CN107488446A - 一种比色比率型酸碱荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种比色比率型酸碱荧光探针及其制备方法和应用。该比色比率型酸碱荧光探针具有如式1、式2或式3所示的半花菁和对羟基苯乙醛的缀合结构。本发明的比色比率型酸碱荧光探针，具有良好的水溶性，在pH为6.0～8.0范围内裸眼观察，pH小于7.0时为黄色，pH越小黄色越深，pH大于7.0时为红色，pH越大颜色越深；荧光检测试验表明，采用455nm波长激发，在pH为6.6～8.0范围内，pH值变化与荧光强度比值I_530nm/I_557nm的变化具有良好的线性关系，表明在酸碱响应下具有比色比率特性；该比色比率型酸碱荧光探针在肿瘤细胞的自噬过程检测中具有良好应用。

Description

一种比色比率型酸碱荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种比色比率型酸碱荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

荧光探针分析方法具有灵敏度高、选择性强、实时原位检测以及可视化检测等特点。由于在分析过程中对样品的无损伤性，荧光探针在生物样品分析中更具优势。目前，围绕荧光探针的生物成像特点，已有大量研究工作正在开展。其中，针对生物体内相关的生物活性小分子(活性硫、活性氮、活性氧等)、与生化过程关联的重要离子(Zn²⁺、Gu²⁺、Hg²⁺、以及H⁺/OH^-等)等检测物为靶标的新型结构荧光探针的研究工作日益活跃。

细胞内的酸碱水平一方面有利于维持其生长、分化等生化过程。另一方面，细胞内环境中酸碱水平的变化也将影响细胞的正常生长，导致其生长异化而引发系列相关疾病。因此，基于荧光探针在生物环境中检测的特点，开发能够灵敏检测细胞内活性小分子的荧光探针将具有良好应用前景。

细胞的生长、增殖过程中其细胞内液pH值随着细胞状态的改变而发生变化，如在肿瘤细胞的自噬死亡过程中，由于酸性溶酶体吞噬损伤的线粒体，会造成局部内环境pH值的变化。目前，多数的荧光探针只在酸性或碱性范围内表现出比率特性，当细胞内环境出现酸碱转换的情形时，现有的荧光探针无法应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种比色比率型酸碱荧光探针。

本发明的第二个目的在于提供上述比色比率型酸碱荧光探针的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述比色比率型酸碱荧光探针的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种比色比率型酸碱荧光探针，其具有如式1、式2或式3所示的结构，

本发明的比色比率型酸碱荧光探针，具有良好的水溶性，在pH为6.0～8.0范围内裸眼观察，pH小于7.0时为黄色，pH越小黄色越深，pH大于7.0时为红色，pH越大颜色越深；荧光检测试验表明，采用455nm波长激发，在pH为6.6～8.0范围内，pH值变化与荧光强度比值I_530nm/I_557nm的变化具有良好的线性关系，表明在酸碱响应下具有比色比率特性。

上述比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，包括：在保护气氛下，对羟基苯乙醛和式4所示的化合物在溶剂中回流反应，即得；

本发明的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，工艺简单、反应条件温和、产品收率高。

对羟基苯乙醛的制备包括以下步骤：将对羟基苯乙醇和三乙胺溶于溶剂中，加入催化剂进行反应，即得。所述催化剂为三氧化硫-吡啶。

对羟基苯乙醛的制备过程中，对羟基苯乙醇与三乙胺的摩尔比为34～38：1。对羟基苯乙醇与三氧化硫-哌啶的摩尔比为1:1.8～2.2。反应是在室温下反应至少1h。反应后加入冰水，再用二氯甲烷进行萃取，有机相除水后，蒸除溶剂,剩余物用硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，V:V)分离得对羟基苯乙醛。

式4所示的化合物的制备包括以下步骤：在保护气氛下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚和碘乙烷在70～80℃反应，即得。

式4所示的化合物的制备过程中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚和碘乙烷的摩尔比为1:1～2。反应的时间为3～5h。反应后冷却至室温，固体经洗涤后即得。

对羟基苯乙醛和式4所示的化合物反应时，优选的溶剂为无水乙醇。对羟基苯乙醛和式4所示的化合物的摩尔比为1：1～2。回流反应时加入哌啶作为催化剂。优选的，每1mmol对羟基苯乙醛对应加入2～3滴哌啶做为催化剂催化反应。进一步优选的，回流反应的时间为4～6h。反应后加入NaOH溶液，再用二氯甲烷进行萃取，分离有机相，再经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，剩余物用碱性氧化铝柱(二氯甲烷：甲醇＝10:1，V:V)分离即得碱性条件下存在的式3所示的化合物(式2所示化合物为中间态化合物，式2与式3的化合物以动态平衡存在，碱性条件下主要以式3形式存在)；式3所示化合物经1M盐酸酸化后用二氯甲烷进行萃取，分离有机相，再经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，剩余物用硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝10:1，V:V)分离得到酸性条件下存在的式1所示的化合物。

本发明的比色比率型酸碱荧光探针可用于检测肿瘤细胞的自噬过程，该荧光探针在酸碱条件下可以相应发射两种荧光，相对于常规探针的单色荧光发射光谱，具有响应灵敏、便于观察的优点。

附图说明

图1为式1的化合物的H谱；

图2为式2的化合物的H谱；

图3为实施例1的荧光探针在不同pH值缓冲液中的紫外吸收变化曲线；

图4为实施例1的荧光探针在典型吸收峰处的吸收强度比值随pH值变化的线性拟合曲线；

图5为在455nm的激发波长下，实施例1的荧光探针在不同pH值缓冲液中的荧光强度变化曲线；

图6为在455nm的激发波长下，实施例1的荧光探针的典型发射峰强度比值随pH值变化的拟合曲线；

图7为实施例1的荧光探针的酸碱可逆性响应曲线；

图8为实施例1的荧光探针与不同干扰离子在pH＝6.0的缓冲液中的紫外吸收曲线；

图9为实施例1的荧光探针与不同干扰离子在pH＝8.0的缓冲液中的紫外吸收曲线；

图10为实施例1的荧光探针与不同干扰离子在pH＝6.0的缓冲液中的荧光强度变化曲线(激发波长为422nm)；

图11为实施例1的荧光探针与不同干扰离子在pH＝8.0的缓冲液中的荧光强度变化曲线(激发波长为522nm)；

图12为实施例1的荧光探针的MTT细胞毒性试验结果；

图13为实施例1的荧光探针对细胞内pH值变化的响应图；

图14为实施例1的荧光探针对细胞内的线粒体的定位试验图；

图15为实施例1的荧光探针在细胞自噬过程中的荧光检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。

实施例1

本实施例的比色比率型酸碱荧光探针，采用如下步骤进行制备：

1)在100mL圆底烧瓶中加入对羟基苯乙醇(2.0g，14.5mmol)和三乙胺(5.29mL，0.4mmol)，加入溶剂二甲基亚砜(DMSO)20mL，然后在30min内分三次加入三氧化硫-吡啶(4.54g，28.5mmol)，室温反应1小时，加入100mL冰水，用200mL二氯甲烷萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂,得到的液体用硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，V:V)分离得对羟基苯乙醛；

2)把2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.3g,32.8mmol)加入到碘乙烷(12.9g,82.5mmol)中，在氮气保护下加热到75℃，反应4h，冷却至室温，固相经5mL乙醚洗涤后得到紫色结晶，其结构式如式4所示；

3)将对羟基苯乙醛(136.1mg，1mmol)和式4所示的化合物(301.2mg，1mmol)加入到10mL无水乙醇中，滴加3滴哌啶，回流反应5h，反应结束后，加入质量浓度为10％的NaOH溶液(10mL)，再用10mL的二氯甲烷萃取三次，有机相使用无水硫酸钠干燥后，蒸除溶剂，剩余物用碱性氧化铝(二氯甲烷：甲醇＝10:1，V:V)分离即得碱性条件下存在的式3所示的化合物；式3所示化合物经1M盐酸酸化后再用二氯甲烷进行萃取，分离有机相，再经无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，剩余物用硅胶(二氯甲烷：甲醇＝10:1，V:V)分离得到酸性条件下存在的式1所示的化合物；

本实施例的合成路线如下所示：

步骤1)产率为7.4％，产物H谱为¹H NMR(300MHz,CDCl3):9.68(t,J＝2.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.6Hz,2H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),7.75-6.10(br s,1H),3.61(d,J＝2.4Hz,1H)。

步骤2)产率为95％，产物H谱为¹H NMR 1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.62-1.66(t,J＝7.6Hz,3H),1.67(s,6H),3.17(s,3H),4.76-4.81(q,2H),7.58-7.64(m,3H),7.71-7.75(m,1H)。

步骤3)产率为57.5％，式1的化合物的H谱(如图1所示)为¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.08(s,1H),8.41(d,J＝16.0Hz,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,2H),7.87(d,J＝7.2Hz,2H),7.59(t,J＝5.7Hz,2H),7.47(d,J＝16.2Hz,1H),6.97(d,J＝8.3Hz,2H),4.65(d,J＝7.7Hz,2H),1.78(s,6H),1.43(t,J＝7.3Hz,3H)；

式3的化合物的H谱(如图2所示)为¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.17(d,J＝15.2Hz,1H),7.98(d,J＝8.7Hz,2H),7.72(d,J＝7.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(s,1H),7.41(d,J＝7.4Hz,1H),7.06(d,J＝15.4Hz,2H),6.66(d,J＝8.7Hz,3H),4.44(d,J＝7.6Hz,2H),2.50(d,J＝3.2Hz,6H),1.72(s,6H),1.35(s,2H)。

本实施例中，式3所示的化合物为荧光探针在碱性条件下的存在形式，式2所示的化合物为式3所示的化合物的动态平衡形式；式1所示的化合物为荧光探针在酸性条件下的存在形式。

试验例1对pH值的响应性试验

将实施例1所得荧光探针在二甲基亚砜中溶解得10mM探针母液，配置pH为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液(二甲基亚砜:磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液＝1:99，V：V)各3mL，在缓冲液中分别加入30μL探针母液。裸眼观察结果表明，在pH小于7.0时为黄色，pH越小黄色越深，pH大于7.0时为红色，pH越大颜色越深。

图3为在不同pH值的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中荧光探针的紫外吸收变化曲线，图3中422nm处的吸光度数值由高到低的排序为pH为6.2、6.4、6.6、7.0、6.8、7.4、7.2、7.6、7.8、7.0；图4为典型吸收峰的吸收强度比值随不同pH值的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中变化的线性拟合曲线。由图3和图4可知探针的紫外吸收呈比率型变化，而且在pH为6.2--7.4紫外吸收强度比值有良好的线性关系。

图5为在455nm的激发波长下，荧光探针的荧光强度在不同pH值缓冲液中的变化曲线，图5中在557nm处的发射峰强度由高到低的排序为pH为8.0、7.8、7.6、7.4、7.2、7.0、6.6、6.4、6.2、6.0、6.8；图6为在455nm的激发波长下，荧光探针的典型发射峰强度比值随不同pH值变化的拟合曲线。由图5和图6的结果可知，在采用455nm波长激发，在pH为6.6～8.0范围内，pH值变化与荧光强度比值I_530nm/I_557nm的变化具有良好的线性关系；根据Henderson-Hasselbachtype方程(log[(I_max-I)/(I-I_min)]＝pK_a-pH)计算得到探针的pK_a值为7.25。

试验例2酸碱可逆性响应试验

在pH＝6的PBS缓冲液中加入探针溶液(同试验例1)，分别用HCl(0.1M)和NaOH(0.1M)调节缓冲液的pH值从6到8，再回调到6，循环5次，每次调节后用455nm波长激发，记录I_522nm/I_555nm的荧光强度数值，试验结果如图7所示。

由图7可知，本发明的荧光探针在酸碱变化过程的光谱响应具有可逆性。该可逆性特征有利于实现探针检测的重复性。

试验例3干扰离子试验

在不同pH值的缓冲液中，分别加入K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Sn^{2 +}、Mn²⁺、Cys(半胱氨酸)、HSO^3-、S₂O₃ ^2-、HS^-作为干扰离子，检测其紫外吸收和荧光强度，结果如图8～图11所示。

图8中422nm处的吸光度数值由高到低排序为：Blnk(空白)、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Pb^{2 +}、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cys、HSO^3-、S₂O₃ ^2-、HS^-；图9中522nm处的吸光度数值由高到低排序为：Blnk(空白)、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cys、HSO^3-、S₂O₃ ^2-、HS^-；图10中550nm处的荧光发射峰强度数值由高到低排序为Blnk(空白)、K⁺、Mg²⁺、Cu^{2 +}、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cys、HSO^3-、S₂O₃ ^2-、HS^-；图11中570nm处的荧光发射峰强度数值由高到低排序为Blnk(空白)、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Sn²⁺、Mn²⁺、Cys、HSO^3-、S₂O₃ ^2-、HS^-。

干扰离子试验表明，检测体系中共存的各种离子对探针的pH值响应性能不产生干扰。

试验例4 MTT细胞毒性试验

本试验例进行实施例1的探针化合物对HeLa细胞的MTT毒性试验，结果如图12所示。HeLa细胞用含有不同浓度的探针(10μM，20μM，30μM)培养液孵育48小时后，计算HeLa细胞的存活百分比。结果表明，低浓度下，探针几乎无细胞毒性。应用实验中使用探针的浓度为5μM(培养液中探针化合物的浓度)，在该浓度下，探针没有细胞毒性，因而不会对实验结果产生干扰。

试验例5对细胞内pH值变化的响应性试验

向HeLa细胞培养液中加入5μM的探针溶液(加入方法：在1mL细胞培养液中加入5μL1mM的二甲基亚砜探针母液)和1μM的尼日利亚菌素(一种细胞膜的离子通道调节剂，加入方法：在1mL细胞培养液中加入5μL 500μM的二甲基亚砜尼日利亚菌素母液)，在激光共聚焦的405nm和514nm激发波长下，分别用绿色和橙色通道观测荧光发射情况，结果如图13所示。

图13中，在激光共聚焦的405nm和514nm激发波长下，分别用绿色和橙色通道观测荧光发射情况。a1、a2、a3分别为pH＝6的高钾缓冲液(6.6mmol/L K₂HPO₄，43.4mmol/LKH₂PO₄)中的绿色通道、橙色通道和明场图；b1、b2、b3分别为pH＝8的高钾缓冲液(47mmol/LK₂HPO₄，3mmol/L KH₂PO₄)中的绿色通道、橙色通道和明场图。由图可知，实施例1的荧光探针，在细胞内的pH值分别达到6和8时，分别发射绿色荧光(pH＝6)和橙色荧光(pH＝8)，表明本发明的荧光探针可以很好的反映肿瘤细胞内的酸碱变化。

试验例6线粒体定位试验

在细胞培养液中同时加入Mito-Tracker Green FM(一种商品化的线粒体绿色荧光探针)1μM、实施例1的探针5μM，培养15min后进行激光共聚焦试验，结果如图14所示。

图14中，a为Mito-Tracker Green FM的荧光图，b为实施例1的荧光探针在pH＝7.4下的荧光图，c为a、b的叠加图，d为明场图；结果表明，实施例1的荧光探针与Mito-TrackerGreen FM的荧光显色完全重合，表明该探针可以定位于细胞内的线粒体。

试验例7细胞自噬检测试验

本试验例使用实施例1的荧光探针检测HeLa细胞自噬过程。图15中，a、c为饥饿培养(无血清培养液培养)40h的HeLa细胞，b为正常培养的HeLa细胞；a中加入0.5mM的MDC(一种商用的细胞自噬检测染料)，b、c中加入5μM实施例1的探针溶液，在倒置荧光显微镜下观察荧光发射情况。

图a中出现亮绿色小点表明细胞内产生自噬泡；图b中没有出现亮绿色的荧光点，表明正常培养的细胞没有出现自噬泡；图c中可以观察到线粒体的橙色荧光中出存在绿色荧光点，表明发生了自噬。当细胞内的自噬泡被溶酶体所吞噬后，自噬泡内的pH值转变为酸性(pH<7)，由于本发明所述的探针在酸性条件下发射绿色荧光，因而探针在自噬泡的酸性作用下出现绿色荧光点。该实验表明，本发明所述的该探针可以检测肿瘤细胞发生线粒体自噬的过程。同时，本发明所述的探针在酸碱环境下，相应发射绿色和橙色两种荧光，相对于仅有单色发射光谱的商品化的自噬检测染料(MDC)，更具有优越性。该实验结果也表明，本发明的荧光探针具有开发成为检测细胞自噬的荧光探针的良好应用前景。

Claims (10)

1.一种比色比率型酸碱荧光探针，其特征在于，具有如式1、式2或式3所示的结构，

2.一种如权利要求1所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：在保护气氛下，对羟基苯乙醛和式4所示的化合物在溶剂中回流反应，即得；

3.如权利要求2所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，对羟基苯乙醛的制备包括以下步骤：将对羟基苯乙醇和三乙胺溶于溶剂中，加入催化剂进行反应，即得。

4.如权利要求2所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，式4所示的化合物的制备包括以下步骤：在保护气氛下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚和碘乙烷在70～80℃反应，即得。

5.如权利要求2所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇。

6.如权利要求2所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，对羟基苯乙醛和式4所示的化合物的摩尔比为1：1～2。

7.如权利要求2所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，回流反应时加入哌啶作为催化剂。

8.如权利要求7所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，每1mmol对羟基苯乙醛对应加入2～3滴哌啶。

9.如权利要求2～8任一项所述的比色比率型酸碱荧光探针的制备方法，其特征在于，回流反应的时间为4～6h。

10.一种如权利要求1所述的比色比率型酸碱荧光探针在检测肿瘤细胞自噬过程中的应用。