CN107235985B - 一种检测二价铜离子的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及精细化工领域中Cu2+检测用荧光分子探针，具体为一种基于罗丹明染料的Cu2+荧光分子探针的的制备及其在生物细胞成像和水体系铜离子检测方面的应用。所述化合物Ⅰ的制备方法，包括如下步骤：在反应容器中，加入1份(E)‑2‑((3',6'‑双(二乙氨基)‑3‑氧螺[异吲哚‑1,9'‑占吨]‑2‑烯)亚胺)乙醛和6份水合肼，加热搅拌，反应完成后，旋转蒸发除掉乙醇，再分别加入50份二氯甲烷以及150份饱和氯化钠溶液；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，粗产物以柱色谱分离，得到化合物Ⅰ。本发明所提供的制备方法，反应条件温和，合成步骤少，产物产率高，原料价廉易得。

Description

一种检测二价铜离子的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及精细化工领域中Cu2+检测用荧光分子探针，具体为一种基于罗丹明染料的Cu2+荧光分子探针的的制备及其在生物细胞成像和水体系铜离子检测方面的应用。
背景技术
铜是生物体中基本的微量元素之一，在不同的生理过程中铜作为催化辅助因子起着很重要作用。 但是，在生物体内摄入过量的铜也会产生毒性，能引起Wilson’s、Menkes和Alzheimer’s等神经性疾病。由于人类长期大量对铜的过度使用，铜也成为环境中的一种重要污染物。美国环保局（EPA）规定饮用水中铜离子的最高限为20 μmol·L-1。由于铜对人类的生存和发展具有重要意义，所以在化学反应和生命活动中对铜离子的检测是非常有意义的。鉴于其对生命和环境的重要性，过去几年中科学家们一直致力于采用荧光探针实现对铜离子在生物和环境系统中检测的研究。
近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测金属离子污染的重要手段。荧光增强传感材料可减少检测错误，对复杂体系检测准确，可同时用多种检测物对不同分析物进行检测。罗丹明类染料由于具有摩尔吸光率大、水溶性好、荧光量子产率高和发射波长较长等特点，在铜离子识别的领域得到越来越广泛的重视。
发明内容
针对现有技术中检测铜离子的荧光分子探针存在检测灵敏度低、选择性差和对pH值敏感等问题，本发明主要目的在于提供一种可检测二价铜离子且灵敏度高、选择性好和对pH值不敏感的荧光分子探针；另一目的是提供该荧光分子探针的制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种化合物Ⅰ，该化合物为3',6'-双(二乙氨基)-2-（（肼叉亚乙基）氨螺[异吲哚-1,9'-占吨]-3-酮，其化学式为：C30H34N6O2，具有如下结构式：
。
本发明进一步提供了另外一种化合物即化合物Ⅱ，该化合物为(E)-2-((3',6'-双(二乙氨基)-3-氧螺[异吲哚-1,9'-占吨]-2-烯)亚胺)乙醛，具有如下结构式：
。
本发明进一步提供了所述化合物Ⅰ的制备方法，包括如下步骤：
在反应容器中，加入1份(E)-2-((3',6'-双(二乙氨基)-3-氧螺[异吲哚-1,9'-占吨]-2-烯)亚胺)乙醛和无水乙醇以及6份水合肼，加热搅拌回流反应，反应完成后，旋转蒸发除掉乙醇，再分别加入50 份二氯甲烷以及150 份饱和氯化钠溶液；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，粗产物以柱色谱分离，得到化合物Ⅰ。
在化合物Ⅰ的制备过程中，加热搅拌回流反应过程的反应温度为30～60℃，优选为40℃；加热搅拌回流反应过程的反应时间为1～3h，优选为1.5h。所述柱色谱采用体积比为1:5的乙酸乙酯和石油醚。
本发明再进一步提供了一种化合物Ⅲ，该化合物为2-氨基-3',6'-双(二乙氨基)螺[异吲哚-1,9'-占吨]-3-酮，具有如下结构式：
。
本发明还提供了所述的化合物Ⅱ的制备方法，包括如下步骤：
在反应容器中，加入1份所述的化合物Ⅲ、30 份乙醇与3份乙二醛，加热搅拌，反应完成后，旋转蒸发除掉乙醇，再分别加入50 份二氯甲烷以及150 份饱和氯化钠溶液；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，以柱色谱分离，得化合物Ⅱ。
在化合物Ⅱ的制备过程中，加热搅拌过程的反应温度为30～60℃，优选为40℃；加热搅拌过程的反应时间为1～3h，优选为2h。
本发明更进一步的提供了化合物Ⅲ的制备方法，包括如下步骤：
在反应容器中，加入1份罗丹明B（化合物Ⅳ）和30 份乙醇，室温下搅拌，慢慢滴入5份水合肼；滴加完毕后，搅拌加热回流，反应完成后，冷却溶液，旋转蒸发除掉乙醇；然后加入盐酸，不断搅拌下，再慢慢加入氢氧化钠溶液，直到pH达到9-10之间，出现大量白色沉淀；过滤，并用水洗滴滤饼3次；然后溶于二氯甲烷，以无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到化合物Ⅲ。
在化合物Ⅲ的制备过程中，室温下搅拌过程的反应时间为0.5～1.5h，优选为1h ；搅拌加热回流的温度为80℃、时间为1～3h，优选为2h。
在化合物Ⅰ、化合物Ⅱ以及化合物Ⅲ制备过程中，所有无水硫酸钠干燥时间均优选的为1h。
为了更清楚的说明本发明所述化合物Ⅰ、化合物Ⅱ以及化合物Ⅲ之间的关系，本发明提供了化合物Ⅰ的制备路线：
上述制备路线是通过如下步骤：
将罗丹明B（Ⅳ）溶于乙醇中，加入水合肼，回流，反应结束后得罗丹明B酰肼Ⅲ（化合物Ⅲ）；然后将罗丹明B酰肼Ⅲ溶于乙醇中，加入乙二醛反应得化合物Ⅱ，最后化合物Ⅱ和水合肼反应，经过柱分离，真空干燥得化合物Ⅰ纯品。在本说明书的实施例中更详细地说明了该化合物的合成和分析检测方法。
本发明进一步提供了所述的化合物Ⅰ、或者所述化合物Ⅰ的制备方法制备获得的化合物Ⅰ作为荧光探针在二价铜离子的痕量分析检测和活细胞内铜离子荧光成像中的应用。
为了更清楚的说明本发明所述化合物Ⅰ的应用，本发明还提供了痕量二价铜离子含量测定的溶液体系，具体为：
在乙腈/水（1/1，V/V，10 mM Tris-HCl, pH = 7.15) 溶液中，加入用乙腈/水配制成的化合物Ⅰ母液，稀释，混合均匀后，加入待测样品中，利用荧光光谱法定性和定量检测溶液中的铜离子。化合物Ⅰ对Cu2+有高效的识别性能，加入铜离子能引发明显的颜色变化：溶液的颜色从无色变成紫色，荧光从无色变成玫瑰红色，同时探针分子Ⅰ（化合物Ⅰ）的抗干扰能力强和检测限较低。具体应用如下：将探针分子Ⅰ配制成0.5 mM 的溶液，然后稀释成10 μM。在乙腈和水溶液中，加入5当量的二价铜离子之后，在571 nm 出现了一个强的发射峰。
本发明提供的化合物Ⅰ作为荧光探针对细胞内二价铜离子染色：探针分子透过细胞膜，与细胞内的铜离子络合发出荧光，用荧光显微镜能清晰地观察到发射玫瑰红色荧光的细胞成像。即该荧光探针可用于活体细胞的荧光成像技术。
本发明的荧光探针用于待测物中二价铜离子的痕量检测，具有如下特征：1. 选择性好。分子探针Ⅰ在乙腈/水溶液体系中对二价铜离子可以很好地识别，常见金属离子（Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cd2+，Cr3+，Co2+，Ni2+，Ag+，Pb2+，Zn2+，Fe3+, Hg2+）对其检测干扰很小；2. 灵敏度高，在水溶液中该探针对铜离子的线性响应范围至少为5.9×10-8 ~ 2.3×10-6mol/L。最低检出限为4.1×10-8 mol/L；3. 荧光及颜色变化肉眼可见；4.该探针对pH不敏感；5.该探针可以应用于环境水体系、活体细胞中铜离子的检测，具有良好的开发前景。
本发明所述的荧光探针可以用于水环境和生物细胞体系中二价铜离子的含量检测，具体为荧光检测和细胞成像检测。
本发明所提供的一类似罗丹明荧光团为母体的荧光探针的制备方法，反应条件温和，合成步骤少，产物产率高，原料价廉易得。本发明所提供的荧光探针对铜离子选择性和灵敏度高，检测限低至亚纳摩尔级，并且可用肉眼来识别荧光及颜色的变化，是一种良好的检测铜离子的荧光探针。本发明所提供的荧光探针还可应用于活细胞内铜离子的荧光成像，在与铜离子相关疾病的早期诊断及致病机理研究上具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是本发明的化合物I在CDCl3试剂中的氢核磁共振谱图。
图2是本发明的化合物I在CDCl3试剂中的碳核磁共振谱图。
图3为本发明化合物I对二价铜离子的荧光滴定光谱图（图3a）和紫外滴定光谱图（图3b）。激发波长为520 nm。化合物I的终浓度为10 μM, 逐渐加入0～70 μM的Cu2+, 测试体系为乙腈水溶液（乙腈/水=1/1, V/V，10 mM Tris-HCl，pH = 7.15）。
图4是本发明化合物I对Cu2+的选择性的荧光发射光谱（图4a）及紫外吸收光谱（图4b），荧光探针化合物I的浓度为10 μM，Cu2+的浓度为50 μM，其他常见阳离子的浓度为50 μM。激发波长为520 nm。
图5是本发明的化合物I在乙腈水溶液中检测铜离子时对常见阳离子的抗干扰荧光对比图。化合物I的浓度10 μM，铜离子和其他常见阳离子的浓度50 μM。激发波长为520nm，发射波长为571 nm。
图6是本发明的化合物I在乙腈水溶液中检测铜离子时对常见阴离子的抗干扰荧光对比图。化合物I的浓度10 μM，铜离子和其他常见阴离子的浓度50 μM。激发波长为520nm，发射波长为571 nm。
图7是用Cu2+与EDTA检验本发明的化合物I对Cu2+识别的不可逆过程。化合物I的浓度10 μM，Cu2+的浓度为50 μM，加入过量的EDTA，测试体系的荧光光谱。
图8是本发明的化合物I溶液在铜离子加入前后溶液颜色的变化。
图9是本发明的化合物I溶液在铜离子加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化。
图10是pH对本发明的化合物I荧光光谱的影响。
图11本发明的化合物I应用与细胞中对外源性铜离子进行荧光成像图。其中（a）探针浓度为10 μM加入到Hela细胞中培养30 min后明场图，（b）Cu2+加入前荧光成像图，（c）Cu2 +加入后明场图，（d）Cu2+加入后荧光成像图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明。这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。在本发明中所有的原料或添加剂的“份”均指的是质量份。在下面的实施例中，所有提及的乙腈/水溶液、或者乙腈水溶液、或者水乙腈溶液、或者水/乙腈溶液均是乙腈/水（1/1，V/V，10 mM Tris-HCl, pH = 7.15)溶液。
实施例1：荧光探针I的制备
步骤一：化合物Ⅱ根据文献Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2013, 23, 2916–2919方法合成。
步骤二：将300.0 mg化合物Ⅱ加入20 mL无水乙醇中，再加入85%的水合肼2.0 mL（1.7g），然后在氮气保护下，回流反应；反应结束后，将溶液冷却至室温，旋转蒸发除掉乙醇，再分别加入50 份二氯甲烷以及150 份饱和氯化钠溶液；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂；用石油醚（bp 60-90 °C）/乙酸乙酯(v:v)=5:1为展开剂通过硅胶柱色谱分离，真空干燥得273.1 mg的黄色固体化合物Ⅰ。产率：89.2 %。
由于步骤一合成的化合物Ⅱ有部分杂质，因此近似的认为化合物Ⅱ与水合肼的质量比为1:6。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.94 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H),7.52 – 7.38 (m, 2H), 7.11 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.45 (s,1H), 6.42 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.30 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 2.4 Hz,1H), 3.62 (s, 2H), 3.34 (q, J = 7.0 Hz, 8H), 1.17 (t, J = 7.0 Hz, 12H)。
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) : δ (ppm)= 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166.20,153.86, 151.56, 148.89, 147.21, 135.88, 132.56, 130.00, 128.16, 128.12,123.85, 123.01, 108.02, 104.45, 97.93, 65.97, 44.38, 12.62。
HRMS (ESI) m/z: 计算值C30H35N6O2 [M+H]+ 511.2821; 实测值 511.2818。
FT-IR(KBr, cm-1): 3425, 2977, 2932, 2901, 1736, 1698, 1635, 1615,1556, 1511, 1470, 1431, 1379, 1333, 1255, 1237, 1123, 1083, 1051, 1013, 877,857, 821, 761, 711, 650 。
实施例2：化合物I与不同浓度Cu2+作用后的光谱变化
将化合物I以10 μM的浓度加入到乙腈/水溶液中，然后逐渐增大加入的铜离子浓度(0～70 μM)，记录响应的紫外和荧光光谱，测试结果显示于图3a和3b中，从图中可以看出，随着铜离子浓度的增加，562 nm处的紫外吸收强度和571 nm处的荧光发射强度逐渐增加，在Cu2+达到60 μM时，紫外吸收和荧光强度达到饱和，再增加Cu2+浓度，二者强度均不再增加。
实施例3：化合物I对常见阳离子的选择性
使用化合物I评价对铜离子的选择性，将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的二价铜离子和各种常见阳离子的乙腈水溶液中（分别为化合物I与二价铜离子的乙腈水溶液、化合物I与任一一种常见阳离子的乙腈水溶液），测试结果显示于图4中（紫外光谱和荧光光谱）。从图中可以看到，化合物I（探针）对二价铜离子具有很高的选择性，铜离子的加入使得化合物I的荧光强度明显增强，而其他常见阳离子的加入则无明显变化。
实施例4：常见阳离子对化合物I检测Cu2+的干扰研究
将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的Cu2+和50 μM的各种常见阳离子的乙腈水溶液中，激发波长为520 nm，发射波长为571 nm，测试结果显示于图5。从图中可以看到，化合物针I对二价铜离子具有很高的选择识别能力和抗干扰能力，检测Cu2+时几乎不受常见阳离子的干扰。图5中横坐标中的none表示的是将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的铜离子的乙腈水溶液中，其他均是将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的铜离子和任一一种常见阳离子的乙腈水溶液中。
实施例5: 常见阴离子对化合物I检测Cu2+的干扰研究
将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的Cu2+和50 μM的各种常见阴离子的测试乙腈水溶液中，激发波长为520 nm，发射波长为571 nm，测试结果显示于图6。从图中可以看到，化合物I对二价铜离子具有很高的选择识别能力和抗干扰能力，检测Cu2+时几乎不受常见阴离子的干扰。图6中横坐标中的none表示的是将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的铜离子的乙腈水溶液中，其他均是将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的铜离子和任一一种常见阴离子的乙腈水溶液中。
实施例6: 化合物I作为荧光分子探针对Cu2+检测的可逆性测试
把Cu2+加到化合物I的乙腈/水溶液中，使化合物I的荧光恢复，然后加入过量的Cu2 +络合剂EDTA，发现荧光信号几乎没有发生变化（见图7）。表明这个识别过程不可逆。
实施例7：化合物I对Cu2+的可视化检测
将浓度为10 μM的化合物I加到含有50 μM的Cu2+的乙腈水溶液中，如图8所示，Cu2+可以使化合物I的乙腈水溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成紫红色，伴随着紫外灯下肉眼可视的Cu2+诱导作为荧光探针的化合物I发出明亮的玫瑰红色荧光（图9），说明是一种具有双通道识别功能的荧光探针。
实施例8：化合物I荧光光谱和pH的关系。
配制浓度为10 μM化合物I的乙腈水溶液，用pH计把体系的pH值调到11.0，然后，从pH=11.0到pH=2.3进行荧光滴定。检测pH对化合物I荧光光谱的影响，结果见图10，在pH=5.0～11.0范围内，化合物I几乎没有荧光，说明化合物I对pH不敏感。
实施例9：化合物I作为荧光探针对细胞外源性Cu2+荧光成像
我们将本发明化合物I应用于Hela细胞中对外源性的铜离子进行荧光成像应用。具体操作步骤如下：在37℃将10 μM探针加入到育有Hela细胞的培养液中培养30 min后用共聚焦显微镜进行成像。首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓，然后进行激发观察在未加入Cu2+前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。向体系中加入50 μMCu2+的水溶液后，等待10 min后进行激发可以观察到有荧光发出，说明此荧光探针可以对外源性的Cu2+进行荧光成像。具体结果见图11。

Claims (5)

1.一种化合物Ⅰ，其特征在于，该化合物为3',6'-双(二乙氨基)-2-（（肼叉亚乙基）氨螺[异吲哚-1,9'-占吨]-3-酮，具有如下结构式：
。
2.权利要求1所述化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
在反应容器中，加入1份(E)-2-((3',6'-双(二乙氨基)-3-氧螺[异吲哚-1,9'-占吨]-2-烯)亚胺)乙醛和无水乙醇以及6份水合肼，加热搅拌回流反应，反应完成后，旋转蒸发除掉乙醇，再分别加入50 份二氯甲烷以及150 份饱和氯化钠溶液；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，粗产物以柱色谱分离，得到化合物Ⅰ。
3.根据权利要求2所述化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于，加热搅拌回流反应过程的反应温度为30～60℃；加热搅拌回流反应过程的反应时间为1～3h。
4.根据权利要求2所述化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于，加热搅拌回流反应过程的反应温度为40℃；加热搅拌回流反应过程的反应时间为1.5h。
5.根据权利要求2所述的化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述柱色谱采用体积比为1:5的乙酸乙酯和石油醚。
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