CN115141145A - 一种检测溶酶体次溴酸荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测溶酶体次溴酸荧光探针。具体地，本发明的探针可用于测量、检测或筛选次溴酸，可以实现对次溴酸的快速高灵敏分析，可以实现生物体内微量水平次溴酸的检测，同时，能够实现生物体内内源性次溴酸的检测，而且具有溶酶体靶向功能。

Description

一种检测溶酶体次溴酸荧光探针、制备方法与应用
技术领域
本发明涉及1,8-萘酰亚胺衍生的化合物作为次溴酸荧光探针，能够对次溴酸快速响应特异性识别，或者其可测定样品中次溴酸的浓度，并同时具有靶向溶酶体的性能。
背景技术
近年来对抑郁症发病机制的研究表明，抑郁症患者氧化和抗氧化系统的平衡被破坏，总抗氧化能力降低，而氧化应激呈上升趋势，导致炎症反应，炎症反应导致神经元细胞自噬或凋亡。次溴酸(HOBr)作为一种重要的活性氧(ROS)，在抵抗病原菌入侵方面具有一定的作用，然而，越来越多的证据表明，细胞内HOBr水平的升高会导致嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)紊乱，引起细胞器氧化应激，进而导致多种生理和病理过程，包括炎症、凋亡、神经退行性疾病和癌症。同时，研究表明，溶酶体参与上述生理和病理过程，溶酶体是产生ROS的主要场所之一，溶酶体中HOBr的增加可导致氧化应激，导致多种酶失活，从而影响神经元功能，不可避免地影响情绪和认知，更严重的是可能发生抑郁。然而，由于缺乏合适的方法，溶酶体中HOBr含量的变化与抑郁行为的关系尚不清楚。为了解决上述问题，开发一种适合溶酶体中微量HOBr的实时监测方法是非常必要的。
近年来，已报到道的检测次溴酸的方法有比色法、化学发光法、库仑分析法、化学发光分析法、荧光探针分析法等，由于其高灵敏度和显著的时空分辨率，荧光探针作为一种非侵入性工具应用于生物成像中分析物测定。到目前为止，用于检测生物体中次溴酸的荧光探针相对缺乏，而且由于次溴酸在生理条件下氧化反应时间短、浓度低，探索一种新型高效荧光探针快速检测次溴酸仍然是一个热点问题。此外，用于检测次溴酸的选择性好、灵敏度高的溶酶体靶向型荧光探针还相对较少。因此，发展高选择性的、合成简单的、快速响应的溶酶体靶向型荧光探针是本领域技术人员急需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类新颖的次溴酸荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、灵敏度高、选择性好且能快速响应次溴酸等特点，并且能够在生理水平条件下对细胞进行荧光成像，同时溶酶体靶向功能，能够实现溶酶体内次溴酸的检测或实时监测。
具体而言，一种用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针，其特征在于：化学结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003738473410000031
其中：R1，R2，R3，R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4和R5可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的荧光探针是R1，R2，R3，R4和R5均为氢原子的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003738473410000032
本发明还提供了式(Ⅰ)荧光探针的制备方法，以式(Ⅲ)化合物和N-(2-氨基乙基)吗啉为原料，按照如下反应路线进行反应制备：
Figure BDA0003738473410000041
在本发明的一些具体实施方案中，具体制备步骤如下：将式(Ⅲ)化合物溶于乙二醇甲醚溶液中，再加入一定摩尔比的N-(2-氨基乙基)吗啉和二异丙基乙胺，加热回流反应，反应结束后，真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离，得到纯净的式(Ⅰ)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，其中所述1,8-萘酰亚胺类化合物与N-(2-氨基乙基)吗啉的摩尔比为1:1-1:3。
在本发明的一些具体实施方案中，其中所述的回流时间为20个小时。
本发明还提供了一种用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针组合物，其包含式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针。
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了一种用于检测样品中次溴酸的存在或测定样品中的次溴酸含量的方法，其包括：
a)使式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是水样品、化学样品或生物样品。
本发明还提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针的应用，所述荧光探针制备应用于检测或实时检测溶酶体内次溴酸的试剂。
本发明还提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针在细胞荧光成像的应用。
本发明还提供了用于检测样本中次溴酸浓度的检测制剂或试剂盒，其包含式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)灵敏度高，响应迅速
本发明的荧光探针与次溴酸反应非常灵敏，检出限低至15nM，并且响应非常迅速，50秒即可响应完毕，从而有利于对次溴酸，尤其是溶酶体内次溴酸的实时检测。
(2)选择性高，抗干扰能力强
本发明的荧光探针可选择性的与次溴酸特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他氨基酸以及阴阳离子，包括但不限于钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、铁离子、亚铁离子、硝酸根、亚硝酸根、同型半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫离子、过氧化氢、溴离子等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
(3)具有溶酶体靶向功能
本发明的荧光探针可以很好的富集在溶酶体中，能够实现对溶酶体中次溴酸的检测或实时检测。
(4)细胞毒性低，可生理水平条件下应用
本发明的荧光探针细胞毒性低，有利于在生理水平条件下应用，可以应用于活细胞荧光成像。
(5)稳定性好
本发明的荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(6)合成简单
本发明的荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1制备得到的探针的核磁氢谱；
图2是实施例1制备得到的探针的核磁碳谱；
图3是实施例1制备得到的探针的质谱；
图4是探针(5μM)分别加入次溴酸前后的响应时间谱图；
图5中是探针(5μM)加入次溴酸(0-10μM)前后的荧光光谱；
图6中是探针(5μM)在555nm处的荧光强度和次溴酸(0-1μM)的线性关系图；
图7中是次溴酸(10μM)与其他不同离子分析物对探针(5μM)的荧光强度的影响，分析物包括钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、铁离子、亚铁离子、硝酸根、亚硝酸根、同型半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫离子、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧阴离子、单线态氧、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、溴离子、次氯酸；
图8是探针的细胞毒性测试数据；
图9是探针(10μM)在PC-12细胞中对内源性和外源性的次溴酸的荧光成像；
图10是探针(100μM)在不同小鼠模型中的荧光成像；
图11是荧光探针靶向溶酶体能力测试的细胞成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅱ)化合物的合成
合成路线如下：
Figure BDA0003738473410000081
具体操作步骤如下：
实施方案1：将275mg(1mmol)式(Ⅴ)化合物溶于7mL乙二醇甲醚溶液中，再加入130mg(1mmol)N-(2-氨基乙基)吗啉和774mg二异丙基乙胺回流20h，减压条件下旋蒸干溶剂。真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离得到纯品151mg，产率为41％。
实施方案2：将275mg(1mmol)1,8-萘酰亚胺类化合物溶于7mL乙二醇甲醚溶液中，再加入195mg(1.5mmol)N-(2-氨基乙基)吗啉和774mg二异丙基乙胺回流20h，减压条件下旋蒸干溶剂。真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离得到纯品166mg，产率为45％。
实施方案3：将275mg(1mmol)1,8-萘酰亚胺类化合物溶于7mL乙二醇甲醚溶液中，再加入260mg(2mmol)N-(2-氨基乙基)吗啉和774mg二异丙基乙胺回流20h，减压条件下旋蒸干溶剂。真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离得到纯品185mg，产率为50％。
实施方案4：将275mg(1mmol)1,8-萘酰亚胺类化合物溶于7mL乙二醇甲醚溶液中，再加入325mg(2.5mmol)N-(2-氨基乙基)吗啉和774mg二异丙基乙胺回流20h，减压条件下旋蒸干溶剂。真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离得到纯品207mg，产率为56％。
实施方案5：将275mg(1mmol)1,8-萘酰亚胺类化合物溶于7mL乙二醇甲醚溶液中，再加入390mg(3mmol)N-(2-氨基乙基)吗啉和774mg二异丙基乙胺回流20h，减压条件下旋蒸干溶剂。真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离得到纯品236mg，产率为64％。
制备得纯净的式(Ⅱ)化合物的核磁氢谱、碳谱和质谱分别如图1、图2和图3所示，核磁氢谱、碳谱、质谱数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.55(s,2H),2.71(s,2H),3.37(s,2H),3.53-3.63(m,8H),4.12(t,J＝6.0Hz,2H),4.81(s,1H),6.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.66-7.69(m,2H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),8.42(d,J＝4.0Hz,1H),8.64(d,J＝8.0Hz,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):41.86,53.68,56.50,58.45,66.50,104.34,108.40,120.57,122.44,124.77,128.85,129.87,131.08,134.59,150.84,163.49,164.34.HRMS:TheoreticalforC20H23N3O4[M+H]+370.1761；Found,370.1766。
实施例2：测试荧光探针的时间动力学
配制一个荧光探针浓度为5μM的10mL的测试体系，然后将1μM的次溴酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝2:8(20mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。测试结果如图4所示。
由图4可以清楚地看到，当次溴酸加入后，经检测，50S左右505nm处的荧光强度达到最大值并保持不变，这说明本发明荧光探针与次溴酸反应迅速，能够为其测定提供快速的分析方法。
实施例3:测试荧光探针对于次溴酸的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的次溴酸(0-10μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后，静置1分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝2:8(20mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图5和图6所示。
从图5可以清晰的看出，随着次溴酸浓度的增加，505nm处的荧光强度逐渐升高。并且，由图6可以看出探针(5μM)加入次溴酸(0-1μM)之后，其505nm处的荧光强度的与次溴酸浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对次溴酸进行定量分析。
实施例4：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、铁离子、亚铁离子、硝酸根、亚硝酸根、同型半胱氨酸(500μM)、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(5mM)、硫离子、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧阴离子、单线态氧、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、溴离子、次氯酸(10μM)、次溴酸(10μM)，除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后，静置1分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝2:8(20mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的，测试结果如图7所示。
从图7可以清晰的看出，在发射波长在505nm处时，只有次溴酸加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对次溴酸具有较高的选择性，有利于对次溴酸的检测分析。
实施例5：探针的检出限测试和计算
采用荧光滴定法计算检出限。检测限计算公式如下:
检出限＝3σ/k
Figure BDA0003738473410000121
σ是空白探针的荧光强度的标准差，k是图6线性关系图的斜率。
由此计算式(Ⅱ)探针对次溴酸的检出限为15nM。
实施例6:荧光探针细胞毒性测试
通过细胞计数试剂盒CCK-8评估用本发明荧光探针处理的PC12细胞的细胞活力。具体，将密度为1×106cells·mL-1的PC12细胞接种在96孔板上，在37℃的5％CO2/95％空气培养箱中培养12小时。然后将PC12细胞用不同浓度(0、5、10、20、30μM)的荧光探针孵育24小时。随后，将CCK-8溶液添加到每个孔中2小时，并测量450nm处的吸光度，测试结果如图8所示。
从图8可以清晰的看出，该探针细胞毒性较低，有利于生理水平条件下的应用。
上述测试所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
实施例7:荧光探针对活细胞中次溴酸的荧光显微成像
将PC-12细胞分成五组，A组用探针(10μM)孵育30min；B组先用NaBr(100μM)孵育30min后，再用探针(10μM)孵育30min；C组先用NaBr(100μM)和NAC(500μM)依次孵育30min后，再用探针(10μM)孵育30min；D组先用NAC(500μM)孵育30min后，再用探针(10μM)孵育30min；E组先用12-O-十四烷酰基佛波醇13-乙酸酯(PMA，1.0μgmL-1)孵育1h后，再用探针(10μM)孵育30min。最后对五组细胞分别进行共聚焦显微成像并统计每组细胞的相对荧光强度，测试结果如图9所示。
从图9可以看出，用本发明荧光探针孵育的细胞显示弱绿色荧光(图9A)；而用NaBr孵育后又用本发明荧光探针孵育的细胞绿色荧光显著增强(图9B)；作为对比的是，用NaBr孵育后又用NAC(具有清除HOBr的功能)，最后再用本发明荧光探针孵育的细胞绿色荧光显著减弱(图9C)；而直接用NAC孵育后又用本发明荧光探针孵育的细胞绿色荧光，与A组对比，明显减弱(图9D)；最后一组，经PMA(可诱导内源性HOBr的产生)孵育处理的细胞的绿色荧光信号显著增强(图9E)。结合图9F以及成像结果表明，本发明荧光探针既可以检测细胞中的外源性次溴酸，也可以检测细胞中的内源性次溴酸。
上述测试所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
实施例8：荧光探针对小鼠模型总微量HOBr波动的跟踪监测
构建了小鼠炎症模型和肿瘤模型，结合TP成像的优势，跟踪监测微量HOBr在体内的波动。选择6周大的小鼠作为实验对象，首先，将小鼠分为对照组和炎症组，炎症组小鼠腹腔注射脂多糖(LPS，1mg/kg)，对照组小鼠腹腔注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)。炎症组和对照组在给药后24小时取样，TP成像，如图10A和图10B所示，与对照组相比，腹部组织的TP深度成像显示炎症组织显示出明显的绿色荧光，这可能是因为炎症反应通过激活NADPH氧化酶复合物促进抗菌物质HOBr的产生。结果表明，TP成像与本发明荧光探针的组合使用可以直观地区分炎症组织和正常组织。
通过将4T1细胞注射到小鼠前臂腋窝中以获得持续10天的肿瘤肿块，建立小鼠乳腺癌模型。制备完成后，分别用探针(100μM)加载正常组织和肿瘤组织，TP成像，如图10C和图10D所示。通过TP成像实现了HOBr的深层组织成像，进一步证明了探针的组织渗透性。三维图像显示正常组织显示较弱的绿色荧光，而肿瘤组织显示明显的绿色荧光。三维图像充分证明了探针在区分正常组织和肿瘤组织(取决于两者中HOBr的浓度)方面的潜在应用价值。结果表明，本发明荧光探针具有良好的生物相容性和在体内成像HOBr的能力。
上述测试所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
实施例9:荧光探针靶向溶酶体能力测试
PC-12细胞先用次溴酸进行孵育30分钟，然后分别加入探针(10μM)以及不同商用细胞器染料(溶酶体，细胞核，内质网，线粒体)共孵育30分钟，再用磷酸盐缓冲液进行清洗3次减少背景荧光，采用共聚焦显微镜进行成像，成像结果如图11所示。
从图11可以看出，本发明荧光探针有较强的组织穿透性，能够检测细胞内的次溴酸，通过与溶酶体等商用染料标记对比，在叠加场以及红绿荧光重叠系数图(A4-D4)可以看出该探针与溶酶体重叠效果最好，重叠系数分别为溶酶体(0.92)，细胞核(0.46)，细胞核(0.54)，线粒体(0.42)，表现出本发明荧光探针具有优秀的靶向溶酶体的能力。
上述测试所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针，其特征在于：化学结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003738473400000011
其中：R1，R2，R3，R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4和R5可以相同或不同。
2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：R1，R2，R3，R4和R5均为氢原子。
3.一种制备权利要求1或2所述荧光探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以式(Ⅲ)化合物和N-(2-氨基乙基)吗啉为原料，按照如下反应路线进行反应制备：
Figure FDA0003738473400000012
其中：R1，R2，R3，R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中R1，R2，R3，R4和R5可以相同或不同。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式(Ⅲ)化合物溶于乙二醇甲醚溶液中，再加入一定摩尔比的N-(2-氨基乙基)吗啉和二异丙基乙胺，加热回流反应，反应结束后，真空抽滤得到滤液并在减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷进行柱色谱分离，得到纯净的式(Ⅰ)化合物。
5.一种用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述荧光探针。
6.如权利要求5所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
7.一种用于检测样品中次溴酸的存在或测定样品中的次溴酸含量的方法，其包括：
a)使权利要求1-2中任一项的荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
8.如权利要求7所述方法，所述样品是水样品、化学样品或生物样品。
9.根据权利要求1或2所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针制备应用于检测或实时检测溶酶体内次溴酸的试剂。
10.权利要求1-2任一项所述荧光探针在细胞荧光成像的应用。
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