上对能够早期预警重大疾病的指示剂的需求渐趋迫切。粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。研究表明，细胞微环境粘度的改变可能引起生理上的功能紊乱或病变。因此，粘度可以作为衡量生命细胞状态的一种参考指标。

近年来，在细胞水平上检测微环境的粘度成为一个研究热点。现有荧光探针技术中，粘度探针存在数量较少，合成步骤繁琐，成本高及荧光背景高等问题。本专利研究设计并合成一种简单、快速、灵敏度高且近红外的粘度检测荧光探针，开发新型健康诊断指标，以检测细胞微环境的粘度来判断细胞的生理状态，推动现有临床诊断技术发展。本专利合成的高灵敏度的粘度荧光探针可作为新型临床诊断技术对重大疾病做出早期预警，降低现代人重大疾病的发生率，符合“健康中国”战略，提高国民健康水平。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可以用于检测粘度的高灵敏度近红外荧光化合物，及其制备方法与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种用于检测粘度的近红外荧光化合物，其结构如式(I)所示：

本发明还涉及所述荧光化合物的方法，所述方法包括：将化合物(II)、化合物(III)和甲醇钠加入到乙腈溶剂中，在30℃～40℃搅拌反应12h～14h，反应结束后反应液分离纯化得到化合物(I)；化合物(II)、化合物(III) 和甲醇钠物质的量之比为1:1～1.2:0.2～0.4；化合物(II)和化合物(III) 在甲醇钠的作用下，最终生成化合物(I)；

优选的，所述化合物(II)、化合物(III)和甲醇钠物质的量之比为 1:1.2:0.2。

所述分离纯化方法可如下：将反应液减压浓缩，通过使用乙酸乙酯/ 石油醚(v/v，1：5)的二氧化硅柱层析进行纯化，得到化合物(I)。

本发明化合物(II)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Xu Zhang，Yi Chen，Synthesis and fluorescence of dicyanoisophorone derivatives，Dyes andPigments，(2013)531-536)。

本发明化合物(III)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Ge Zhang，YumingSun，Xiuquan He，Red-Emitting Mitochondrial Probe with Ultrahigh Signal-to-Noise Ratio Enables High-Fidelity Fluorescent Images in Two-PhotonMicroscopy，Anal.Chem.，2015，87，12088-12095)。

本发明还涉及所述的荧光化合物在制备荧光探针中的应用。

具体的，所述荧光探针可用于粘度检测。

优选的，所述荧光探针用于测定细胞内粘度值，粘度值约为20～80cp。更为优选的，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。实验结果表明，化合物(I)可以检测Hela细胞内粘度的变化，平均荧光强度为14.069，在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，平均荧光强度为37.646。

所述荧光探针可用于检测微塑料引起的斑马鱼肠胃粘度变化。实验发现，化合物(I)可以检测由微塑料引起的斑马鱼肠道内粘度的变化，在没有微塑料加入时，斑马鱼基本无荧光，当斑马鱼用微塑料处理后，加入化合物(I)，斑马鱼显示出明显的荧光，而且荧光强度随着微塑料的用量增加而增加。

所述荧光探针还可用于检测糖尿病病人血液样本粘度。实验结果表明，检测I型糖尿病、II型糖尿病以及健康血液的血液粘度时，化合物(I) 的荧光强度具有显著性差异，说明不同程度的糖尿病病人在采用本实施例的方法检测时，具有一定的区分性，因此，可以将本方法作为糖尿病初步诊断的依据，实现快速、有效的诊断。

本发明所述由化合物(I)可作为一种检测粘度的荧光探针，其荧光性能激发为ex＝510nm，em＝675nm，具有较大的斯托克位移，具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点。其在Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1) 中量子产率为0.24，荧光增强约400倍，可应用于粘度的荧光定量检测。所述的定量粘度浓度的荧光检测原理为：化合物(I)，在具有一定粘度的溶液中，会限制结构碳碳单键的旋转，从而减少探针的非辐射能量，使荧光发生turn-on，测定在激发为510nm时，检测675nm处探针的荧光强度变化，从而获得粘度浓度。

与现有技术相比，如参考文献(Ge Zhang，Yuming Sun，Xiuquan He， Red-Emitting Mitochondrial Probe with Ultrahigh Signal-to-Noise Ratio EnablesHigh-Fidelity Fluorescent Images in Two-Photon Microscopy，Anal. Chem.，2015，87，12088-12095)所述化合物(1)：

化合物(1)作为荧光探针，其所报道的荧光性能激发为ex＝530nm， em＝620nm在细胞内可以实现粘度检测，但是粘度较不敏感，在Gly/PBS 缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中，在粘度增加时，荧光强度只增强约20倍，且荧光发射为620nm，没有满足近红外粘度探针的需求。而化合物(I) 随着缓冲液粘度的增加，荧光强度明显增高，在670nm处荧光强度提升接近20倍，同时具有良好的线性关系，因此，本发明提供化合物(I)可作为检测细胞内粘度荧光探针，为研究细胞中粘度的生理作用提供了一种有效的研究工具。

此外，本发明还合成了粘度探针(2)，所述化合物(2)为：

化合物(2)作为荧光探针，检测其荧光性能激发为ex＝610nm， em＝670nm，在Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1)中量子产率为0.14，在Gly/PBS 缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中，随着粘度的增加，荧光强度增强约20倍，粘度较不敏感。本发明化合物(I)与化合物(2)相比，斯托克位移较大、量子产率高，且对粘度的敏感性更高。

本发明的有益效果主要体现在：化合物(I)可作为一种检测粘度的荧光探针，其荧光性能激发为ex＝510nm，em＝675nm，具有较大的斯托克位移，具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点，对粘度敏感性高，为研究细胞中粘度的生理作用提供了一种有效的研究工具。

(四)附图说明

图1为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁氢谱。

图2为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁碳谱。

图3为本发明中实施例1制备的化合物(I)，加入到PBS缓冲液和 Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1)中的荧光吸收光谱图。

图4为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在Gly/PBS缓冲液(v/v ＝1:9至9:1)中的荧光发射光谱图(pH＝7.4)。激发波长510nm，发射波长675nm。

图5为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在Gly/PBS缓冲液(v/v ＝1:9至9:1)中的线性关系图(pH＝7.4)。激发波长510nm，发射波长 675nm。

图6为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/不同pH缓冲液(v/v＝1/99)条件下的荧光图。

图7为本发明中实施例1制备的化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液 (pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，选择性结果的荧光图。1-12分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、甘油。图7激发波长 510nm，发射波长675nm。

图8为本发明中实施例1制备的化合物(I)的细胞成像图。

图9为本发明中实施例1制备的化合物(I)在微塑料预处理的斑马鱼中的共聚焦显微镜荧光成像图。

图10为本发明中实施例1制备的化合物(I)在不同糖尿病人血液样本中的荧光强度柱状图。

图11为各样本在675nm处的荧光强度下平均值与标准差的柱状图； 1：I型糖尿病患者血液样本，2：II型糖尿病血液样本，3：健康血液对照组。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：化合物(DJH)的制备

将化合物(II)、化合物(III)和甲醇钠按物质的量1:1.2:0.2加入到足量乙腈溶剂中，在30℃～40℃搅拌搅拌12h；将反应物减压浓缩，通过使用乙酸乙酯/石油醚(v/v，1：5)的二氧化硅柱层析进行纯化，即得化合物(I)(收率60％)，其核磁氢谱参见图1，核磁碳谱参见图2。¹H NMR (500MHz，CDCl₃)

实施例2：化合物(I)在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH＝7.4 的条件下，探针的荧光强度随粘度的变化

准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同粘度值的 PBS缓冲液(最终粘度的值分别100cp，200cp，300cp，400cp，500cp， 600cp，700cp，800cp，950cp)，在37℃下加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光光谱，并做相关线性曲线。

荧光图谱见图3。数据表明，化合物(I)在610nm处激发，670nm 处发射。随着缓冲液粘度的增加，在670nm处荧光强度提升接近20倍，同时具有良好的线性关系(R²＝0.979)。

实施例3：化合物(I)(5μM)在PBS和体积分数为90％的甘油中的荧光吸收光谱图。激发波长为510nm，发射波长为675nm

准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL甘油/PBS缓冲液(甘油/PBS，v:v，1:9)中，再加入到96孔板中，然后测定化合物 (I)的荧光发射光谱。

荧光图谱见图4。实验结果表明，在以510nm波长激发时，在PBS 缓冲液中，化合物(I)在510nm处的吸收较弱；当缓冲液粘度较高时，化合物(I)在510nm处的吸收较强，说明探针对粘度灵敏。

实施例4：化合物(I)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH＝7.4 的条件下，探针的荧光强度随粘度的变化

荧光图谱见图5和图6。数据表明，化合物(I)随着缓冲液粘度的增加，荧光强度明显增高。在粘度值为950cp时，荧光强度提升接近200 倍，同时具有很好的线性关系(R²＝0.9985)。

实施例5：本发明中实施例1制备的化合物(I)(5μM)，在DMSO/PBS 缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图

准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS 缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从2到10.5)，加入到96孔板中，统计数据，并做点状图。荧光激发波长为510nm，发射波长为675nm。

荧光图谱见图7。数据表明，化合物(I)没有对pH的敏感性。

实施例6：本发明中化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4， v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测

准确称取一定量化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(1-12分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、甘油，最终浓度均为1mM)，37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为510nm，发射波长为675nm。

荧光图谱见图8。实验结果表明，除了甘油，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其抗干扰能力十分好。

实施例7:本发明中化合物(I)的细胞成像图。

准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mLDMEM培养基中。取1mL含有化合物(I)的培养液加入到Hela细胞/MCF-7细胞中，37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，然后用商品化的制霉菌素(Nystatin)，37℃ 下孵化20min，PBS洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图9为细胞共聚焦荧光成像效果图：化合物(I) 激发波长为488nm，接收波长范围为650～700nm。

荧光图谱见图9。实验结果表明，化合物(I)可以检测Hela细胞内粘度的变化，平均荧光强度为14.069，在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，平均荧光强度为37.646。同时化合物(I)也可以检测MCF-7细胞内粘度的变化，平均荧光强度为22.293，在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，平均荧光强度为41.030。

实施例8:本发明中化合物(I)的斑马鱼共聚焦成像图

将受精胚胎暴露于将约40个受精胚胎置于100mL含有0、100和 1000μg/L的粒径为50-μm聚苯乙烯微塑料的溶液中。培养3天后，从每组溶液中随机选择约5只斑马鱼幼鱼作为一个样品(每个暴露组五个样品)。准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到化合物(I)为5μM的1.998mL水中。37℃ 下孵化0.5h，用水洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图10为细胞共聚焦荧光成像效果图：化合物(I)激发波长为488nm，接收波长范围为650～700nm。

实验结果表明，化合物(I)可以检测由微塑料引起的斑马鱼肠道内粘度的变化。在没有微塑料加入时，斑马鱼基本无荧光。在对照组实验中，当斑马鱼用1000μg/L的微塑料处理后，不添加化合物(I)，斑马鱼也不会显示出荧光，此实验排除了微塑料使斑马鱼体内产生荧光的可能性。当斑马鱼用100μg/L的微塑料处理后，加入化合物(I)，斑马鱼显示出明显的荧光，并且在用1000μg/L的微塑料处理后，荧光强度明显增加。

实施例9：本发明中化合物(I)在不同临床血液样本中的荧光图

为实验的准确性，选取糖尿病病人50例，男30例，女20例，平均年龄58.2±9.3岁，其中，处于胰岛素依赖型(即I型)的患者30例，男 18例，女17例；处于非胰岛素依赖型(即II型)的患者20例，男12 例，女8例。在对照组20例中，男13例，女7例，平均年龄56.6±13.8岁。受检者均未经降血液粘度及降低血浆纤维蛋白原治疗。

准确称取一定量化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.374mL，随后分别加入20μL样本血液， 37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为510nm，发射波长为675nm。统计各样本在675nm处的荧光强度，做平均值与标准差的柱状图，如图11 (1：I型糖尿病患者血液样本，2：II型糖尿病血液样本，3：健康血液对照组)。运用SPSS软件处理，3组间显著性检验用t检验，发现具有显著性差异(P<0.01)。

实验结果表明，化合物(I)可以作为诊断糖尿病血液样本的新途径。在I型糖尿病样本中，化合物(I)的荧光强度较高，说明I型糖尿病患者的血液粘度较高，与医学上全血粘度的实验结果相契合。同时在检测I 型糖尿病、II型糖尿病以及健康血液的血液粘度时，化合物(I)的荧光强度具有显著性差异，说明在不同时期的糖尿病血液样本，其荧光强度具有显著性差异，说明不同程度的糖尿病病人在采用本实施例的方法检测时，具有一定的区分性。因此，可以将本方法作为糖尿病初步诊断的依据，实现快速、有效的诊断。

Claims

1.结构如式(I)所示荧光化合物在制备用于粘度检测的荧光探针中的应用；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述荧光探针用于测定细胞内粘度值。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述荧光探针用于检测微塑料引起的斑马鱼肠胃粘度变化。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述荧光探针用于检测糖尿病病人血液样本粘度。