CN111004246B - 监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用。为了解决许多检测溶酶体pH变化的荧光探针不适合对细胞进行长时间的监测，能够实际用于线粒体自噬的监测的溶酶体靶向pH荧光探针甚少等问题，本发明提供了一种制备方法：将罗丹明B的N‑对甲苯磺酸乙酯衍生物和N‑氨基吗啉溶于二氯甲烷中，加热回流，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品，将粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为pH荧光探针。该荧光探针具有良好的细胞膜渗透性，能够靶向标记溶酶体，且通过检测溶酶体pH的变化实现对线粒体自噬过程的可视化监测，在溶酶体pH生理学和病理学研究中具有潜在的应用前景。

Description

监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用
技术领域
本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用。
背景技术
自噬(autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。线粒体在生物氧化和能量转换过程中会产生活性氧，线粒体DNA又比核DNA更容易发生突变，因此线粒体是一种比较容易受到损伤的细胞器。及时清除细胞内受损的线粒体对细胞维持正常的状态具有重要的作用。细胞主要通过线粒体自噬来清除损伤或衰老的线粒体，以使细胞内线粒体的质量和数量保持平衡，因而对于维持细胞稳态及细胞生存具有重要意义。
一般来说，线粒体自噬发生时，线粒体会被自噬体吞噬并与溶酶体结合，由于线粒体和溶酶体的差异，溶酶体内的pH值等微环境会发生变化。因此，我们可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测线粒体自噬进行的程度。众所周知，荧光分子探针结合激光共聚焦显微镜成像技术，具有非破坏性、高灵敏性、操作简便、以及高信噪比等特性，已经成为分子水平上实时原位监测细胞内pH变化的重要手段。
目前文献报道了许多检测溶酶体pH变化的荧光探针，然而由于这些探针的激发和发射波长大多处于紫外和近可见区域，与细胞自发荧光相互交叠，造成背景荧光较强，且紫外光对细胞的毒副作用较大，因而不适合对细胞进行长时间的监测。其次，能够实际用于线粒体自噬的监测的溶酶体靶向pH荧光探针甚少。因此，需要开发新型的溶酶体靶向pH探针用于线粒体自噬过程的检测。本发明以具有优良pH响应荧光性质的罗丹明B为荧光团母体结构，并引入溶酶体靶向吗啉环基团，设计合成了新型pH荧光探针MSO，通过对细胞溶酶体内pH的特异性检测实现对线粒体自噬过程的监测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法；目的之二是提供监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，即用于制备动物细胞线粒体自噬过程中溶酶体内pH变化的检测试剂。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针为3'，6'-双(二乙胺基)-2-(2-(氨基吗啉)乙基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式为：
Figure BDA0002317587350000021
一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的合成路线为：
Figure BDA0002317587350000031
一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)按现有技术制备罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物，参考文献：Hong-ShuiLv；Jing Liu；Jing Zhao；Bao-Xiang Zhao；Jun-Ying Miao,Sensors and Actuators,B:Chemical(2013),177,956-963；
(2)将罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物和N-氨基吗啉溶于二氯甲烷中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品；
(3)将步骤(2)所制得的粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为所述监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针MSO。
进一步，所述一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，步骤(2)中的罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物和N-氨基吗啉的摩尔比为1：1.5，碳酸钾的烘干温度为150℃，烘干时间为2h，加热回流反应的时间为12～15h，加热回流的反应温度为35℃。
更进一步，所述一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，步骤(3)中的硅胶柱色谱的洗脱剂的体积配比为二氯甲烷：无水甲醇＝20:1。
一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，在定性检测制备动物细胞内溶酶体pH变化时作为检测试剂的应用。
一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，作为检测试剂，通过检测制备动物细胞溶酶体pH的变化以实现对线粒体自噬过程的监测。
与现有技术相比本发明具有以下优点：1)所述荧光探针MSO合成步骤简单，成本低廉，易于大规模生产，具有潜在的商品化应用价值；(2)所述荧光探针MSO以罗丹明B为荧光团母体结构，利用H+诱导罗丹明B的环内酰胺开环，导致荧光增强，实现对pH高灵敏检测，并且不受其它氨基酸和离子的干扰；(3)pKa值为5.42，pH响应线性范围5.0～6.0，非常适合溶酶体内弱酸性环境pH的检测；(4)该荧光探针MSO具有良好的细胞膜渗透性，能够靶向标记溶酶体，且通过检测溶酶体pH的变化实现对线粒体自噬过程的可视化监测，在溶酶体pH生理学和病理学研究中具有潜在的应用前景；(6)所述的检测手段简单，只需包括荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜。
附图说明
图1a为本发明荧光探针MSO的核磁表征，1H-NMR；
图1b为本发明荧光探针MSO的核磁表征，13C NMR谱；
图2为本发明荧光探针MSO的质谱表征，LC-MS谱；
图3为本发明荧光探针MSO与不同pH值的缓冲溶液中的荧光发射光谱图；
图4为本发明荧光探针MSO在紫外光下识别H+前后溶液荧光颜色变化，由无色变为红色；
图5为本发明荧光探针MSO分别在pH 8.0和pH 5.0时，在常见金属离子、阴离子和氨基酸小分子存在下对H+的选择性；
图6为本发明荧光探针MSO的荧光强度I590随pH值变化的sigmoidal拟合曲线；pKa值为5.42，pH响应线性范围5.0～6.0；
图7为本发明荧光探针MSO与市售绿色溶酶体特异选择性染料(LysoTrackerGreen DND-26)在pH 7.4的条件下共同孵育30min的共定位荧光成像图；
图8为本发明荧光探针MSO分别在pH 7.40，pH 7.00，pH 6.00，pH 5.00和pH 4.50时，与HeLa细胞共同孵育20min的激光共聚焦成像图；
图9为本发明荧光探针MSO与HeLa细胞孵育10min后，加入Rapamycin(雷帕霉素，一种线粒体自噬诱导剂)诱导线粒体发生自噬，实时观察30min内细胞发生线粒体自噬过程中激光共聚焦成像变化。
具体实施方式
实施例1
3'，6'-双(二乙胺基)-2-(2-(氨基吗啉)乙基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮(MSO)的制备及表征：
Figure BDA0002317587350000051
在圆底烧瓶中，将罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物(170mg，0.62mmol)和N-氨基吗啉(300mg，0.93mmol)溶于二氯甲烷中，加热回流12h至反应完全；体系冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品；粗品经硅胶柱提纯(洗脱剂按体积比二氯甲烷：无水甲醇＝20：1)得到淡黄色固体为目标化合物监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针MSO。
1H NMR(600MHz，CD3OD-d4，图1a)δ(ppm):1.17-1.19(t,12H,-CH3-),2.88-3.01(d,2H,-CH2-),3.18-3.22(m,4H,-CH2-),3.32-3.33(m,2H,-CH2-),3.38-3.42(m,8H,-CH2-),4.91(s,4H,-CH2-),6.37-6.40(m,4H,Ar-H),6.45(s,2H,Ar-H),7.06-7.07(d,1H,Ar-H),7.52-7.57(m,2H,Ar-H),7.87-7.88(d,2H,Ar-H),7.85(m,1H,Ar-H)。
13C NMR(150MHz,CD3OD-d6，图1b)δ(ppm)：11.42,41.89,43.95,58.93,65.65,97.56,104.57,108.12,122.11,123.68,128.10,128.15,130.58,132.72,149.00,153.38,153.73,168.93。
HR-MS m/z(图2)：[M+H]+calclated for C34H44N5O3 +,570.7500；measured,570.3440。
实施例2
用不同pH值的Britton-Robinson缓冲液将探针稀释为终浓度5μM，固定激发波长为574nm，记录荧光探针MSO在DMSO/BR(1/99，v/v)体系中随pH变化的荧光发射光谱变化。随着pH值由8.0降低到4.8，590nm处的荧光强度逐渐增强(图3)。同时溶液荧光颜色由无色变为粉红色(图4)。根据荧光探针MSO在590nm处的荧光强度值随pH变化的Singmoidal拟合曲线计算pKa值为5.42(图5)，pH响应线性范围为5.0～6.0，非常适合溶酶体弱酸性环境pH变化的检测。
实施例3
将实施例1中的荧光探针MSO浓度保持在5μM，分别考察该探针在常见离子及氨基酸存在下，对H+的选择性。如图6所示，在DMSO/BR(1/99，v/v)体系中，pH 8.0和pH 5.0时，荧光探针RML对上述物质几乎没有响应，证明荧光探针RML对H+具有很高的选择性。图6中物质的顺序和浓度依次为：1,空白；2,K+(150mM),3,Na+(150mM),4,Mg2+(2mM),5,Ca2+(2mM),6,Ba2+(0.2mM),7,Cu2+(0.2mM),8,Fe2+(0.2mM),9,Fe3+(0.2mM),10,Ni2+(0.2mM),11,Zn2+(0.2mM),12,Cl-(10mM),13,SO4 2-(0.2mM),14,SO3 2-(0.2mM),15,NO-(0.2mM),16,Ac-(0.2mM),17,Al3+(0.2mM),18,Ag+(0.2mM),19,Br-(0.2mM),20,Cd2+(0.2mM),21,Cu2+(0.2mM),22,Mn2+(0.2mM),23,Cys(0.1mM),24,GSH(0.1mM),25,Hcy(0.1mM),26,Ala(0.1mM),27,His(0.1mM),28,Arg(0.1mM),29,Lys(0.1mM),30,Phe(0.1mM),31,Met(0.1mM),32,Leu(0.1mM),33,Try(0.1mM),34,Glu(0.1mM),35,Asn(0.1mM),36,Pro(0.1mM),37,Leu(0.1mM),38,Glu(0.1mM),39,Ser(0.1mM),40,Val(0.1mM),41,Ile(0.1mM),42,Asp(0.1mM),43,Thr(0.1mM)。
实施例4
了观察实施例1中的荧光探针MSO是否具有溶酶体靶向性，我们分别进行了荧光探针MSO与商业化绿色溶酶体特异选择性染料LysoTracker Green DND-26O的共定位实验。将贴壁的HeLa细胞与LysoTracker Green DND-26(终浓度5μM)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO2的孵育箱中孵育30min后，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的染料。然后加入实施例1中的荧光探针MSO(终浓度10μM)共同孵育10min，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。其中，荧光探针MSO的固定激发波长为561nm，收集红色荧光发射范围568-650nm；LysoTracker Green DND-26的固定激发波长为488nm，收集绿色荧光发射范围490-530nm。由图7a可知，荧光探针MSO呈红色荧光分布于细胞质区域，说明荧光探针MSO具有良好的细胞膜通透性。此外，荧光探针MSO的红色荧光与LysoTracker Green DND-26(图7b)能够很好地重叠，得到黄色荧光(图7c)，经软件处理荧光探针MSO与LysoTrackerGreen DND-26的Pearson’s共定位系数高达0.90(图7d)。说明荧光探针MSO与LysoTrackerGreen DND-26具有显著的共定位成像，能够靶向定位于溶酶体。
实施例5
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的荧光探针MSO分别在pH 7.40，7.00，6.00，5.00，4.50的条件下，于37℃、5％CO2的孵育箱中共同孵育10min，然后再加入Nigericin继续孵育10min。最后分别用相应pH值的磷酸盐缓冲液轻轻洗涤3次，除去多余的荧光探针MSO，在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为561nm，收集红色荧光发射范围568-650nm。由图8可知，pH 7.4时细胞在红色通道几乎观察不到荧光(图8a)；随着pH降至4.50时，细胞的红色荧光逐渐增强(图8b-e)。明场成像进一步证实了经探针孵育后细胞的存活性(图8f-j)。图8k-o是红色荧光成像(图8a-e)和相应的明场成像(图8f-j)的叠加成像。这些结果说明荧光探针MSO能够高灵敏检测细胞内溶酶体弱酸性环境pH的变化。
实施例6
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的荧光探针MSO(10μM)在37℃、5％CO2的孵育箱中共同孵育10min，固定激发波长为561nm，收集红色荧光发射范围568-650nm，在共聚焦显微镜下探针观察到红色荧光(图9a)。随后，在细胞中加入Rapamycin(雷帕霉素，一种线粒体自噬诱导剂)诱导线粒体发生自噬，可观察到细胞的红色荧光随时间延长逐渐减弱，30min时红色荧光几乎完全消失。说明在细胞在线粒体自噬过程中溶酶体的pH值逐渐升高，同时表明本发明的荧光探针MSO能够通过监测溶酶体pH的变化来有效的监测细胞的线粒体自噬过程。

Claims (6)

1.一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针，其特征在于，所述监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针为3'，6'-双(二乙胺基)-2-(2-(氨基吗啉)乙基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式为：
Figure FDA0002832297120000011
2.权利要求1所述的一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物和N-氨基吗啉溶于二氯甲烷中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品；
(2)将步骤(1)所制得的粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为所述监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针；
所述罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物的结构为：
Figure FDA0002832297120000012
3.根据权利要求2所述一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物和N-氨基吗啉的摩尔比为1：1.5，加热回流反应的时间为12～15h，加热回流的反应温度为35℃。
4.根据权利要求2所述一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的硅胶柱色谱的洗脱剂的体积配比为二氯甲烷：无水甲醇＝20:1。
5.如权利要求1所述的一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，其特征在于，在制备用于定性检测动物细胞内溶酶体pH变化的检测试剂中的应用。
6.如权利要求1所述的一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，其特征在于，在制备用于线粒体自噬过程中溶酶体pH变化的监测试剂中的应用。
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Title
A novel pH probe based on a rhodamine–rhodamine platform;Xuan-Xuan Zhao et al.;《RSC Advances》;20141001;第4卷;第50319页Scheme 1 *

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CN111004246A (zh) 2020-04-14

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