CN105131937A - 一种pH荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种pH荧光探针，化学名称为：碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，其合成方法为：将碘化1,2-二甲基吡啶盐和香草醛按摩尔比1:1-1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流条件下反应0.5-1小时，得到碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，所述香草醛与正丁醇溶液的质量体积比为0.304:20-0.456:25；所述香草醛与所述哌嗪的质量比为0.456:0.02-0.316:0.01。本发明化合物在不同PH值时溶液颜色变化非常明显，颜色有绿色变为红色，可通过溶液的颜色变化定性判断环境的pH值，是一种较好的可视化PH荧光探针。

Description

一种pH荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种pH荧光探针及其应用。

背景技术

pH是衡量溶液酸碱性的尺度，许多细胞生物化学过程如细胞生长等过程均会涉及生物分子的质子化和去质子化过程，并伴随着细胞微环境pH的改变。人体细胞内pH值与细胞、酶和组织的许多重要生理过程如细胞增殖和凋亡、药物耐药性、离子运输、内吞作用和肌肉收缩等活动密切相关。通常细胞中存在两个pH值范围，一种是近中性，如细胞液中的pH值范围为6.8-7.4；还有一种是酸性，如溶酶体的pH值范围为4.5-5.5，内涵体的pH值范围为5.4-6.2称为酸性细胞器。不正常的pH值可能导致心肺和神经系统的疾病，如阿尔茨海默综合症、癌症，严重的甚至可能危及生命。因此，精确并快速地检测pH对于细胞分析和诊断具有重要意义。

监测细胞内pH值的动态变化对于理解细胞内许多生理功能的规则机制有着重要的作用。相较于微电极、NMR和吸收光谱等pH测量方法，荧光光谱检测技术对于在时空分布上检测pH变化具有独特的优势。此外，荧光技术具有操作简单、响应快速、高信噪比、高灵敏度以及大多数情况下对细胞无损伤等优点。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。目前报道的许多pH荧光探针的Stokes位移较小，在造影时容易受到激发光的干扰。因此，具有较大Stokes位移的pH荧光探针在生物和化学等方面都具有极大的潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种pH荧光探针及其应用，其具有较大光谱移动。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种pH荧光探针，其化学名称为：碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，其化学结构式如下：

上述pH荧光探针的合成方法：将碘化1,2-二甲基吡啶盐和香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)按摩尔比1:2-1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流条件(加热至90～100℃回流)下反应30-60min，得到碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，所述香草醛与正丁醇溶液的质量体积比为0.304:20-0.456:25；所述香草醛与所述哌嗪的质量比为0.456:0.02-0.316:0.01。

上述pH荧光探针作为检测细胞内pH的指示剂。

上述pH荧光探针在细胞标记中的应用。

上述pH荧光探针对H⁺有荧光选择性：在PBS缓冲溶液(pH7.4)中，探针分子的浓度为10μM，分别加入H⁺，等当量的Mn²⁺，Ni²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Ag⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，1000倍的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺，测定荧光强度的变化，本发明所述碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐对H⁺有独特的荧光选择性。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种较大光谱移动的吡啶盐类pH荧光探针，实验证明本发明在pH4.37-10.30溶液中发生质子化或去质子化反应，其荧光强度产生相应变化。溶液颜色由绿色变为红色。

在pH6.5到8.5的变化范围内荧光强度变化非常明显，并且常见金属离子的存在不会对其pH响应性能造成干扰，适用于胞内中性或弱碱性环境pH检测。本化合物具有较大的Stokes位移(149nm)，可以更好地降低激发在造影中的干扰。实验证实本发明化合物在乙醇-水(1:9,v/v)溶液中对H⁺有独特的荧光选择性、较高的抗其他离子干扰能力，且荧光光谱具有较大的Stokes位移，在细胞生物学、化学等领域具有巨大的应用前景。

本发明化合物在不同PH值时溶液颜色变化非常明显，颜色由绿色变为红色，可通过溶液的颜色变化定性判断环境的pH值，是一种较好的可视化PH荧光探针，具有操作简单，灵敏度高及对细胞实时原位地观测pH变化等优点。

附图说明

图1为本发明化合物(10μM)的乙醇-水(1:9，v/v)溶液进行H⁺荧光滴定图；图中Intensity为强度，Wavelength为波长；

图2为本发明化合物(10μM)的乙醇-水(1:9，v/v)溶液中，加入不同体积的HCl和NaOH水溶液调节pH(4.37-10.30)，六个小瓶从左到右pH分别为4.37、6.03、6.89、7.90、9.05、10.30，六个小瓶从左到右颜色变化为：绿色、黄色、橙色、橙红色，红色，深红色；

图3为本发明化合物(10μM)的乙醇-水(1:9，v/v)溶液中加入其他不同离子后的荧光强度变化柱状图。

具体实施方式

本发明化合物的合成方案如下式所示：

实施例1

一种pH荧光探针，其化学名称为：碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，其化学结构式如下：

上述化合物的合成步骤如下：

称取0.235g(1.0mmol)碘化1,2-二甲基吡啶盐和0.316g香草醛于50ml圆底烧瓶中，加入20ml正丁醇，加0.01g哌嗪，混合溶液加热至回流，反应45min。TLC检测反应完成后，冷却至室温，有大量固体析出，减压抽滤，正丁醇重结晶，得0.215g黄色固体，产率58.3％。

熔点测定：mp：258-261℃

红外光谱测定：TR(KBr，cm^-1)3439，3103，1634，1618，1594，1566，1522，1247，1128

核磁共振氢谱测定：¹HNMR(400MH_Z，DMSO)：δ9.77(s，1H)，δ8.88(d，J＝6.4H_Z，1H)，δ8.49(d，J＝7.6H_Z，1H)，δ8.43(m，1H)，δ7.90(d，J＝16H_Z，1H)，δ7.82(m，1H)，δ7.41(d，J＝1.6H_Z，1H)，δ7.40(d，J＝16H_Z，1H)，δ7.30(dd，J＝1.6H_Z，8.4H_Z，1H)，δ6.88(d，J＝8.0H_Z，1H)，δ4.39(s，3H)，δ3.90(s，3H)

本发明化合物(10μM)的乙醇-水(1:9，v/v)溶液中，加入不同体积的HCl和NaOH水溶液调节pH(4.37-10.30)，pH分别为4.37，4.89，4.92，5.52，5.64，6.23，7.0，7.08，7.46，8.16，8.36，8.7，8.86，8.95，9.1，9.64，9.71，9.95，10.30；进行H⁺荧光滴定测试，如图1所示。激发波长λex＝375nm，狭缝宽度激发和发射均为10nm。由图1表明：在pH6.5到8.5的变化范围内荧光强度变化非常明显，可适用于胞内中性或弱碱性环境pH检测。且本化合物具有较大的Stokes位移，酸性条件下最大发射峰为510nm，位移值为135nm；碱性条件下最大发射峰为524nm，位移值为149nm。可以更好地降低激发在造影中的干扰。

本发明化合物(10μM)的乙醇-水(1:9，v/v)溶液中，加入不同体积的HCl和NaOH水溶液调节pH(4.37-10.30)，pH分别为4.37,6.03,6.89,7.90,9.05,10.30，溶液颜色变化分别为绿色、黄色、橙色、橙红色，红色，红色，如图2所示。由图2可以看出当溶液pH有酸性到碱性时，颜色变化为绿色、黄色、橙黄色、红色，颜色差距明显，肉眼可视。

吡啶盐类pH荧光探针的应用，本发明化合物对H⁺有荧光选择性：在PBS缓冲溶液(pH7.4)中，探针分子的浓度为10μM，分别加入H⁺等当量的Mn²⁺，Ni²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，Ag⁺，Hg²⁺，Ba²⁺，1000倍(即10mM)的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺，测定荧光强度变化发现：本发明化合物对H⁺的荧光选择性，对其它金属离子有较强的抗干扰能力，如图3所示，过渡金属离子的存在不会对本化合物的荧光产生明显的影响，因此不会对其pH荧光响应性能产生干扰。另外细胞中具有较高浓度的K+、Na+、Ca²⁺和Mg²⁺等碱金属和碱土金属离子，也不会对本化合物的荧光产生明显的改变。显然本化合物具有良好的pH响应专一性，符合应用到细胞内检测pH变化的要求。

实施例2

称取0.235g碘化1,2-二甲基吡啶盐和0.304g香草醛于50ml圆底烧瓶中，加入20ml正丁醇，加0.01g哌嗪，混合溶液加热至回流，反应30min。TLC检测反应完成后，冷却至室温，有大量固体析出，减压抽滤，正丁醇重结晶，得0.214g黄色固体。产率58.0％。

产物的熔点测定，红外光谱测定，核磁共振氢谱测定都同实施例1。

实施例3

称取0.235g碘化1,2-二甲基吡啶盐和0.456g香草醛于50ml圆底烧瓶中，加入25ml正丁醇，加0.02g哌嗪，混合溶液加热至回流，反应60min。TLC检测反应完成后，冷却至室温，有大量固体析出，减压抽滤，正丁醇重结晶，得0.215g黄色固体。产率58.3％。

产物的熔点测定，红外光谱测定，核磁共振氢谱测定都同实施例1。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.一种pH荧光探针，其特征是，化学名称为：碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，其化学结构式如下：

2.如权利要求1所述的探针的合成方法，其特征是，将碘化1,2-二甲基吡啶盐和香草醛按摩尔比1:1-1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流条件下反应30-60min，得到碘化1-甲基-2-(4-羟基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶盐，所述香草醛与正丁醇溶液的质量体积比为0.304:20-0.456:25；所述香草醛与所述哌嗪的质量比为0.456:0.02-0.316:0.01。

3.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述回流在加热至90～100℃进行。

4.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述香草醛与正丁醇溶液的质量体积比为0.136:20。

5.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，在回流条件下反应45min。

6.权利要求1所述的探针在检测细胞内pH值的应用。

7.权利要求1所述的探针在细胞标记中的应用。