CN104629754B - 咔唑类比率型pH荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种咔唑类比率型pH荧光探针及其制备方法,以及该探针用于活细胞和大肠杆菌内极度酸性pH变化的测定。该制备方法是:在惰性气体保护下,将N‑乙基咔唑‑3‑甲醛或其衍生物和1,1‑二烷基‑2‑甲基‑1H‑苯并[e]吲哚类衍生物溶于无水乙醇,以哌啶为催化剂,加热回流反应制得粗品;将产物粗品浓缩后,经硅胶柱分离得到纯品。该探针在极度酸性条件下呈现比率发射荧光特性,同时兼具对H+高度灵敏性、良好的选择性和大的Stokes位移等优点。此外,该探针可穿透细胞膜对细胞进行标记,适用于细胞以及大肠杆菌内极度酸性pH变化的检测。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针,具体属于咔唑类比率发射型pH荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内pH在调控细胞、酶和组织功能中发挥着重要的作用。不同的原核生物以及真核细胞的不同亚细胞器内的pH值从碱性到强酸性不等。pH异常会导致细胞功能紊乱,严重时会引发诸如炎症、癌症和阿尔茨海默症等。因此,对细胞内pH进行灵敏、准确的实时监测,可以为分子水平上研究细胞的生理和毒理过程提供重要的信息。
在检测细胞内pH的众多方法中,荧光分析法具有非破坏性、高灵敏性、响应速度快、高信噪比以及能够连续检测pH变化的快速动力学过程等特性。此外,结合激光共聚焦显微镜,荧光成像技术成为分子水平上进行实时原位监测细胞内pH的重要手段。其中,比率荧光分析技术通过同时记录两个不同波长的荧光强度,并计算它们的比值可以有效地避免探针浓度负染不均,温度,设备以及细胞自发荧光的影响,从而达到对分析物精确的定量分析和荧光成像。迄今为止,文献报道了许多性能优异的比率型pH荧光探针,但该类探针大多数适用于弱酸性亚细胞器(如:溶酶体和内涵体,pH 4.0-5.5)和近中性细胞质(pH 6.8-7.4)内pH的检测。遗憾的是,对于极度酸性(pH<4)环境pH荧光探针的研发缺乏关注,导致这方面的pH荧光探针种类十分有限。虽然对于大多数生物来说,极度酸性是致命的,但是大量的微生物包括“嗜酸菌”和幽门螺杆菌已经进化到可以在这种极度酸性条件下存活。还有肠道致病菌,它能够经过哺乳动物极度酸性的胃液(pH 0.9-1.5)到达小肠,引起致命的感染。这就迫切需要开发有效的比率型极度酸性pH荧光探针,并且兼具大的Stokes位移,高的灵敏性、良好的选择性、光稳定性以及低毒性等特性,应用于细胞及大肠杆菌内极度酸性的检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种咔唑类比率型pH荧光探针;目的之二是提供该探针的制备方法,该方法工艺简单、成本低廉;目的之三是提供该探针的用途,即在检测细胞内酸性pH变化中的应用,以及在检测大肠杆菌内极度酸性pH变化中的应用。该探针对H+有高的灵敏度和选择性,且对pH变化的检测表现为成比率发射,并具有大的Stokes位移,能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰。
本发明提供的一种咔唑类比率型pH荧光探针,其结构式为:
其中,R1、R2为甲基或乙基;R3至R10、R12至R16为氢原子或甲基;R11为氢原子、甲基、乙基或丙基。
本发明提供的一种咔唑类比率型pH荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
a.在惰性气体保护下,将N-乙基咔唑-3-甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物按照摩尔比6-7:5溶于无水乙醇,以哌啶为催化剂,回流12-18小时后,将反应液冷却至室温,倒入大量的蒸馏水中,用二氯甲烷溶剂萃取,减压蒸馏除去有机溶剂,制得产物粗品;其中,无水乙醇、催化剂和蒸馏水的体积比为15-20:1:150-200;
b.将产物粗品浓缩后,经硅胶柱分离得到纯品。
其合成路线如下:
本发明的探针具有很好的细胞膜通透性,可用于细胞和大肠杆菌极度酸性pH变化的检测。
与现有极度酸性pH荧光探针相比,本发明合成的咔唑类pH荧光探针具有以下优点:(1)本探针属于比率发射型pH荧光探针,能够有效消除因探针负染不匀、生物样品厚度不均、溶剂、温度以及设备等因素引起的误差,从而得到比非比率型荧光探针更准确的测定结果。(2)该探针通过可见光激发/发射,可有效的克服光漂白以及细胞自发荧光的干扰;(3)超大的Stokes位移(165nm),有利于减小成像过程中激发光的干扰;(4)对H+响应具有很高的灵敏度和选择性,不受常见金属离子和生物体内中一些常见氨基酸等物质的干扰;(5)本探针是基于分子内电荷转移(ICT)原理设计的,咔唑衍生物和吲哚环分别为给电子基团和吸电子基团,在强酸性条件下,吲哚基团上N原子发生质子化导致其吸电子能力增强,从而加强了整个分子体系的ICT效应,使得该探针的紫外吸收和荧光发射光谱发生红移,而且在自然光和紫外灯下溶液颜色明显改变,可通过裸眼观察。(6)该探针具有很好的细胞通透性,采用激光共聚焦显微成像技术可进行及活细胞和大肠杆菌内极度酸性pH变化的检测;(6)本探针的合成步骤简单,产率高,具有商品化应用价值。
附图说明
图1.本发明实施例1中探针随pH值变化的紫外吸收光谱图。
图2.本发明实施例1中探针在自然光下结合H+前后颜色变化,颜色由黄色变为红色。
图3.本发明实施例1中探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图4.本发明实施例1中探针在紫外灯下结合H+前后颜色变化,颜色由绿色变为红色。
图5.本发明实施例1中探针在金属离子和生物体内一些常见氨基酸等物质存在下,对H+的选择性。
图6.本发明实施例1中探针与人宫颈癌细胞(HeLa)在pH 7.4的条件下共同孵育15min的激光共聚焦成像图,左图为明亮的绿色通道成像图,右图为微弱的红色通道成像图。
图7.本发明实施例1中探针与人宫颈癌细胞(HeLa)在pH 3.0的条件下共同孵育15min的激光共聚焦成像图,与pH 7.4相比,绿色通道荧光明显减弱,红色通道荧光增强。
图8.本发明实施例1中探针与大肠杆菌(E.coli)在pH 7.4的条件下共同孵育2h的激光共聚焦成像图,左图为明亮的绿色通道成像图,右图为微弱的红色通道成像图。
图9.本发明实施例1中探针与大肠杆菌(E.coli)在pH 1.0的条件下共同孵育2h的激光共聚焦成像图,与pH 7.4相比,绿色通道荧光几乎淬灭,红色通道荧光显著增强。
具体实施方式
实施例1
2-(2-(9-乙基-咔唑-3-)乙烯基)-1,1-二甲基-苯并[e]吲哚的合成:
在惰性气体保护下,在100mL圆底烧瓶中加入1.2g(5.38mmol)N-乙基咔唑-3-甲醛和1.0g(5.00mmol)1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚,再加入20mL无水乙醇搅拌使其溶解,在1mL哌啶催化下加热回流15h,溶液颜色由黄色逐渐变为红棕色,将反应液冷却至室温,然后倒入200mL蒸馏水中,用二氯甲烷溶剂萃取后,除去有机溶剂,粗产品经柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇=100/1,V/V)得到橙色固体1.2g,产率68%,m.p.:243-245℃。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.33-1.37(t,3H,-CH3),1.68(s,6H,-CH3),4.46-4.53(q,2H,-CH2-),7.25-7.30(m,1H,Ar-H),7.41-7.46(m,1H,-CH-),7.46-7.53(2H,Ar-H),7.59-7.70(m,3H,Ar-H),7.78-7.81(d,1H,Ar-H),7.94-8.04(m,3H,Ar-H),8.04-8.09(d,1H,-CH-),8.19-8.21(d,1H,Ar-H),8.26-8.28(d,1H,Ar-H),8.70(s,1H,Ar-H).13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ(ppm):21.91,36.66,53.44,109.02,115.52,118.80,119.47,120.02,121.80,122.32,123.87,125.58,126.12,126.52,127.72,128.35,128.97,131.27,138.05,138.64,139.57,150.80,184.89.MS(ESI-MS):m/z Calcd415.2169,found 415.2168for[M+H]+.Elemental Analysis:Calcd C,86.92;H,6.32;N,6.76.Found C,86.47;H,6.00;N,6.03.
实施例2
将实施例1中的探针用DMSO(二甲亚砜)配制浓度为1mM的储备液保存。实验中用H2O/DMSO(V/V=4/1)体系将探针稀释为终浓度10μM,用1mol/L的HCl调节该体系的pH值,并记录其紫外吸收光谱(图1)。随着pH值的降低,短波长处的吸收峰逐渐下降,长波长处的吸收峰显著增强,并且在440nm附近存在一个等吸收点。同时溶液颜色由黄色变为红色(图2)。
实施例3
用H2O/DMSO(V/V=4/1)体系将探针稀释为终浓度10μM,用1mol/L的HCl调节该体系的pH值,固定激发波长为440nm,记录其荧光发射光谱(图3)。随着pH值的降低,523nm处的荧光强度逐渐降低,而605nm处出现一个新的发射峰并显著增强,同时在562nm附近出现等发射点。在紫外灯照射下,溶液的颜色由绿色变为红色(图4)。
实施例4
将实施例1中的探针浓度保持在10μM,分别考察该探针在金属离子以及生物体中常见氨基酸等物质存在下,对H+的选择性。如图5所示,分别在不同pH(pH 7.00,pH 2.50和pH0.50)条件下,探针对上述物质几乎没有响应,证明该探针对H+具有很高的选择性。图5中物质的顺序和浓度依次为:1.空白;2.Na+(150mM);3.K+(150mM);4.Ca2+(10mM);5.Mg2+(2mM);6.Co2+(0.2mM);7.Mn2+(0.2mM);8.Cd2+(0.2mM);9.Fe3+(0.2mM);10.Fe2+(0.2mM);11.Zn2+(0.2mM);12.Cu2+(0.2mM);13.Hg2+(0.2mM);14.Ni2+(0.2mM);15.Al3+(0.2mM);16.Ba2+(0.2mM);17.Pb2+(0.2mM);18.谷氨酸(0.2mM);19.赖氨酸(0.2mM);20.精氨酸(0.2Mm);21.酪氨酸(0.2mM);22.甘氨酸(0.2mM);23.组氨酸(0.2mM);24.还原性谷胱甘肽(0.2mM);25.丝氨酸(0.2mM);26.亮氨酸(0.2mM);27.缬氨酸(0.2mM);28.维生素C(2mM)。
实施例5
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的探针在pH 7.4的条件下,于37℃、5%CO2的孵育箱中共同孵育15min,然后分别用磷酸盐缓冲液(pH 7.4和pH 3.0)轻轻洗涤3次,除去多余的探针,再加入nigericin(5mg mL-1)继续孵育细胞10min,在激光共聚焦显微镜下观察。分别固定激发波长为405nm和488nm,收集发射波段分别为绿色通道(500-550nm)和红色通道(580-625nm)。pH 7.4的细胞在绿色通道呈现明亮的绿色,而红色通道仅有微弱的荧光(图6);当pH降至3.0时,细胞的绿色荧光明显减弱,红色荧光增强(图7)。
实施例6
将接种好的大肠杆菌(E.coli)与实施例1中的探针分别在pH 7.4和1.0的条件下于摇床中共同孵育2h,在激光共聚焦显微镜下观察。分别固定激发波长为405nm和488nm,收集发射波段分别为绿色通道(500-550nm)和红色通道(580-625nm)。pH 7.4的大肠杆菌分别在绿色通道和红色通道中分别呈现明亮的绿色和微弱的红色荧光(图8);当pH值降至极度酸性1.0时,大肠杆菌的绿色荧光几乎猝灭,而红色荧光显著增强(图9)。
Claims (4)
1.一种咔唑类比率型pH荧光探针,其特征在于结构式为:
其中,R1、R2为甲基或乙基;R3至R10、R12至R16为氢原子或甲基;R11为氢原子、甲基、乙基或丙基。
2.如权利要求1所述的一种咔唑类比率型pH荧光探针的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
a.在惰性气体保护下,将N-乙基咔唑-3-甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物按照摩尔比6-7:5溶于无水乙醇,以哌啶为催化剂,回流12-15小时后,将反应液冷却至室温,倒入大量的蒸馏水中,用二氯甲烷溶剂萃取,减压蒸馏除去有机溶剂,制得产物粗品;其中,无水乙醇、催化剂和蒸馏水的体积比为15-20:1:150-200;
b.将产物粗品浓缩后,经硅胶柱分离得到纯品。
3.如权利要求1所述的一种咔唑类比率型pH荧光探针在检测细胞内pH变化中的应用。
4.如权利要求1所述的一种咔唑类比率型pH荧光探针在检测大肠杆菌内极度酸性pH变化中的应用,所述的极度酸性为pH<4。
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