CN115028572B - 一类咔唑苯并[e]吲哚杂合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了一类咔唑苯并[e]吲哚杂合物及其制备方法与应用，具有通式Ⅰ所示结构：本发明制备的咔唑苯并[e]吲哚杂合物表现出pH敏感荧光成像特性，能够通过单光子和/或双光子激发，在肿瘤酸性微环境下激活发出荧光，有利于通过其pH敏感特性对肿瘤组织和细胞进行选择性荧光成像。利用本发明化合物制备成溶液喷洒到在体或离体肿瘤组织及其淋巴结上，可对肿瘤组织进行快速检测和精准成像，引导手术切除和/或药物治疗，进而对于癌症的诊断和治疗具有重要应用意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一类咔唑苯并[e]吲哚杂合物及其制备方法与应用，具体涉及一类具有pH响应的咔唑苯并[e]吲哚杂合物荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤属于世界范围内死亡率较高的疾病之一，严重危害到人类的健康。正常机体细胞在致癌因素的诱导下突变为癌细胞，无限增殖的癌细胞在身体的不同部位之间转移，从而导致机体器官、组织结构和功能的损坏。因此，对恶性肿瘤及早发现、确诊和针对性治疗成为医药领域的重要研究内容。
荧光分子成像是依赖于特异性的荧光分子探针标记特定的分子或细胞，从而在外在光源的激发下产生相应的荧光，其空间分辨率可高达毫米级。此外，荧光成像技术还具有高效、灵敏、实惠、无电离辐射等优势，可用于在分子、细胞和组织水平上研究肿瘤内发生的系列生理病理学变化，为临床实践中对肿瘤的早期诊断提供了有效的手段。基于原理分析，荧光是荧光分子吸收能量后跃迁至激发态，在返回基态的过程中所伴随的发光现象。通过使用一定的仪器设备检测所产生的荧光强度，继而就能获得组织内部的荧光光学特性的分布图象。已知肿瘤细胞快速糖酵解产生的乳酸排到细胞外导致肿瘤酸性微环境。一些基于pH敏感断裂结构(如腙键、亚胺键以及缩醛等)的荧光探针已被报道应用于肿瘤诊断，遗憾的是，这类探针不具备光可逆性且不能对肿瘤进行快速、实时的诊断。
小分子荧光探针具有易于修饰、易于调节光谱、生物相容性好且易于被生物体代谢等优点，已被广泛应用到细胞成像、分子标记和实时成像等方面，在生物医药领域展现出了较大的应用潜力。再者，目前大多数小分子荧光探针仅能够单光子激发，与这些荧光探针相比，具有双光子激发特性的荧光探针能够对组织产生更深的穿透能力，扩大激发和发射波长差值，可有效避免组织自身荧光和光源背景的干扰。因此，本发明研究开发的咔唑苯并[e]吲哚杂合物小分子荧光探针，通过pH刺激响应进行体内外肿瘤组织选择性荧光成像，将具有重要的医药用途前景。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一类咔唑苯并[e]吲哚杂合物及其制备方法与应用，通过单光子和/或双光子激发、酸性pH刺激响应，进行体内外肿瘤选择性荧光成像的医药用途，以引导手术切除和/或药物治疗，进而对于癌症的快速诊断和治疗具有重要应用意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一类咔唑苯并[e]吲哚杂合物，其特征在于，所述咔唑苯并[e]吲哚杂合物为具有pH响应的咔唑苯并[e]吲哚杂合物荧光探针，所述咔唑苯并[e]吲哚杂合物具有通式I所示结构：
其中，R选自H、NO、NO2、NH2中的一种。
表1通式Ⅰ部分化合物代号及其对应的结构
上述通式Ⅰ部分化合物代号及其对应的化合物名称如下：
I1:(E)-2-(2-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
I2:(E)-2-(2-(9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
I3:(E)-2-(2-(9-乙基-6-氨基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚。
本发明还提供了一种咔唑苯并[e]吲哚杂合物的制备方法，将9-乙基-6-R-9H-咔唑-3-甲醛与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚溶解于乙醇溶剂中，在催化量哌啶条件下，加热回流，通过Knoevenagel缩合反应获得化合物I咔唑苯并[e]吲哚杂合物；
合成路线如下所示：
R为H、NO或NO2中的一种。
本发明还提供了一种咔唑苯并[e]吲哚杂合物的制备方法，即化合物I3的制备方法，具体为：化合物I2在还原剂铁粉和氯化铵的乙醇溶液下，加热回流，经还原反应获得化合物I3；
化合物I2为(E)-2-(2-(9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
化合物I3为(E)-2-(2-(9-乙基-6-氨基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
合成路线如下所示：
本发明还提供了上述咔唑苯并[e]吲哚杂合物在制备pH响应、实现肿瘤组织或肿瘤细胞的选择性荧光成像的试剂中的应用。
进一步的，所述试剂为通过单光子和/或双光子激发实现肿瘤组织或肿瘤细胞的选择性荧光成像的试剂中的应用。
进一步的，所述试剂为通过喷洒或局部注射的方式实现肿瘤的快速、实时检测和成像的试剂。将试剂喷洒或局部注射于术前或术中肿瘤病灶部位及周围的组织上，利用荧光腔镜或活体成像仪对肿瘤病灶组织进行快速、选择性荧光成像和示踪，以指导手术和/或药物治疗。
进一步的，所述试剂由咔唑苯并[e]吲哚杂合物溶于助溶剂/表面活性剂/溶剂体系得到；所述助溶剂为1,2丙二醇、DMSO和乙醇中的一种或几种；所述溶剂为水；所述表面活性剂为吐温20、吐温40和吐温80中的一种或几种。
进一步的，所述助溶剂/表面活性剂/溶剂体系中，按体积百分比计，所述助溶剂的含量为1～30％，所述表面活性剂的含量为1～30％。
进一步的，所述肿瘤为结肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌和乳腺癌肿瘤中的一种。
进一步的，所述肿瘤包括结肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌和乳腺癌肿瘤中的一种。
与现有技术相比，本发明具有的应用效果：本发明公开了一类非季铵盐形式的咔唑苯并[e]吲哚杂合物，不同于以往的季铵盐型苯并[e]吲哚鎓盐类化合物(在激发光下一直亮着，无“开-关”效应荧光、无肿瘤选择性荧光成像)，本发明化合物在肿瘤组织酸性微环境下激活，利用ICT原理，通过单光子和/或双光子激发，选择性地在肿瘤部位快速产生pH敏感的荧光，具体实施方法是将喷洒或局部注射本发明化合物溶液于术前或术中肿瘤病灶部位及周围的组织上，利用荧光腔镜或活体成像仪对肿瘤病灶组织进行快速、选择性荧光成像和示踪，具有较高的肿瘤组织荧光成像选择性和较低的背景荧光干扰，能够对肿瘤进行精确诊断，以指导手术和/或药物治疗。
附图说明
图1是本发明实施例4中化合物I1和化合物I3在不同pH的紫外吸收光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度值；
图2是本发明实施例5中化合物I1和化合物I3在不同pH的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图3是本发明实施例6中化合物I1的双光子吸收截面图；
图4是本发明实施例7中化合物实现体内外肿瘤细胞的选择性荧光成像的应用示意图；
图5是本发明实施例8中化合物对离体肿瘤组织选择性荧光成像试验示意图；
图6是本发明荧光探针部分化合物对临床结肠肿瘤组织选择性荧光成像试验示意图。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：(E)-2-(2-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚(I1)的制备
将9-乙基-9H-咔唑-3-甲醛(500mg,1.0mmol)和1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(468.67mg，1.0mmol)加入单口瓶中，用无水乙醇(10ml)溶解，随后加入1-2滴哌啶，85℃回流12h，经TLC监测反应结束后，抽滤，再次重结晶纯化得到化合物I1，产率为86％。
(I1)谱图数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.90–8.84(m,1H,ArH),8.65–8.51(m,1H,ArH),8.35(m,1H,ArH),8.30(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),8.14(m,3H,ArH,CH),7.84(m,2H,ArH),7.76–7.70(m,2H,ArH),7.69–7.61(m,2H,ArH),7.57(m,1H,ArH),7.36(d,J＝15.6Hz,1H,CH),4.55(q,J＝7.2Hz,2H,CH2),1.93–1.82(m,6H,CH3),1.37(t,J＝7.2Hz,3H,CH3).
实施例2：(E)-2-(2-(9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚(I2)的制备
参照实施例1中(I1)的合成方法，由9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-甲醛代替方法中的9-乙基-9H-咔唑-3-甲醛，最后得到化合物I2，产率为83％。
(I2)谱图数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.26(d,J＝2.3Hz,1H,ArH),9.15(d,J＝1.7Hz,1H,ArH),8.61(d,J＝16.0Hz,1H,CH),8.43(m,1H,ArH),8.37(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),8.22–8.14(m,3H,ArH),7.94(m,2H,ArH),7.86(d,J＝8.7Hz,1H,ArH),7.78(d,J＝7.5Hz,1H,ArH),7.76–7.72(m,1H,ArH),7.66(m,1H,CH),4.62(q,J＝7.1Hz,2H,CH2),2.42(s,6H,CH3),1.91(s,3H,CH3).
实施例3：(E)-6-(2-(1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2-基)乙烯基)-9-乙基-9H-咔唑-3-胺(I3)的制备
参照实施例1中(I1)的合成方法，由9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-甲醛代替方法中的9-乙基-9H-咔唑-3-甲醛，最后得到化合物I2，再将化合物I2(500mg,1.0mmol)、铁粉(273.73mg,4.0mmol)、氯化铵(522.92mg,8.0mmol)加入单口瓶中，用无水乙醇(20ml)溶解，80℃回流5h，经TLC监测反应结束后，抽滤，将滤液旋干，经柱层析纯化，得到化合物I3，产率为71％。
I3谱图数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(d,J＝1.7Hz,1H,ArH),8.18(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),8.08-8.00(m,2H,ArH,CH),7.95(d,J＝8.5Hz,1H,ArH),7.88(m,1H,ArH),7.79(d,J＝8.5Hz,1H,ArH),7.64-7.58(m,1H,ArH),7.54(d,J＝8.6Hz,1H,ArH),7.49(d,J＝15.6Hz,1H,CH),7.40-7.31(m,3H,ArH),6.87(m,1H,ArH),4.94(s,2H,NH2),4.36(q,J＝7.2Hz,2H,CH2),1.67(s,6H,CH3),1.30(t,J＝7.1Hz,3H,CH3).
实施例4：本发明不同pH条件下荧光探针的紫外吸收光谱测试
将本发明荧光化合物溶于含50％的乙醇水溶液中，配制成pH＝3-8，浓度为1-20μM的检测液。采用紫外-可见分光光度计测试其紫外吸收光谱数据，结果显示本发明荧光化合物紫外最大吸收波长在400-700nm范围内。其中化合物I1在408nm左右的紫外吸收峰值随化合物I1的pH减小而减小，相反其在507nm左右的紫外吸收峰值随pH减小而增加，其峰值相差93倍；化合物I3在455nm左右的紫外吸收峰值随化合物I3的pH减小而减小，相反其在568nm左右的紫外吸收峰值随pH减小而增加，光谱在492nm处具有等吸收点，其峰值相差110倍(图1)。
实施例5：本发明部分化合物的pH响应的荧光光谱测试
将本发明荧光化合物溶于含50％的乙醇水溶液中，配制成pH＝3-8，浓度为20μM的检测液。采用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱数据，结果显示本发明荧光化合物最大发射波长在500-700nm范围内。其中化合物I1在608nm左右的荧光峰值随化合物I1的pH减小而增加，相反其荧光峰值随pH增加而减小，其峰值相差19倍；化合物I3在662nm左右的荧光峰值随化合物I3的pH减小而增加，相反其荧光峰值随pH增加而减小，其峰值相差25倍(图2)。
实施例6：采用飞秒荧光测量技术检测不同波长下的双光子吸收截面
将本发明化合物I1溶于pH＝4.0的PBS缓冲液中(5μM)，检测本发明化合物和对照化合物Ru(bpy)3 2+从930nm到1050nm的双光子激发下的荧光强度。利用公式：δ＝δr×(Fs×фr×nr)/(Fr×фs×ns)，其中，δ，F,ф和n分别是双光子吸收截面，光谱积分面积，量子产率和浓度；s和r分别代表了本发明化合物和对照化合物。计算不同波长下该还原产物的双光子吸收截面，计算结果表明，本发明化合物I1在980nm具有最大的双光子吸收截面(δmax＝152GM)(图3)。
实施例7：采用共聚焦显微镜进行细胞成像
参照图4，采用共聚焦显微镜进行人肺癌细胞(A549)、结肠癌细胞(HT29)、正常结肠上皮细胞(CCD841)或乳腺癌细胞(Mcf-7)荧光成像，细胞放于激光共聚焦皿中培养24h后，向细胞中加入1～10μM的本发明化合物，将其放置置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育半小时。接着用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后，将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上进行共聚焦荧光成像，设置受试化合物激发波长：λem＝450-650nm，λex＝500-700nm。
细胞成像结果表明，本发明化合物可以被肿瘤细胞有效吸收，表明该类荧光化合物可以选择性在多个肿瘤细胞荧光成像，而对正常结肠上皮细胞荧光成像很弱，为体内外肿瘤组织或细胞成像研究提供了一种可行的手段。
实施例8：本发明化合物对离体肿瘤组织进行喷洒模式的荧光成像试验
取宫颈癌Hela细胞移植瘤模型裸鼠，将其处死，取出肿瘤及主要脏器进行喷洒成像分析。将配制好的本发明化合物I1溶液50μM喷洒在组织上3～5次，用PBS清洗并用棉花吸干，荧光成像结果如图5所示，宫颈癌组织的荧光强度值明显高于其他器官组织，而正常器官组织荧光均比较弱。由此说明了本发明化合物可选择性、快速对肿瘤组织喷洒成像，以实现临床对肿瘤组织的快速检测。
实施例9：本发明化合物对临床肿瘤组织荧光成像试验
在此基础上，进一步研究本发明化合物对临床肿瘤组织的选择性成像能力。对临床结肠癌组织和癌旁组织以及正常结肠组织进行喷洒成像对比分析，将本发明化合物I3溶液均匀喷洒在结肠癌组织和癌旁组织以及正常结肠组织3～5次，3～10min后再用少量生理盐水洗去表面多余的溶液，利用活体成像仪进行荧光成像。
荧光成像结果表明，本发明化合物I3能够选择性、快速点亮临床结肠癌组织，而对周围正常组织不显色或显示较弱(图6)。由此进一步确认了本发明化合物对临床结肠肿瘤组织的选择性成像能力。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (9)
1.一种咔唑苯并[e]吲哚杂合物，其特征在于，所述咔唑苯并[e]吲哚杂合物为具有pH响应的咔唑苯并[e]吲哚杂合物荧光探针，所述咔唑苯并[e]吲哚杂合物具有以下通式所示结构：
其中，R选自NO2或NH2；
R＝NO2时，化合物I2为(E)-2-(2-(9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
R＝NH2时，化合物I3为(E)-2-(2-(9-乙基-6-氨基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚。
2.一种咔唑苯并[e]吲哚杂合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将9-乙基-6-R-9H-咔唑-3-甲醛与1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚溶解于乙醇溶剂中，在催化量哌啶条件下，加热回流，通过Knoevenagel缩合反应获得化合物I咔唑苯并[e]吲哚杂合物；
合成路线如下所示：
R为NO2。
3.一种咔唑苯并[e]吲哚杂合物的制备方法，其特征在于，所述咔唑苯并[e]吲哚杂合物为化合物I3，所述制备方法为：化合物I2在还原剂铁粉和氯化铵的乙醇溶液下，加热回流，经还原反应获得化合物I3；
化合物I2为(E)-2-(2-(9-乙基-6-硝基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
化合物I3为(E)-2-(2-(9-乙基-6-氨基-9H-咔唑-3-基)乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚；
合成路线如下所示：
4.权利要求1所述的咔唑苯并[e]吲哚杂合物在制备pH响应、实现肿瘤选择性荧光成像的试剂中的应用，所述肿瘤为肿瘤组织或肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过单光子和/或双光子激发实现肿瘤选择性荧光成像的试剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过喷洒或局部注射的方式实现肿瘤的快速、实时检测和成像的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂由咔唑苯并[e]吲哚杂合物溶于助溶剂/表面活性剂/溶剂体系得到；所述助溶剂为1,2丙二醇、DMSO和乙醇中的一种或几种；所述溶剂为水；所述表面活性剂为吐温20、吐温40和吐温80中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述助溶剂/表面活性剂/溶剂体系中，按体积百分比计，所述助溶剂的含量为1～30％，所述表面活性剂的含量为1～30％。
9.根据权利要求4～8任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌和乳腺癌肿瘤中的一种。
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