CN104086536A - 一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒。本发明提供的用于检测pH值的荧光探针的结构如式Ⅰ所示。本发明同时提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇；(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇与式Ⅵ所示三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得式Ⅰ所示化合物。本发明提供的用于检测pH值的试剂盒，包括式Ⅰ所示化合物和溶剂。本发明提供的荧光探针及其专用检测试剂盒对溶液pH具有良好响应，能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶体pH值的测定，具有操作简便，成本低，快速，灵敏，易于推广和应用等优点。

Description

一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒，属于化学分析、生物分析领域。
背景技术
溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，pH值约为3.8～5.0，为单层膜包被的囊状结构，直径约为0.025～0.8微米，内含多种水解酶。溶酶体的基本功能是对生物大分子等物质的消化与清除，并在维持细胞的正常代谢活动及防御微生物的侵染方面扮演着重要的角色。因此，检测溶酶体pH值及其随环境因素的改变均具有重要的意义。目前市场上具备标记溶酶体功能的探针有：美国探针公司的LysoTracker RedDND-99(Abs：577nm；Em：590nm)，LysoTracker Deep Red(Abs：577nm；Em：590nm)等；同时具备标记溶酶体和比率测定溶酶体pH值功能的探针有：美国探针公司的LysoSensorTM Yellow/Blue DND-160(PDMPO)(Abs：329nm、384nm；Em：440nm、540nm)，LysoSensorTMYellow/Blue dextran(Abs：335nm、381nm；Em：452nm、521nm)等。这些探针存在诸如分析波长短，或不能进行比率测定等弊端。而同时具备标记溶酶体和比率测定溶酶体pH值功能的近红外探针尚未见报道。
半菁类染料具有良好的稳定性，被广泛应用于生物分析中；而基于半菁类染料衍生的可选择性标记与检测溶酶体pH值的比率型近红外荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒，该荧光探针为半菁类染料，可对水溶液的pH值进行检测，同时可标记溶酶体和比率测定溶酶体的pH值。
本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物，
式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
Y的结构式如式Ⅱ所示，
式Ⅰ所示化合物具体可为式Ⅲ所示化合物(Lyso-pH)，
本发明提供的化合物以半菁类近红外荧光团为母体，包含一个靶向溶酶体的吗啉基团。
本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇；
(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇与式Ⅵ所示三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得式Ⅰ所示化合物；
式Ⅵ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
式Ⅰ
式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
Y的结构式如式Ⅱ所示：
上述制备方法，步骤(1)中，所述二羟基苯甲醛具体可为2,4-二羟基苯甲醛。
式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和所述吗啉的摩尔比可为1～5：1，具体可为1：1。
所述还原反应在还原剂作用下进行；所述还原剂与式Ⅳ所示二羟基苯甲醛的摩尔比为1～5：1，具体可为1.2：1；
所述还原剂可为H2、LiAlH4和NaBH4中任一种；
所述还原反应的反应温度可为0～50℃，具体可为25℃；反应时间可为10～200min，具体可为60min；
所述还原反应可在有机溶剂中进行；所述有机溶剂具体可为甲醇；
上述制备方法，步骤(2)中，所述碱与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比可为0.01～1：1，具体可为0.2：1；
所述碱为有机碱和无机碱中的至少一种；
所述有机碱可为三乙胺和吡啶中至少一种；所述无机碱可为碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中至少一种；
式Ⅵ所示三碳菁类染料与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比可为1：0.1～1，具体可为1：0.5；
式Ⅵ所示三碳菁类染料具体可为IR780碘化物，其结构式如式Ⅶ所示，
所述取代分解重排反应的反应温度可为40～100℃，具体可为50℃；反应时间为1～10h，具体可为4h；
所述取代分解重排反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂可为四氢呋喃、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中至少一种。
本发明进一步提供了一种检测pH值的试剂盒，包括式Ⅰ所示化合物和溶剂；
式Ⅰ所示化合物的浓度为0.01mM～100mM；
所述溶剂为水、乙醇和二甲基亚砜中任一种。
上述试剂盒中，式Ⅰ所示化合物的浓度具体可为1mM。
式Ⅰ所示化合物或上述试剂盒可应用于水溶液pH值的检测、溶酶体pH值的检测或溶酶体的标记。
所述水溶液pH值具体可通过以下步骤进行检测：
(1)向不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中加入相同浓度的式Ⅰ所示化合物，配制至少3种不同pH值的含有式Ⅰ所示化合物的标准溶液；
所示标准溶液的pH值为2～10；
所示标准溶液中式Ⅰ所示化合物的浓度为1nM～1μM；
(2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为635nm，以pH值为横坐标，以I670/I708或I708/I670为纵坐标，建立标准曲线；
I670表示所述标准溶液在波长为670nm处的荧光发射峰强度值；
I708表示所述标准溶液在波长为708nm处的荧光发射峰强度值；
(3)向待测样品中加入式Ⅰ所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式Ⅰ所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为635nm的激发光下的荧光发射光谱，即可根据标准曲线计算得出待测样品的pH值。
上述步骤(2)或步骤(3)中荧光强度可在荧光仪上进行检测。
本发明进一步提供了一种溶酶体pH值的检测方法，包括如下步骤：
(1)向载有式Ⅰ所示化合物的样品中分别加入至少3种不同pH值且均含有尼日利亚菌素钠的磷酸盐缓冲溶液；
所述pH值为4～6；
所述式Ⅰ所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所述样品为离体细胞；
(2)使用激光共聚焦显微镜或酶标仪进行荧光测试；
使用激光共聚焦显微镜进行荧光测试时，激发波长为635nm，选择收集通道为大于650nm小于750nm的任意两个波段，分别测定不同pH值的所述样品的荧光强度；
使用酶标仪测试时，激发波长为635nm，分别测定不同pH值的所述样品在波长为670nm和708nm处的荧光强度；
(3)使用激光共聚焦显微镜进行荧光测试时，计算两个收集波段的荧光发射强度的比值，以收集波段的荧光发射强度的比值为纵坐标，以pH值为横坐标，建立标准曲线；
使用酶标仪进行测试时，计算波长为670nm和708nm的荧光强度的比值I670/I708或I670/I708，以I670/I708或I670/I708为纵坐标，以pH值为横坐标，建立标准曲线；
(4)在与步骤(2)中相同的条件下，测量载有式Ⅰ所示化合物的溶酶体样品与步骤(2)所述波段相同的荧光发射强度比值，根据所述标准曲线即得出所述溶酶体样品的pH值。
上述检测方法选择离体细胞进行标准曲线的建立。
上述检测方法，步骤(1)中，式Ⅰ所示化合物的浓度具体可为100nM。
使用激光共聚焦显微镜进行测定时选择的两个波段可分别为650-680nm和690-720nm。
本发明具有如下特点：
1)本发明提供的荧光探针是蓝色的固体，其溶液对pH敏感，随着pH值的增加，肉眼可观察到其水溶液的颜色由蓝色变为绿色。
2)本发明提供的荧光探针显色反应速度快，将探针加入到不同pH值的水溶液中，摇匀，5秒内即可显示出均匀的颜色。
3)探针对pH的响应呈线性关系，可以用于pH的精确测量。
4)探针的发射波长约为670nm和708nm，属于近红外光谱区域。
5)探针的生物相容性与细胞膜渗透性能良好，在较短时间(5分钟)内即可实现对细胞溶酶体的标记。
6)利用探针对pH的比率光学响应性质，可以测量溶酶体的pH值。
本发明提供的半菁类染料的比率型pH探针及其试剂盒对溶液pH具有良好响应，能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶体pH值的测定，具有操作简便，成本低，快速，灵敏，易于推广和应用等优点。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针Lyso-pH的合成路线。
图2为实施例2制备的Lyso-pH试剂盒对不同pH水溶液的颜色响应图。
图3为实施例2制备的Lyso-pH试剂盒对不同pH水溶液的荧光响应图。
图4为实施例2制备的Lyso-pH试剂盒在波长为670nm和708nm的荧光发射强度的比值I670/I708与pH的关系曲线。
图5为实施例1制备的Lyso-pH与美国探针公司的LysoTracker Red DND-99对细胞成像的溶酶体共定位图，其中，图5(a)为LysoTracker Red DND-99对溶酶体的定位图；(b)为Lyso-pH对溶酶体的定位图；(c)为两种染料染色叠加效果图；(d)为细胞的形貌图。
图6为I650-680/I690-720的值与细胞溶酶体pH值的关系曲线，其中，I650-680为波段为650-680nM的荧光强度，I690-720为波段为690-720nm的荧光强度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、荧光探针Lyso-pH的制备
步骤a)：将276mg2,4-二羟基苯甲醛和174mg吗啉溶解于30mL CH3OH中，冰浴下缓缓加入91mg NaBH4，在25℃下搅拌1h后，加水淬灭，用2M盐酸调节溶液pH至6，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥浓缩，将得到的粗产品用柱层析分离(硅胶G，200～300目)，CH2Cl2/MeOH(v/v，20：1)作洗脱剂提纯得到中间体4-(吗啉甲基)苯基1,3-二醇67mg(产率：16％)。产品为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3):δ6.83(d,J＝8.0Hz,1H),6.34(d,J＝2.4Hz,1H),6.29(dd,J＝2.4Hz,1H),3.75(s,4H),3.64(s,2H),2.56(s,4H)；13C NMR(400MHz,CDCl3):δ158.5,157.1,129.7,112.8,106.7,103.5,66.9,61.4,52.8.HR-ESI-MS(m/z):[M]calcd.forC11H15NO3,208.0969；found,208.0975。
步骤b)：将制得的4-(吗啉甲基)苯基1,3-二醇(67mg,0.32mmol)与Et3N(5mg,0.064mmol)溶于20mL DMF中，在N2保护下搅拌10min后加入IR780(106mg,0.16mmol)。然后升温至50℃搅拌反应4h。冷却后，将此反应液减压蒸干，将得到的粗产品用柱层析分离(硅胶G，200～300目)，CH2Cl2/MeOH(v/v,30：1)作洗脱剂提纯得到最后产物Lyso-pH(25mg,24％)，产品为蓝色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(d,J＝14.4Hz,1H),7.41-7.38(m,4H),7.29-7.28(m,2H),7.20(s,1H),6.79(s,1H),6.35(d,J＝14.4Hz,1H),4.31(t,J＝6.4Hz,2H),3.86(s,2H),3.74(s,4H),2.69-2.64(m,8H),1.93-1.88(m,4H),1.72(s,6H),1.04(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(400MHz,CDCl3):δ176.5,162.6,154.8,145.2,141.8,141.7,135.6,129.3,127.0,122.6,115.2,112.4,103.0,66.2,59.6,52.6,52.3,50.5,47.3,29.8,29.1,28.6,24.7,21.4,20.6,14.3,11.9.HR-ESI-MS(m/z):[M]+calcd.for C33H39N2O3,511.2955；found,511.2952.
实施例2、式Ⅱ所示化合物的光谱性质
称取6.3mg Lyso-pH，溶于10mL DMSO，配成母液(1mM)，即得到Lyso-pH试剂盒。将50μL的此母液滴加到0.2M不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中，并用相应的磷酸盐缓冲溶液定容到5mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以635nm去激发，发射峰的强度比为I670/I708或I708/I670；激发和发射的狭缝宽度为10nm，电压为700V。
图2为Lyso-pH试剂盒对不同pH值的水溶液的颜色响应图，由图2可知，随着pH值的增大，肉眼可观察到溶液由蓝色逐渐变为绿色，证明本发明试剂盒对pH具有直观的显色响应。
图3为Lyso-pH试剂盒对不同pH值的水溶液的荧光响应图，由图3可知，随着pH值的增大，波长为708nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，波长为670nm处的发射峰的荧光强度逐渐减小，证明本发明试剂盒对pH具有灵敏的比率响应。
图4为Lyso-pH试剂盒荧光发射比值I670/I708与pH值的关系曲线，由图4可知，随着水溶液pH值的增大，荧光发射比值I670/I708逐渐减小。在pH值为4.0～6.0的范围内，发射峰的荧光强度比值I670/I708与水溶液pH值呈线性关系。证明本发明试剂盒可以对pH进行准确测量。
实施例3、溶酶体的标记和溶酶体pH值的测定
1)在37℃和5％(v/v)CO2条件下，用含有10％(v/v)FBS(胎牛血清)、100U/mL盘尼西林、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用之前用PBS缓冲液清洗。
2)在HeLa细胞中加入PBS(pH7.4)，再加入LysoTracker Red DND-99(50nM)孵育5min,用PBS洗三遍后，加入Lyso-pH(50nM)孵育5min，用PBS洗三遍后，进行共聚焦荧光成像共定位。其中，LysoTracker Red DND-99的激发波长为559nm，收集波段为570-650nm；Lyso-pH的激发波长为635nm，收集波段为650nm-750nm。
图5为实施例1制备得到的荧光探针Lyso-pH与美国探针公司的LysoTracker RedDND-99对细胞成像的溶酶体共定位图，由图5可知，商品化的溶酶体探针DND-99与Lyso-pH的共定位系数为90％，叠加图呈现出很好的叠加效果，说明Lyso-pH能够很好的靶向溶酶体。
3)测定溶酶体pH值之前，需要对Lyso-pH进行细胞内pH进行校正并加入相同法荧光探针。具体操作为：在HeLa细胞中加入PBS(pH7.4)，再加入Lyso-pH，浓度为100nM，孵育5min后，用PBS清洗。
向载有Lyso-pH的细胞中，分别加入pH值为4、4.5、5、5.5和6的磷酸盐缓冲溶液(含有尼日利亚菌素钠10μM)，共同孵育20min，在激光共聚焦显微镜上进行成像。设定激发光的波长为635nm，收集两个波段650-680nm与690-720nm的光强度，计算比值R＝I650-680/I690-720建立标准曲线，如图6所示。
由图6可知，随着细胞中pH值由4增大到6，荧光发射峰比值R＝I650-680/I690-720逐渐减小。在pH值为4.0～6.0的范围内，发射峰的荧光强度比值R与水溶液pH值呈线性关系。证明本发明试剂盒可以在细胞中对pH进行准确测量。
测试经校正后的HeLa细胞在635nm的激发光下的荧光发射光谱，根据其I650-680/I690-720的值和标准曲线，得到该细胞的pH值为4.6±0.1。
最后应说明的是，上述实施例仅举出以式Ⅱ化合物为荧光试剂，其余荧光试剂由于结构与性质相近，其浓度，实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改与变更。

Claims (8)

1.式Ⅰ所示化合物，
式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
Y的结构式如式Ⅱ所示：
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：其结构式如式Ⅲ，
3.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇；
(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇与式Ⅵ所示三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得式Ⅰ所示化合物；
式Ⅵ
式Ⅵ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；
Y的结构式如式Ⅱ所示：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和所述吗啉的摩尔比为1～5：1；
所述还原反应在还原剂作用下进行；所述还原剂与式Ⅳ所示二羟基苯甲醛的摩尔比为1～5：1；
所述还原剂为H2、LiAlH4和NaBH4中任一种；
所述还原反应的反应温度可为0～50℃；反应时间可为10～200min；
所述还原反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为甲醇。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比为0.01～1：1；
所述碱为有机碱和无机碱中的至少一种；
所述有机碱为三乙胺和吡啶中至少一种；所述无机碱为碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中至少一种；
式Ⅵ所示三碳菁类染料与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比为1：0.1～1；
所述取代分解重排反应的反应温度为40～100℃，；反应时间为1～10h；
所述取代分解重排反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中至少一种。
6.一种检测pH值的试剂盒，包括式Ⅰ所示化合物和溶剂；
式Ⅰ所示化合物的浓度为0.01mM～100mM；
所述溶剂为水、乙醇和二甲基亚砜中任一种。
7.式Ⅰ所示化合物或权利要求6所述试剂盒在检测水溶液pH值、检测溶酶体pH值或标记溶酶体中的应用。
8.一种溶酶体pH值的检测方法，包括如下步骤：
(1)向载有式Ⅰ所示化合物的样品中分别加入至少3种不同pH值且均含有尼日利亚菌素钠的磷酸盐缓冲溶液；
所述pH值为4～6；
所述式Ⅰ所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所述样品为离体细胞；
(2)使用激光共聚焦显微镜或酶标仪进行荧光测试；
使用激光共聚焦显微镜进行荧光测试时，激发波长为635nm，选择收集通道为大于650nm小于750nm的任意两个波段，分别测定不同pH值的所述样品的荧光强度；
使用酶标仪测试时，激发波长为635nm，分别测定不同pH值的所述样品在波长为670nm和708nm处的荧光强度；
(3)使用激光共聚焦显微镜进行荧光测试时，计算两个收集波段的荧光发射强度的比值，以收集波段的荧光发射强度的比值为纵坐标，以pH值为横坐标，建立标准曲线；
使用酶标仪进行测试时，计算波长为670nm和708nm的荧光强度的比值I670/I708或I670/I708，以I670/I708或I670/I708为纵坐标，以pH值为横坐标，建立标准曲线；
(4)在与步骤(2)中相同的条件下，测量载有式Ⅰ所示化合物的溶酶体样品与步骤(2)所述波段相同的荧光发射强度比值，根据所述标准曲线即得出所述溶酶体样品的pH值。
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