CN103012418A - 一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针，其结构如式（I）所示。本发明还公开了所述探针在活细胞内监测pH值变化及特异性标记溶酶体的应用。本发明的探针在中性和碱性条件下不发荧光，在pH值小于7后，荧光强度随pH值的降低迅速增强，在pH约为4.4时强度达到最大值，其荧光检测的敏感pH范围为6.7-4.4，并在4.7-5.7之间荧光强度与pH呈线性关系，且在酸性条件下对各种金属离子有很好的抗干扰能力，非常适合在复杂的活细胞内环境下进行pH值实时监测，特别是特异性标记溶酶体和监测溶酶体内pH值变化。

Description

一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针及应用

技术领域

本发明涉及一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针及其作为活细胞内pH荧光探针的应用。 

背景技术

细胞中如细胞新陈代谢、信号传导、细胞生长、凋亡和自噬等重要的生理过程都与pH值紧密相关。细胞中pH值的微小变化就会导致细胞功能紊乱，影响机体生理功能从而导致多种疾病，如癌症、阿尔茨海默氏病等的发生。细胞中的溶酶体具有弱酸性环境(pH4.5–5.5)，其中包含大量的水解酶和分泌蛋白，具有重要的功能。因此，监测活细胞中pH值的变化对于研究细胞功能及生理和病理过程是必须的。 

罗丹明B具有量子产率高、摩尔消光系数大、光稳定性好、背景干扰少等优点，其衍生物被广泛应用于“关-开”型金属离子荧光探针。罗丹明B类探针通常包含一个螺内酰胺或螺内酯结构。在中性及碱性溶液中，螺环结构保持不变，溶液为无色且不发荧光；在酸性溶液中，螺环结构打开，溶液呈现红色并发出强荧光。这些性质使罗丹明B衍生物非常适合用来检测酸性pH。尽管目前已有部分报道的罗丹明B类pH探针用于监测溶酶体中的pH值，但这些探针往往会引起“碱性效应”，即长时间孵化后会引起溶酶体内的pH值升高，影响监测结果。因此设计合成新型罗丹明B类pH荧光探针具有重要的意义。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针及其作为活细胞内pH荧光探针的应用。 

本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针，其结构如式（I）所示： 

上述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针的合成方法，步骤如下：由罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物(1)与2-氨基-5-苯基-1,3,4-噁二唑(2)，以碳酸钾为碱，在乙腈中回流2±0.5小时，经柱层析纯化即得到如式(I)所示的含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针(3)，产率82.7%。 上述合成路线反应式如下： 

本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针在活细胞内监测pH值变化及特异性标记溶酶体的应用。 

其中：所述活细胞优选Hela细胞或HUVEC细胞。 

本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针对H⁺响应迅速，有很高的灵敏度和选择性，并且具有良好的可逆性。其作为活细胞内的pH荧光探针可以有效监测活细胞内pH值变化及特异性标记溶酶体和监测溶酶体内pH值变化。 

具体实验验证：配制本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针（以下简称：探针3）在梯度pH值（3.72～7.21）下的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl），通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试其对不同pH值的响应能力。 

在酸性和弱碱性条件下向探针3的溶液中分别定量加入NaNO₃,KNO₃,Mg(NO₃)₂·6H₂O,Al(NO₃)₃·9H₂O,Ca(NO₃)₂·4H₂O,Fe(NO₃)₃·9H₂O,Co(NO₃)₂·6H₂O,Ni(NO₃)₂·6H₂O,Cu(NO₃)₂·3H₂O,Zn(NO₃)₂·6H₂O,AgNO₃,Cd(NO₃)₂·4H₂O,Pb(NO₃)₂,HgCl₂的水溶液，测试其抗干扰能力。 

使用不同浓度的上述探针3加入到Hela细胞，分别在不同孵化时间进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。 

使用上述探针3与商品化的溶酶体探针

Green DND-189对活Hela细胞共染色，通过荧光成像进行染色定位。 

使用上述探针3与不同浓度的巴弗洛霉素A1共同培养Hela细胞或HUVEC细胞并进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。 

使用上述探针3与不同浓度的氯奎宁共同培养Hela细胞或HUVEC细胞并进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。 

使用不同浓度的巴弗洛霉素A1分别与上述探针3或细胞染色剂lysotracker RedDND-99共同培养Hela细胞并进行荧光成像，观察细胞内荧光强度变化。 

结果见图1～10。 

实验结果表明：本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针可以快速响应、高选择性、高灵敏度检测酸性pH值并避免“碱性效应”。本发明的pH荧光探 针本身为螺环结构，其溶液为无色，不发荧光，随着溶液pH值的降低，螺环打开，溶液由无色变为红色并发出荧光，其荧光强度随pH值的降低逐渐增强。当pH值从6.7变化到4.4后，其荧光强度大约增强46倍，pK_a值为5.05，且在pH范围4.7-5.7之间荧光强度与pH值呈线性相关，有利于显微镜测量。探针在酸性溶液中荧光强度能够迅速达到最大值并保持稳定，适合实时监测pH值变化。在200μM金属离子（其中Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺达到mM级浓度）存在下，本发明的探针对pH的响应能力不受影响，具有很好的抗干扰能力；其荧光强度在酸性条件下能迅速达到最大并保持稳定，说明本发明探针非常适合在复杂的活细胞内环境下进行pH值实时监测。细胞内共定位实验及溶酶体内pH调节实验证实：本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针使用浓度低，具有良好的膜渗透性，对细胞没有毒副作用，可以特异性标记溶酶体，并且能够灵敏地监测到溶酶体内pH值的变化。预示本发明所述探针在细胞成像及监测溶酶体内pH值变化方面将具有重要的应用价值。 

附图说明

图1为探针3（10μM）在梯度pH值（3.72～7.21）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1MNaCl）中的颜色变化。 

图2为探针3（10μM）在梯度pH值（3.72～7.21）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl）中的紫外可见吸收光谱。 

图3（a）为探针3（10μM）在梯度pH值（3.72～7.20）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1MNaCl）中的荧光发射光谱（激发波长（λ_ex），565nm）；（b）为603nm处荧光强度随pH值变化的曲线。 

图4为在pH=4.74时，向探针3（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1MNaCl）中分别加入各种金属离子后，在603nm处的荧光强度变化。（激发波长（λ_ex），565nm；Al³⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Ag⁺的浓度均为200μM，Na⁺和K⁺均为10mM，Ca²⁺和Mg²⁺均为5mM） 

图5为在pH=7.21时，向探针3（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl）中分别加入各种金属离子后在603nm处的荧光强度变化。（激发波长（λ_ex），565nm；Al³⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Ag⁺的浓度均为200μM，Na⁺和K⁺均为10mM，Ca²⁺和Mg²⁺均为5mM） 

图6为在37℃使用梯度浓度（1～10μM）的探针3分别培养Hela细胞，在培养3、6、9、12小时的活细胞荧光显微成像图。 

图7为使用6μM探针3和1μM

Green DND-189对Hela细胞共染色后的荧光显微成像图。（a）为Green的绿色发射荧光成像图；（b）为探针3的红色发射荧光成像图；（c）为（a）和（b）的叠加图，黄色区域为共定位区域。 

图8（a）为在37℃使用3μM探针3和0~40nM巴弗洛霉素A1培养Hela细胞12小时后的活细胞荧光显微成像图；（b）为在37℃使用3μM探针3和0~40nM巴弗洛霉素A1培养HUVEC细胞12小时后的活细胞荧光显微成像图。 

图9（a）为在37℃使用3μM探针3和0~32μM氯奎宁培养Hela细胞12小时后的活细胞荧光显微成像图；（b）为在37℃使用3μM探针3和0~32μM氯奎宁培养HUVEC细胞12小时后的活细胞荧光显微成像图。 

图10为在37℃使用3μM探针3或100nM lysotracker Red DND-99和0~40nM巴弗洛霉素A1共同培养Hela细胞后的细胞荧光显微成像图。 

具体实施方式

实施例1： 

本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针的合成 

将320mg（0.5mmol）化合物1和80mg（0.5mmol）化合物2溶于10mL干燥的乙腈，加入104mg（0.75mmol）碳酸钾，混合液加热至回流后反应2小时。冷却后滤除碳酸钾，将滤液减压浓缩得粗品。通过硅胶柱层析（2:1，石油醚-乙酸乙酯）纯化得到265mg浅黄色化合物3，即含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针，收率：82.7%，熔点：133-135℃。 

上述合成路线反应式如下 

红外光谱测定：IR(KBr)ν:3406(N-H),1615(C=O)cm^-1。 

核磁共振氢谱测定：¹HNMR(d₆-DMSO,400MHz))δ(ppm):1.10(t,12H,J=6.9Hz,CH₃),3.04-3.11(m,2H,CH₂),3.19-3.25(m,2H,CH₂),3.34(q,8H,J=6.9Hz,CH₂),4.67(t,1H,J=5.6Hz,NH),6.36(d,2H,J=9.5Hz,Xanthene-H),6.40-6.44(m,4H,Xanthene-H),7.09(d,1H,J=7.7Hz,Ar-H),7.44(t,1H,J=7.5Hz,Ar-H),7.53(t,1H,J=7.5Hz,Ar-H),7.55-7.61(m,3H,Ar-H),7.93(d,1H,J=7.7Hz,Ar-H),7.95-8.01(m,2H,Ar-H)。 

高分辨质谱测定：HRMS calcd for[M+H]⁺C₃₈H₄₁N₆O₃:629.3240,found 629.3214. 

实施例2 

分别配制10mL梯度pH值（3.72～7.21）下的探针3（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl），分别 进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试，并作出603nm处的荧光强度随pH值变化的曲线。 

结果显示探针3对pH值有很好的响应，pH值从6.7变化到4.4后，其荧光强度大约增强46倍，具有很好的荧光增强效应，可以提高信号的灵敏度和准确性。（图2、3） 

实施例3 

向pH值为4.74的探针3（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl）中分别加入各种金属离子后，测试其荧光强度变化。（激发波长（λ_ex），565nm；Al³⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Ag⁺的浓度均为200μM，Na⁺和K⁺均为10mM，Ca²⁺和Mg²⁺均为5mM） 

向pH值为7.21的探针3（10μM）的溶液（乙醇/Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,体积比，0.1M NaCl）中分别加入各种金属离子后，测试其荧光强度变化。（激发波长（λ_ex），565nm；Al³⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Ag⁺的浓度均为200μM，Na⁺和K⁺均为10mM，Ca²⁺和Mg²⁺均为5mM） 

结果表明探针3对pH值的响应不受各种金属离子的影响，具有很好的抗干扰能力。（图4、5） 

实施例4 

37℃下，对加入1～10μM探针3的Hela细胞培养3–12小时后进行荧光显微成像，结果显示探针3具有很好的膜渗透性，可以进入细胞并在细胞中发出红色荧光，细胞中的荧光强度随探针浓度的增加和培养时间的延长而增强。（图6） 

实施例5 

37℃下，使用6μM的探针3和1μM的溶酶体探针

Green对活Hela细胞共染色，分别得到探针3的红色荧光照片和

Green的绿色荧光照片，将两个照片叠加，红色和绿色重叠区域显示黄色。结果表明两张照片染色区域能够很好地重合，即证实本发明所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针能够特异性标记溶酶体。（图7） 

实施例6 

37℃下，使用3μM的探针3和0~40nM的巴弗洛霉素A1共同培养Hela细胞或HUVEC细胞12小时，细胞溶酶体内的pH值由于巴弗洛霉素A1的加入而升高，从而导致细胞内的荧光强度明显减弱。（图8） 

实施例7 

37℃下，使用3μM的探针3和0~32μM的氯奎宁共同培养Hela细胞或HUVEC细胞12小时，细胞溶酶体内的pH值由于氯奎宁的加入而升高，从而导致细胞内的荧光强度明显减弱。（图9） 

实施例8 

37℃下，使用3μM的探针3和100nM的lysotracker Red DND-99分别与0~40nM的巴弗洛霉素A1共同培养Hela细胞，结果显示：当加入40nM的巴弗洛霉素A1时使用lysotracker Red DND-99培养的Hela细胞内荧光强度才发生明显变化，而使用3μM的探针3培养的Hela细胞在加入5nM的巴弗洛霉素A1时荧光强度就明显减弱，说明探针3能够更灵敏地检测到活细胞溶酶体内pH值的微小变化。（图10）。 

Claims (3)

1.一种含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针，其结构如式（I）所示：

2.权利要求1所述含1,3,4-噁二唑结构单元的罗丹明B类pH荧光探针在活细胞内监测pH值变化及特异性标记溶酶体的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述活细胞选Hela细胞或HUVEC细胞。

Images