CN103756669B - 吲哚类pH荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吲哚类pH荧光探针及其制备方法，以及探针的应用。该制备方法是：在惰性气体保护下，将4-喹啉甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物溶于乙酸酐，加入乙酸钠，加热反应制得粗品；将其浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。该探针表现出高的荧光量子产率以及对H+高的灵敏度、好的选择性和大的Stocks位移等的优点。该探针可穿透细胞膜，适用于细胞内pH的检测和细胞标记等。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针，具体属于吲哚类pH荧光探针及其制备方法，以及在生物领域的应用。
背景技术
人体细胞内pH值与细胞、酶和组织的许多重要生理过程如细胞增殖和凋亡、药物耐药性、离子运输、内吞作用和肌肉收缩等活动密切相关。通常细胞中存在两个pH值范围，一种是近中性，如细胞液中的pH值范围为6.8-7.4；还有一种是酸性，如溶酶体的pH值范围为4.5-5.5，内涵体的pH值范围为5.4-6.2，称为酸性细胞器。不正常的pH值可能导致心肺和神经系统的疾病，如阿尔茨海默综合症，严重的甚至可能危及生命。
监测细胞内pH值的动态变化对于理解细胞内许多生理功能的规则机制有着重要的作用。相较于微电极、NMR和吸收光谱等pH测量方法，荧光光谱检测技术对于在时空分布上检测pH变化具有独特的优势。此外，荧光技术具有操作简单、响应快速、高信噪比、高灵敏度以及大多数情况下对细胞无损伤等优点。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高的荧光量子产率、大的Stocks位移、对pH高度敏感、选择性高的吲哚类pH荧光探针，并将其用于细胞内pH值的检测。
本发明提供的吲哚类pH荧光探针，其结构式为：
其中，R1、R2为甲基或乙基，R3至R14为氢原子或甲基。
本发明提供的一种吲哚类pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
（1）在惰性气体保护下，将4-喹啉甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物按照摩尔比6-8:5溶于乙酸酐，加入和4-喹啉甲醛或其衍生物同摩尔量的乙酸钠，70-100℃磁力搅拌，反应过夜，过滤除去乙酸钠，制得产物粗品；
（2）将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。
其合成路线如下：
本发明的探针具有很好的细胞膜穿透性，可用于细胞内pH值的检测和细胞标记等。
与现有的pH荧光探针相比，本发明合成的探针具有以下优点：（1）高的荧光量子产率（以硫酸奎宁为基准物测得本发明探针的荧光量子产率为0.89），可有效的克服细胞自发荧光的干扰；（2）大的Stokes位移（148nm），有利于减小造影过程中激发光的干扰；（3）好的选择性，本探针对H+的响应不受常见金属离子和生命体中一些氨基酸、葡萄糖等物质的干扰；（4）本探针是基于分子内电荷转移（ICT）原理设计的，在质子化和去质子化的过程中吸收和发射光谱发生变化，在自然光和紫外灯下溶液颜色明显改变，可通过肉眼观察。（5）该探针具有很好的细胞穿透性，利用激光共聚焦成像技术可进行细胞内pH的检测和细胞标记；（6）本探针的合成步骤简单，具有很大的实用价值。
附图说明
图1.本发明实施例1中探针随pH值变化的紫外吸收光谱图。
图2.本发明实施例1中探针在自然光下结合H+前后颜色变化，颜色由浅绿色变为浅黄色。
图3.本发明实施例1中探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图4.本发明实施例1中探针在紫外灯下结合H+前后颜色变化，颜色由绿色变为红色。
图5.本发明实施例1中探针对常见金属离子和生命体中一些氨基酸、葡萄糖等物质的响应情况。
图6.本发明实施例1中探针与人膀胱癌细胞（BIU-87）在pH值7.4的条件下共同孵育30min的激光共聚焦成像图，细胞呈明亮的绿色。
图7.本发明实施例1中探针与人膀胱癌细胞（BIU-87）在pH值4.5的条件下共同孵育30min的激光共聚焦成像图，细胞的绿色较pH值为7.4时明显减弱。
具体实施方式
实施例1
1，1-二甲基-2-（喹啉-4-）乙烯基-1H-苯并吲哚探针的制备：
（1）在惰性气体保护下，将0.943g（6.0mmol）4-喹啉甲醛和1.05g（5.0mmol）1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚溶于30ml乙酸酐，加入0.493g（6.0mmol）乙酸钠，加热反应（80℃磁力搅拌），过夜。使用硅胶薄层板，于二氯甲烷/甲醇中进行薄层色谱分析检测，确定反应完全后，冷却，过滤除去乙酸钠，制得产物粗品；
（2）将产物粗品减压浓缩，经硅胶柱分离，二氯甲烷/甲醇（40:3）为洗脱剂，得到黄色固体。1H NMR（300MHz，DMSO-d6），δ：1.72（s，6H），7.55-7.57（t，1H），7.66-7.73（t，1H），7.73-7.78（t，2H），7.78-7.91（m，2H），8.0-8.13（m，4H），8.22-8.24（d，1H），8.41-8.44（d，1H），8.59-8.64（d，1H），8.99-9.01（d，1H）。
实施例2
将实施例1中的探针浓度保持在5μmol/L，在乙醇/水（体积比为2:1）体系中用1mol/L的HCl调节pH值，记录其吸收光谱（图1）。随着pH值的降低，短波长处的吸收峰逐渐下降，长波长处的吸收峰缓慢增强，并且在412nm处存在一个等吸收点。溶液的颜色也由原来的浅绿色变为了浅黄色（图2）。
实施例3
将实施例1中的探针浓度保持在5μmol/L，在乙醇/水（体积比为2:1）体系中用1mol/L的HCl调节pH值，以412nm为激发波长，记录其荧光发射光谱（图3）。随着pH值的降低，522nm处的荧光峰逐渐减弱，而630nm处的荧光峰逐渐突显出来。紫外灯下溶液的颜色也由原来的亮绿色变为了红色（图4）。
实施例4
将实施例1中的探针浓度保持在5μmol/L，分别考察该探针和常见的金属离子以及生命体中一些氨基酸、葡萄糖等物质的响应情况。如图5所示，该探针对上述物质几乎没有响应，证明本探针对H+具有好的选择性。图5中物质的顺序和浓度依次为：1.探针；2.Na+(30mM)；3.K+(30mM)；4.Mg2+(20mM)；5.Ca2+(20mM)；6.Ba2+(20mM)；7.Fe3+(0.1mM)；8.Fe2+(1mM)；9.Al3+(1.2mM)；10.Cu2+(3mM)；11.Zn2+(20mM)；12.Mn2+(20mM)；13.Ni2+(15mM)；14.Co2+(1mM)；15.Cr3+(0.1mM)；16.Pb2+(0.5mM)；17.Cd2+(5mM)；18.Hg2+(5mM)；19.Ag+(0.5mM)；20.葡萄糖（2mM）；21.亮氨酸（2mM）；22.甲硫氨酸（2mM）；23.缬氨酸（2mM）；24.苏氨酸（2mM）；25.半胱氨酸（2mM）；26.甘氨酸（2mM）；27.精氨酸（2mM）；28.丝氨酸（2mM）；29.组氨酸（2mM）；30.Vc（5mM）。
实施例5
将培养好的BIU-87细胞与实施例1中的探针分别在pH值7.4和4.5条件下、在37℃、5%CO2的孵育箱中共同孵育30min，然后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，在激光共聚焦显微镜下观察，固定激发波长为405nm，发射波长为510-550nm，pH值7.4的细胞呈明亮的绿色（图6），而pH4.5时细胞绿色荧光明显减弱（图7）。
Claims (4)
1.一种吲哚类pH荧光探针，其特征在于结构式：
其中，R1、R2为甲基或乙基，R3至R14为氢原子或甲基。
2.如权利要求1所述的一种吲哚类pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在惰性气体保护下，将4-喹啉甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物按照摩尔比6-8:5溶于乙酸酐，加入和4-喹啉甲醛或其衍生物同摩尔量的乙酸钠，70-100℃磁力搅拌，反应过夜，过滤除去乙酸钠，制得产物粗品；
（2）将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。
3.如权利要求1所述的一种吲哚类pH荧光探针作为检测细胞内pH的指示剂。
4.如权利要求1所述的一种吲哚类pH荧光探针在细胞标记中的应用。
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