CN116283900B - 一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与应用。所述荧光探针具有如下的分子结构表达式。本发明通过在荧光探针结构中引入4‑(2‑氨基乙基)吗啉基团，实现了对溶酶体的靶向性识别，可以检测溶酶体中的半胱氨酸，并且荧光强度高、响应快速、检测灵敏度高。

Description

一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种荧光探针，尤其涉及一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
溶酶体是一种单膜细胞器，含有约60种水解酶，用于执行溶酶体的分解代谢功能。同时，溶酶体具有质子泵，能够将腔内环境保持在pH＝4.6-5.0范围内，为水解酶提供必要的酸性环境。除了降解功能外，当细胞受损时，溶酶体还与质膜融合，并在某些细胞类型中具有更特异的分泌功能。此外，溶酶体在细胞代谢和细胞应激中起主导作用，并与许多神经退行性疾病相关。作为一种含有巯基的游离氨基酸，半胱氨酸在溶酶体内蛋白质二硫键的水解过程中起着至关重要的作用，并具有相对独立的溶酶体转运系统。同时，溶酶体中的半胱氨酸可能与许多疾病有关，比如，过高浓度的半胱氨酸会显著提高心脏疾病的发病率，并可能诱发阿尔茨海默症、神经中枢缺陷等。因此，可视化半胱氨酸在生物系统中的分布和浓度将非常重要，有助于阐明半胱氨酸的生物学作用。
专利CN114634473B提出一种能够快速高效检测生物硫醇的基于香豆素的荧光探针，具有高选择性和快速高效检测谷胱甘肽、半胱氨酸和高半胱氨酸的优点，但荧光选择性不够专一。专利CN114835698A提出一种(二苯氨基)苯基黄酮类荧光探针，能与半胱氨酸进行专一性反应，同时灵敏度高，但是其不具备溶酶体靶向定位功能，无法准确检测溶酶体中的半胱氨酸，限制了该荧光探针在活细胞内实时检测的应用。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明首先提出一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针。本发明通过引入4-(2-氨基乙基)吗啉基团实现荧光探针对溶酶体的靶向性，并且荧光强度高、响应快速、检测灵敏度高。
基于本发明的第二个方面，还提出一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法。本发明提供的制备方法工艺简单、原料易得，具有良好的工业适用性。
基于本发明的第三个方面，还提出一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针在试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针，其分子结构表达式如下：
一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、将氢氧化钾加入至二甲基亚砜中搅拌，再加入化合物1和碘化钾，搅拌反应30-100min；将反应混合物倒入水中并加入有机溶剂萃取，有机相用饱和食盐水洗涤、干燥后分离提纯，得到化合物2；
S2、将化合物2溶于有机溶剂后，在低温(如-5℃至0℃)搅拌下分次加入间氯过氧苯甲酸，回流反应12-36h；反应结束后，加入二甲基亚砜淬灭反应，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤有机相，干燥后分离提纯，得到化合物3；
S3、将化合物3加入至N,N-二甲基甲酰胺中搅拌，氮气保护下加入NaH搅拌反应12-24h；反应结束后加盐酸将反应液酸化至pH为2-4，有机溶剂萃取得到有机相，饱和食盐水洗涤有机相，干燥后分离提纯，得到化合物4；
S4、将化合物4、4-(2-氨基乙基)吗啉溶于甲苯中，再加入钯催化剂以及双磷配体、碳酸铯，回流条件下搅拌反应10-24h；反应结束后用硅藻土过滤得到反应液，提纯得到化合物5；
S5、将化合物5溶于乙腈后，加入N-氟代双苯磺酰胺，室温下搅拌反应5-12h；反应结束后加水淬灭反应，有机溶剂萃取，分离提纯，得到化合物6，即所述荧光探针。
作为本发明优选地实施方案，步骤S1中，化合物1、氢氧化钾、碘化钾的摩尔比为1:(4-5):(1-2)，例如1:5:1、1:4:1、1:5:2、1:4:2、1:4.5:1.5、1:4.2:1.6、1:4.8:1.7、1:4.5:1.8等；
优选地，步骤S1中萃取用有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种。
作为本发明优选地实施方案，步骤S2中，化合物2和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:(4-6)，例如1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8等；
优选地，步骤S2中反应温度为30-55℃，例如35℃、40℃、45℃、50℃、55℃等；
优选地，步骤S2中有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或多种。
作为本发明优选地实施方案，步骤S3中，化合物3和NaH的摩尔比为1:(5-10)，例如1:6、1:7、1:8、1:9等；
优选地，步骤S3中，萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或多种。
作为本发明优选地实施方案，步骤S4中，化合物4、4-(2-氨基乙基)吗啉和钯催化剂的摩尔比为1:(2-3):(0.05-0.2)；
优选地，所述钯催化剂选自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、四(三苯基膦)钯中的一种或多种。
作为本发明优选地实施方案，步骤S4中，双膦配体为2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(X-Phos)和/或1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)；
优选地，双膦配体添加量为钯催化剂摩尔量的1-3倍，例如1倍、1.5倍、2倍、2.5倍等；碳酸铯的添加量为钯催化剂摩尔量的10-20倍，例如11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍等；
优选地，步骤S4中反应温度为95-120℃，例如95℃、100℃、105℃、110℃、115℃等。
作为本发明优选地实施方案，步骤S5中，化合物5和N-氟代双苯磺酰胺的摩尔比为1:(1-1.2)，例如1:1、1:1.1、1:1.5、1:1.2等；
优选地，步骤S5中萃取用有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种。
作为本发明优选地实施方案，步骤S1至S5中，有机相分离提纯的方式均优先采用柱层析。
一种如前文所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针和前文所述的方法制备得到的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针在试剂盒中的应用。
本发明通过在荧光探针结构中引入4-(2-氨基乙基)吗啉基团，其中吗啉基团具有合适的pKa(5-6)，能够定向转移到溶酶体(pH 4.5-5.5)中而不在细胞质或其他细胞器中积累，可以实现对溶酶体的靶向性识别并且该探针可以检测溶酶体中的半胱氨酸，同时荧光强度高、响应快速、检测灵敏度高。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，本发明所述实施例只是作为对本发明的说明，不限制本发明的范围。
本发明以下实施例中原料和试剂如无特殊说明，均购自市售成品。其中，原料6-溴-2H-萘并[1,8-bc]噻吩-2-酮(CAS：20875-65-4)，采购自HE Chemical(中国)。
【实施例1】
(1)首先将氢氧化钾(1.81g,32.2mmol)在10ml DMSO中搅拌5分钟后加入化合物1(即6-溴-2H-萘并[1,8-bc]噻吩-2-酮)(1.79g,7.0mmol)和碘化钾(0.67mL,10.7mmol)，40分钟后反应基本完成。将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3-4次，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析纯化，得到化合物2(634mg,2.04mmol)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.57(dd,J＝15.0,3.1Hz,1H),8.43–8.15(m,1H),7.90–7.61(m,2H),7.45(d,J＝14.8Hz,1H),4.20(s,3H),2.65(s,3H).
(2)将产物2(134mg,0.430mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌分次加入间氯过氧苯甲酸(0.371g,2.15mmol)。反应混合物在40℃回流搅拌下反应18h。反应完成后，加入少量DMSO淬灭反应，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后用硅胶柱层析纯化，得到化合物3(119mg,0.347mmol)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.56(dd,J＝14.9,3.0Hz,1H),8.42–8.21(m,2H),7.85–7.64(m,2H),4.15(s,3H),3.42(s,3H).
(3)将化合物3(68.6mg,0.200mmol)溶于10ml DMF中搅拌，然后在氮气保护下加入NaH(30.5mg,1.27mmol)，搅拌16h后反应基本完成。用2mol/L HCl将反应液酸化至pH为3，乙酸乙酯萃取得到有机相，饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物4(49.8mg,0.16mmol)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.43–8.27(m,3H),7.76(t,J＝15.0Hz,1H),7.71(d,J＝15.0Hz,1H),4.48(s,2H).
(4)将化合物4(24.9mg,0.08mmol)、4-(2-氨基乙基)吗啉(20.8mg,0.16mmol)溶于10ml甲苯中，加入醋酸钯(1.44mg,0.0064mmol)，碳酸铯(39.1mg,0.12mmol)，X-Phos配体(9.15mg,0.0192mmol)，95℃下回流搅拌18h。反应结束后用硅藻土过滤得到反应液，然后硅胶柱层析提纯，得到化合物5(18mg,0.05mmol)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.25(dd,J＝14.9,3.0Hz,1H),8.17(dd,J＝15.0,3.1Hz,1H),7.75(d,J＝15.0Hz,1H),7.63(t,J＝15.0Hz,1H),7.42(t,J＝38.7Hz,1H),4.74(s,2H),3.52(dt,J＝20.4,9.8Hz,6H),2.50(t,J＝10.2Hz,2H),2.41(t,J＝9.4Hz,4H),1.69(s,1H).
(5)将化合物5(113.4mg,0.315mmol)加入乙腈中，后加入N-氟代双苯磺酰胺(99.4mg,0.315mmol)，常温搅拌约6h后，反应基本结束，加水淬灭反应，再用二氯甲烷萃取得到有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物6，即半胱氨酸荧光探针。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.22(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),8.10(dd,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,1H),7.47(t,J＝8.0Hz,1H),5.42(t,J＝4.3Hz,1H),5.28(s,2H),3.65(ddd,J＝9.4,6.0,3.3Hz,4H),3.56–3.41(m,2H),2.71(t,J＝5.2Hz,2H),2.51(ddd,J＝17.8,6.0,3.3Hz,4H).
【实施例2】
(1)首先将氢氧化钾(1.57g,28mmol)在10ml DMSO中搅拌5分钟后加入化合物1(即6-溴-2H-萘并[1,8-bc]噻吩-2-酮)(1.79g,7.0mmol)和碘化钾(0.44mL,7mmol)，60分钟后反应基本完成。将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3-4次，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析纯化，得到化合物2。
(2)将产物2(134mg,0.430mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌分次加入间氯过氧苯甲酸(0.297g,1.72mmol)。反应混合物在55℃回流搅拌下反应36h。反应完成后，加入少量DMSO淬灭反应，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后用硅胶柱层析纯化，得到化合物3。
(3)将化合物3(68.6mg,0.200mmol)溶于10ml DMF中搅拌，然后在氮气保护下加入NaH(24mg,1mmol)，搅拌12h后反应基本完成。用2mol/LHCl将反应液酸化至pH为2，乙酸乙酯萃取得到有机相，饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物4。
(4)将化合物4(24.9mg,0.08mmol)、4-(2-氨基乙基)吗啉(26mg,0.2mmol)溶于10ml甲苯中，加入醋酸钯(1.8mg,0.008mmol)，碳酸铯(26.1mg,0.08mmol)，X-Phos配体(3.8mg,0.008mmol)，110℃下回流搅拌12h。反应结束后用硅藻土过滤得到反应液，然后硅胶柱层析提纯，得到化合物5。
(5)将化合物5(113.4mg,0.315mmol)加入乙腈中，后加入N-氟代双苯磺酰胺(99.4mg,0.315mmol)，常温搅拌约6h后，反应基本结束，加水淬灭反应，再用二氯甲烷萃取得到有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物6，即半胱氨酸荧光探针。
【实施例3】
(1)首先将氢氧化钾(1.96g,35mmol)在10ml DMSO中搅拌5分钟后加入化合物1(即6-溴-2H-萘并[1,8-bc]噻吩-2-酮)(1.79g,7.0mmol)和碘化钾(0.87mL,13.9mmol)，80分钟后反应基本完成。将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤3-4次，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析纯化，得到化合物2。
(2)将产物2(134mg,0.430mmol)溶于20ml无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌分次加入间氯过氧苯甲酸(0.445g,2.58mmol)。反应混合物在30℃回流搅拌下反应24h。反应完成后，加入少量DMSO淬灭反应，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后用硅胶柱层析纯化，得到化合物3。
(3)将化合物3(68.6mg,0.200mmol)溶于10ml DMF中搅拌，然后在氮气保护下加入NaH(48mg,2mmol)，搅拌24h后反应基本完成。用2mol/LHCl将反应液酸化至pH为4，乙酸乙酯萃取得到有机相，饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物4。
(4)将化合物4(24.9mg,0.08mmol)、4-(2-氨基乙基)吗啉(31.2mg,0.24mmol)溶于10ml甲苯中，加入醋酸钯(3.6mg,0.016mmol)，碳酸铯(74.9mg,0.23mmol)，X-Phos配体(15.3mg,0.032mmol)，120℃下回流搅拌24h。反应结束后用硅藻土过滤得到反应液，然后硅胶柱层析提纯，得到化合物5。
(5)将化合物5(113.4mg,0.315mmol)加入乙腈中，后加入N-氟代双苯磺酰胺(119.2mg,0.378mmol)，常温搅拌约10h后，反应基本结束，加水淬灭反应，再用二氯甲烷萃取得到有机相，无水NaSO4干燥后硅胶柱层析，得到化合物6，即半胱氨酸荧光探针。
【应用例】
(1)探针的半胱氨酸响应测试：
首先配制1mmol/L的实施例1制备的荧光探针水溶液，将1μmol/L半胱氨酸加入至荧光探针水溶液中，检测半胱氨酸加入前后的最大吸收波长、最大发射波长、斯托克斯位移，测试结果如表1所示：
表1、半胱氨酸响应测试结果
半胱氨酸加入前 半胱氨酸加入后
最大吸收波长 447nm 458nm
最大发射波长 527nm 635nm
斯托克斯位移 80nm 176nm
从上述测试结果可以看出，向实施例1制备的荧光探针水溶液中加入半胱氨酸，化合物的最大吸收波长、最大发射波长、斯托克斯位移均发生了显著变化，尤其是最大发射波长由527nm(绿色)转变为635nm(橙红色)，表明荧光检测准确度高。
另外值得注意的是，实施例1制备的荧光探针水溶液的背景荧光非常微弱(Φ＝0.03)，在加入半胱氨酸后5分钟内观察到高荧光强度(Φ＝0.34)，这表明该荧光探针与半胱氨酸发生反应导致荧光强度增强；因此，该荧光探针可以检测半胱氨酸信号分子。
(2)物质浓度与荧光强度的关系
按照表2中数据配制不同浓度的荧光探针水溶液，并分别加入1μmol/L半胱氨酸溶液，在365nm的紫外光照射下测试荧光强度，并记录标准强度(F/F0)，其中F0是指半胱氨酸加入前的荧光强度，F是指半胱氨酸加入后30min的荧光强度。结果如表2所示：
表2、物质浓度与荧光强度的关系
浓度(μmol/L) 5 10 20 30 40 50 60 80 100
标准强度(F/F0) 0.7 1.9 3.4 4.5 4.9 5.6 6.9 7.7 9.3
可见，在一定浓度内的荧光探针水溶液，其在半胱氨酸响应后的荧光强度与荧光探针物质浓度基本呈线性正相关的关系。
(3)检测灵敏度测试：
分别将荧光探针溶液(终浓度为1μmol/L)加入不同浓度的半胱氨酸溶液中(终浓度为5、10、25、50、100、250nmol/L)进行反应，测定反应后溶液的荧光光谱。结果显示，在与不同浓度的半胱氨酸反应时(5-250nmol/L范围内)，荧光探针均产生了“turn on”型的荧光信号的改变，表明荧光检测灵敏度高，且适应范围广；并且测试发现随着半胱氨酸浓度增加，反应速率也在不断加快，但整体在两分钟内达到饱和。
(4)荧光选择性测试：
分别向1mmol/L荧光探针水溶液中加入具有以下自然界或人体内常见阴离子化合物，包括H2S、KCl、NaI、MgSO4、KNO3、NaNO2、Na2CO3、NaHCO3、NaOAc以及常见活性小分子，包括谷胱甘肽、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、5-氨基酮戊酸、精氨酸酶的水溶液(1μmol/L)，结果发现，这些溶液样品的荧光发射强度与单独荧光探针的荧光发射强度(Φ＝0.03)相比没有明显变化，表明荧光探针仅对半胱氨酸具有高度的响应性以及选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的分子结构表达式如下：
2.一种用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将氢氧化钾加入至二甲基亚砜中搅拌，再加入化合物1和碘化钾，搅拌反应30-100min；将反应混合物倒入水中并加入有机溶剂萃取，有机相用饱和食盐水洗涤、干燥后分离提纯，得到化合物2；
S2、将化合物2溶于有机溶剂后，在低温搅拌下分次加入间氯过氧苯甲酸，回流反应12-36h；反应结束后，加入二甲基亚砜淬灭反应，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤有机相，干燥后分离提纯，得到化合物3；
S3、将化合物3加入至N,N-二甲基甲酰胺中搅拌，氮气保护下加入NaH搅拌反应12-24h；反应结束后加盐酸将反应液酸化至pH为2-4，有机溶剂萃取得到有机相，饱和食盐水洗涤有机相，干燥后分离提纯，得到化合物4；
S4、将化合物4、4-(2-氨基乙基)吗啉溶于甲苯中，再加入钯催化剂以及双磷配体、碳酸铯，回流条件下搅拌反应10-24h；反应结束后用硅藻土过滤得到反应液，提纯得到化合物5；
S5、将化合物5溶于乙腈后，加入N-氟代双苯磺酰胺，室温下搅拌反应5-12h；反应结束后加水淬灭反应，有机溶剂萃取，分离提纯，得到化合物6，即所述荧光探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中，化合物1、氢氧化钾、碘化钾的摩尔比为1:(4-5):(1-2)。
4.根据权利要求3所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1中萃取用有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中，化合物2和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:(4-6)。
6.根据权利要求5所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中反应温度为30-55℃。
7.根据权利要求5所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或多种。
8.根据权利要求2-7任一项所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S3中，化合物3和NaH的摩尔比为1:(5-10)。
9.根据权利要求8所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S3中，萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S4中，化合物4、4-(2-氨基乙基)吗啉和钯催化剂的摩尔比为1:(3-5):(0.1-0.2)。
11.根据权利要求10所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述钯催化剂选自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、四(三苯基膦)钯中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S4中，双膦配体为2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯和/或1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦。
13.根据权利要求12所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，双膦配体添加量为钯催化剂摩尔量的0.5-1.5倍；碳酸铯的添加量为钯催化剂摩尔量的10-15倍。
14.根据权利要求12所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S4中反应温度为95-120℃。
15.根据权利要求8所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S5中，化合物5和N-氟代双苯磺酰胺的摩尔比为1:(1-1.2)。
16.根据权利要求15所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S5中萃取用有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种。
17.根据权利要求2-7任一项所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1至S5中，有机相分离提纯的方式均为柱层析。
18.一种如权利要求1所述的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针和权利要求2-17任一项所述的方法制备得到的用于检测溶酶体中半胱氨酸的荧光探针在制备试剂盒中的应用。
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