CN103122154A

CN103122154A - 有机近红外双光子荧光染料

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Publication number: CN103122154A
Application number: CN2011103691826A
Authority: CN
Inventors: 李聪; 陈溪山; 王璐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明属化学领域，涉及式I结构的有机近红外双光子荧光染料；所述的有机近红外双光子荧光染料经激发后，同时表现出较强的单光子近红外荧光及双光子荧光发光效率，其双光子荧光效率较其他羰花青类染料有明显提高；活细胞荧光显微镜实验表明，所述荧光染料制成的探针可内吞进入肿瘤细胞溶酶体并可被单光子荧光和双光子荧光显微镜成像同时监测，该类染料可在活体及离体状态下实现单光子近红外荧光和双光子荧光同步成像。该荧光染料水溶性好、化学性质稳定、可用于生物大分子标记等特征，和用于医学影像诊断领域，特别是在光学影像指导下的肿瘤手术切除方面有很强的应用价值。

Description

有机近红外双光子荧光染料

技术领域

本发明属化学领域，涉及有机近红外双光子荧光染料，具体涉及可用于生物大分子标记的具有专一反应活性的有机近红外双光子荧光染料；所述的有机近红外双光子荧光染料水溶性好、化学及光学性质稳定、单光子近红外荧光及双光子可见荧光发光效率高。

背景技术

光学影像是近年新兴的一种无创医学影像技术，与超声波成像(ultrasonic imaging)，磁共振影像(Magnetic Resonance Imaging)和正电子断层扫描成像(positron emissiontomography，PET)等医学影像技术相比，光学影像具有无电离辐射、成本低廉、操作简便、可长时间动态监测等优点[Koo，V.et al，Cell Oncol.2006，28(4)，127-139]；所述的光学影像技术已成为癌症等重大疾病诊断和辅助治疗的关键技术之一。此外，光学影像技术还能即时监测活体[Li C.et al，Clin.Cancer Res.2008，14(2)，515-522]和离体细胞中重要生理和病理过程，如基因表达和抑制[Mahmood U.et al，Radiology，2002，224(2)，446-451]，酶活性[Halim，M.et al，J.Am.Chem.Sec.，2008，130(43)，14123-14128]，分子间的相互作用[Elias，D.R.et al，Cancer Biomakers，2008，4(6)，287-305]等。

当前，创建具有低毒、高灵敏度和靶向性的荧光染料是光学影像的核心问题之一。研究证实，可见光(400-600nm)由于受到光信号在组织中的强吸收、闪射、反射和信号衰减等因素，只能在组织表面或亚表面成像(1-3mm)；而由于血红蛋白、水、脂质等内源性分子在650-900nm近红外波长范围内的吸光率较低，加之活体组织在上述波长区域自发荧光较低，因此，近红外光可穿透较深的组织(≤5cm)并得到信噪比较高的图像[Achilefu，S.et al，Technol.Cancer.Res.T.，2004，3(4)，393-409]。目前，近红外荧光成像虽然主要处于前期临床研究阶段，但其在临床诊断方面的前景受到了前所未有的重视。

另外，与单光子吸收机制不同，双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早由

-Mayer于1931年首次提出；上述理论指出，在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发所述样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可相同(ω1＝ω2，简并吸收)，也可不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图12所示。

美国康奈尔大学Denk等[Denk W，et al.Science，1990，248(4951)：73-76]提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中，开辟了双光子荧光显微和成像新的领域。所述的双光子荧光显微镜成像的优点为：(1)双光子荧光成像可采用生物组织中穿透能力较强的近红外光作为激发光源，因此可解决生物组织中深层物质的层析成像问题；(2)由于双光子放射光波长远离激发光波长，因此双光子荧光成像可以实现暗场成像；(3)采用低能量的近红外光进行激发，大大降低了样品的光损伤、光漂白和光毒性，提高了样品的存活率，使得在活细胞中动态研究复杂的过程成为可能；(4)双光子吸收具有高度的空间选择性。上述双光子诱导的电子跃迁几率与入射光强度的平方成正比，且只有入射激光的峰值功率密度(光强)达到一定的阈值，才会有双光子吸收现象；其次，双光子吸收效应局限于材料内部相当于入射波长立方的微小区域内，而在焦点以外，入射光的峰值功率密度可控制在激发阈值以下，则不会有双光子吸收，从而获得更好的空间分辨率和更高的图像信噪比。基于上述优点，双光子荧光成像为研究在体条件下氨基酸、蛋白质和神经递体等提供了独特而重要的方法。Denk等[Shen Y Z，et al.Appl.Phys.Lett.，2000，76(1)：1-3]用波长为630nm的激光进行双光子激发，获得了分辨率达200nm的猪肾细胞分裂期染色体的荧光图像，因此，双光子荧光成像技术已成为生物分子检测[Nie S，et al.Science，1994，266(5187)1018-1021；Helmchen F，et al.Nature Neuroscience，1999，2(11)：989-996]、活性细胞的超分辨率层析成像[Maiti S，et al.Science，1997，275(5299)：530-532；Svoboda K，et al.Nature，1997，385：161-161]等研究的重要工具。

目前，光学成像在临床上的一个潜在应用方向是实时影像指导下的手术治疗。由于光学成像的直观性和易操作性，被认为在手术进程中为医生提供最直观的视觉帮助从而提高手术的精确度，治疗效果及预后恢复水平；如在脑肿瘤的切除手术中，在肿瘤靶向荧光探针的帮助下，医生可以更方便的观察到肿瘤组织和正常神经组织间的边界，从而在尽可能完全切除肿瘤组织的同时避免对正常组织伤害，对降低脑肿瘤的复发率、延长病人生存时间并提高病人的术后生活质量方面都有重要意义。现代科学已经证实，单光子近红外荧光虽然具有组织穿透能力高、信号信噪比高等优点，但近红外荧光已超出人眼的视觉范围，在手术进程中需要特殊的成像设备进行信号转换从而实现对手术指导；而双光子荧光的发射光在可见光波长范围内，可直接被肉眼观察到，可为指导手术进程提供了极大的便利；因此，同时具有单光子近红外荧光及双光子可见荧光的染料将具备高组织穿透性、高分辨率、高信噪比、易于观察等特点，不但将促进影像指导下的手术治疗，同时通过双光子荧光显微镜在细胞水平上观测探针对病灶部位的靶向性均具有十分重要的意义。

近年来，有机发光材料在诸多领域，尤其是活体荧光成像及荧光显微镜成像中的应用得到了广泛的关注[Albota M，et al.Science，1998，281(5383)：1653-1656；Ventelon L，et al.Angew.Chem.Int.Ed.，2001，40(11)：2098-2101]，其中，基于羰花青类染料的近红外荧光基团具有吸光系数高、量子产率高、水溶性好、细胞毒性低等特点，其中的吲哚花青绿(ICG)作为FDA唯一批准的近红外荧光染料已广泛用于眼底疾病的诊断和治疗；例如吲哚花青绿(ICG)作为血管造影剂用于视网膜/脉络膜新生血管成像及作为染色剂用于指导眼部精确手术等作用。此外，羰花青类染料，如IR783经活化后标记到纳米材料或生物大分子上在活体条件下已实现了肿瘤相关受体靶向示踪，对肿瘤微环境的识别，及对肿瘤高表达酶的监测。

迄今为止还未见有关对羰花青类染料的双光子荧光特点的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一类有机近红外双光子荧光染料，具体涉及一类可用于生物大分子标记的、具有专一反应活性的有机近红外双光子荧光染料；所述的有机近红外双光子荧光染料经激发后既可产生单光子近红外荧光，又可产生双光子可见光，且具有水溶性好、化学及光学性质稳定、单光子近红外荧光及双光子可见荧光发光效率高等优点。

本发明所述的有机近红外双光子荧光染料，具有式I的化学结构，

式I

其中，

X为氯或溴或碘或ClO₄；

n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；

R₁为氢、卤素、烷基、芳香基、硝基、磺酸基、醛基或羧基，其中，卤素包括氯、溴、碘，烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，芳香基包括苯基、萘基、取代苯基；

R₂为氯或溴。

本发明的有机近红外双光子荧光染料通过式II的路线合成：

式II。

本发明所述的有机近红外双光子荧光染料中，吲哚环5位上的羧基可与生物大分子或聚合物上的伯胺基缩合实现荧光基团的标记；

所述的有机近红外双光子荧光染料通过2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯与吲哚1位上羧基取代化合物的缩合反应一步得到；同时，可通过单光子及双光子荧光显微镜观察目标有机近红外双光子荧光染料在细胞内的分布及亚细胞位置；

所述的有机近红外双光子荧光染料能在两个小时内进入肿瘤细胞，并进入细胞溶酶体。

本发明中，所述的有机近红外双光子荧光染料具有如下特征，

(1)在700-760nm范围内染料分子被激发，产生单光子近红外荧光，荧光发射波长为780-850nm；

(2)在900-980nm范围内染料分子被激发，产生的双光子荧光，荧光发射波长为560-620nm；

(3)荧光分子中的烯丙基氯可进一步活化，从而实现对生物大分子的标记。

本发明的有机近红外双光子荧光染料，属于羰花青类荧光染料，经激发后，能同时表现出较强的单光子近红外荧光及双光子荧光发光效率，其双光子荧光效率较其他羰花青类染料有明显提高；同时，活细胞荧光显微镜实验表明，所述荧光染料制成的探针可内吞进入肿瘤细胞溶酶体并可被单光子荧光和双光子荧光显微镜成像同时监测，所述染料可在活体及离体状态下实现单光子近红外荧光和双光子荧光同步成像。本发明所述荧光染料具有水溶性好、化学性质稳定、可用于生物大分子标记等特征，可用于医学影像诊断领域，特别是在光学影像指导下的肿瘤手术切除方面有很强的应用价值。

附图说明

图1为本发明中化合物2的¹H NMR核磁图。

图2为本发明中化合物3的¹H NMR核磁图。

图3为本发明中化合物4的¹H NMR核磁图。

图4为本发明中化合物5的¹H NMR核磁图。

图5为本发明中化合物6的¹H NMR核磁图。

图6为荧光染料1-6在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中的吸收光谱，

其中，染料浓度：1.0×10^-6M。

图7为荧光染料1-6在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中的单光子荧光光谱，

其中，染料浓度：1.0×10^-6M，激发波长：760nm。

图8显示了荧光染料1-6在人源宫颈癌Hela细胞中的细胞毒性，

其中，染料在细胞培养液中的最终浓度为μM；细胞经不同染料孵育24小时后经MTT处理并计算细胞毒性；Hela细胞经不同浓度荧光染料化合物孵育24小时后的细胞活性，数据为8次试验点平均值±方差。

图9显示了荧光染料1-6单光子荧光显微镜成像情况，

其中，单光子近红外染料激发波长：760nm，发射波长：780-820nm；孵育时间：24小时；染料浓度：100μM；细胞核经DIPY荧光染色；Hela细胞经荧光染料化合物1-6(50μM)分别孵育24小时后的单光子荧光显微镜成像；SP NIR为单光子近红外荧光成像(Ex：760nm，Em：780-800nm)，Nuclear为细胞经固定及DAPI染色后的细胞核荧光成像(Ex：360nm，Em：420-460nm)；Merged为近红外荧光和细胞核荧光相叠加后图像，显微镜放大倍数为200倍。

图10显示了单光子荧光显微镜研究荧光染料在Hela细胞中的亚细胞分布，

其中，Merged为溶酶体标记物荧光和染料荧光叠加图；

细胞溶酶体经荧光标记后，加入荧光染料(50μM)并孵育24小时后的单光子荧光显微镜成像；W.L.为白光成像；SP NIR为单光子近红外荧光成像(Ex：760nm，Em：780-800nm)，Nuclear为细胞核经DAPI染色后的荧光图像(Ex：360nm，Em：450-480nm)；FITC为溶酶体荧光标记物成像(Ex：490nm，Em：510-540nm)；Merged为近红外荧光和溶酶体标记物荧光相叠加后图像，显微镜放大倍数为200倍。

图11显示了荧光染料1，2，5，6在Hela细胞中的双光子荧光显微镜成像，

其中，激发波长：900nm，发射波长：560-620nm；孵育时间：24小时；染料浓度：100μM；W.L.为白光成像；TP Flue.为双光子荧光成像(Ex：900nm，Em：560-620nm)，显微镜放大倍数为200及400倍。

图12为单、双光子吸收和发射机理示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1

本发明中，所述的近红外荧光化合物具有式I的结构：

式I

其中，X为氯或溴或碘或ClO₄ ^-；R₁为无取代基或烷基或氯或硝基或磺酸盐或羧基；R₂为氯或溴；n是1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12；

其合成路线如式II所示，

式II。

本发明中，优选实施例化合物的结构式如表1所示，

表1

实施例2合成双醛

将7.2mL POCl₃和2g环己酮溶于10mL CH₂Cl₂中，在冰水浴和磁力搅拌条件下，将其滴加到8mL DMF和8mL CH₂Cl₂混合溶液中。滴加完毕后，移至室温，在65℃油浴中加热回流3h。冷却后，将反应液倒入50冰水中，室温放置融化后转移至分液漏斗中静置分层。除去下层有机溶液后，在上层水相中过滤获得黄色沉淀。经冰水反复洗净，真空干燥，得到反应物2.5g，产率71.8％。

实施例3合成化合物1

将198mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基吲哚和0.56g(4mmol)丁磺酸内酯溶于5ml邻二氯苯中。在氮气环境下，120℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，在0℃下，将其滴入50ml冰乙醚。红色沉淀析出后抽滤，重溶于10ml蒸馏水中，经CHCl₃萃取，冻干得化合物1284mg，产率76.9％。

将241mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基-5-氯吲哚和0.56g(4mmol)丁磺酸内酯溶于5ml邻二氯苯中，在氮气环境下，120℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，在0℃下，将其滴入50ml冰乙醚，红色沉淀析出，抽滤，溶于10ml水中，CHCl₃萃取，冻干得纯品319mg，产率77.5％。

实施例4合成化合物2

将198mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基吲哚和307mg(1.71mmol)5-溴戊酸溶于6ml邻二氯苯中。在氮气环境下，110℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，将其滴入60ml冰浴中的乙醚中。红色沉淀析出后，抽滤得粉红色粉末粗品。用乙腈∶乙醚＝1∶1洗涤纯化，得到目标化合物158mg，产率为48.5％。

将260mg(1mmol)1-(4-羧基丁基)-2，3，3-三甲基-3H吲哚、86mg(0.5mmol)2-氯-1-甲酰基-3羟基亚甲基-环己烯和82mg(1mmol)乙酸钠溶于6ml醋酐，氮气环境下70℃油浴加热40分钟。冷却后得绿色溶液，旋干后硅胶柱纯化，洗脱剂为乙腈∶水＝10∶1，旋干冻干，得绿色纯品83.8mg，产率25.6％。化合物1的¹H NMR光谱图如图1所示。

实施例5合成化合物3

将216mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基-5-甲基-吲哚和0.56g(4mmol)丁磺酸内酯溶于5ml邻二氯苯中。在氮气环境下，120℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，在0℃下，将其滴入50ml冰乙醚，褐色沉淀析出，抽滤，溶于10ml水中，经CHCl₃萃取，冻干得纯品0.305g，产率79.0％。

将309mg(1mmol)1-δ丁磺酸基-2，3，3-三甲基-5-甲基-3H吲哚、86mg(0.5mmol)2-氯-1-甲酰基-3羟基亚甲基-环己烯和82mg(1mmol)乙酸钠溶于6ml醋酐，氮气环境下70℃油浴加热40分钟。冷却后得绿色溶液，旋干后硅胶柱纯化，洗脱剂为乙腈∶水＝10∶1，旋干冻干，得绿色纯品82.4mg，产率21.8％。化合物3的¹H NMR光谱图如图2所示。

实施例6合成化合物4

将216mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基-5-甲基吲哚和450mg(2.5mmol)5-溴戊酸溶于6ml邻二氯苯中，在氮气环境下，110℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，在0℃下，将其滴入60ml冰乙醚，红色沉淀析出，抽滤得粉红色粉末粗品，用乙腈∶乙醚＝1∶1洗涤纯化，得纯品0.143g，产率41.8％。

将274mg(1mmol)1-(4-羧基丁基)-2，3，3-三甲基-5-甲基-3H吲哚、86mg(0.5mmol)2-氯-1-甲酰基-3羟基亚甲基-环己烯和82mg(1mmol)乙酸钠溶于6ml醋酐，氮气环境下70℃油浴加热40分钟。冷却后得绿色溶液，旋干后硅胶柱纯化，洗脱剂为乙腈∶水＝10∶1，旋干冻干，得绿色纯品62.5mg，产率18.3％。化合物4的¹H NMR光谱图如图3所示。

实施例7合成化合物5

将329mg(1mmol)1-δ丁磺酸基-2，3，3-三甲基-5-氯-3H吲哚、86mg(0.5mmol)2-氯-1-甲酰基-3羟基亚甲基-环己烯和82mg(1mmol)乙酸钠溶于6ml醋酐，氮气环境下70℃油浴加热40分钟。冷却后得绿色溶液，旋干后硅胶柱纯化，洗脱剂为乙腈∶水＝10∶1，旋干冻干，得绿色纯品272mg，产率68.7％。化合物5的¹H NMR光谱图如图4所示。

实施例8合成化合物6

将241mg(1.25mmol)2，3，3-三甲基-5-氯-吲哚和450mg(2.5mmol)5-溴戊酸溶于6ml邻二氯苯中，在氮气环境下，110℃油浴磁力搅拌，回流反应12h。反应液冷却至室温后，在0℃下，将其滴入60ml冰乙醚，红色沉淀析出，抽滤得粉红色粉末粗品，用乙腈∶乙醚＝1∶1洗涤纯化，得纯品0.189g，产率51.4％。

将294mg(1mmol)1-(4-羧基丁基)-2，3，3-三甲基-5-氯-3H吲哚、86mg(0.5mmol)2-氯-1-甲酰基-3羟基亚甲基-环己烯和82mg(1mmol)乙酸钠溶于6ml醋酐，氮气环境下70℃油浴加热40分钟。冷却后得绿色溶液，旋干后硅胶柱纯化，洗脱剂为乙腈∶水＝10∶1，旋干冻干，得绿色纯品132mg，产率36.4％。化合物6的¹H NMR光谱图如图5所示。

实施例9荧光染料1-6吸收光谱

荧光染料的吸收光谱通过岛津-2401分光光度计进行测量。

首先分别配制荧光染料1-6的DMSO标准母液(100μM/L)；在吸收实验前分别稀释到PBS(pH 7.4)缓冲溶液中，最终浓度为1.0μM/L；在400-900nm范围内测量不同化合物的吸收波谱(如图6所示)；结果表明，所有的荧光染料在770-790nm处及700-720nm均有吸收。根据文献报道，770-790nm处吸收应为游离荧光染料的吸收峰，700-720nm处吸收应为荧光染料J-type聚合物的特征吸收峰，另外实验发现具有双磺酸基取代的荧光染料1，3，5较相应的双羧基取代染料2，4，6具有更高的吸光系数；如染料1的吸光系数为120000，为染料2的3.06倍，同时，染料3和5也分别较4和6为高；所述的染料5在900nm左右有一个强吸收峰，而其他5种染料均未发现上述吸收峰，该吸收峰属于荧光染料在水溶液中形成H-type聚合物的吸收峰。

结合双光子荧光数据表明，上述吸收峰对促进其双光子荧光强度有着直接的关系。

实施例10荧光染料1-6单光子荧光光谱

荧光染料的单光子荧光光谱通过配备有光电倍增管的岛津-5301PC荧光分光光度计进行测量；分别配制化合物1-6的DMSO标准母液(100μM/L)。在实验前分别稀释到PBS缓冲溶液中，最终浓度为1.0μM/L；荧光染料的激发波长为750nm，采集770-900nm范围内的荧光光谱(如图7所示)，各荧光染料的最大发射均在790-810nm之间；结果表明，不同染料的单光子近红外荧光强度与染料吲哚环5-位上的取代基密切相关，其中H＞Me＞Cl；如染料1给出了最强的近红外荧光，而吲哚环5-位被Cl取代的染料5和6则给出了最低的荧光强度；此外，在吲哚5位取代基相同的情况下，具有双磺酸基取代的荧光染料往往较双羧基取代的染料具有更高的单光子荧光强度，如双磺酸基取代染料1荧光强度较双羧基取代的染料2高。

实施例11荧光染料1-6在水溶液中的重要光学参数

根据上述荧光染料的单光子吸收光谱和荧光光谱，可得到荧光染料1-6的最大吸收和最大发射波长，同时根据朗伯-比尔定律计算其摩尔吸光系数，结果如表2所示；

结果显示，吸收光谱中双磺酸基取代荧光染料与双羧基取代荧光染料的最大吸收波长和最大发射波长并没有明显区别，但吲哚5位甲基或氯取代均造成了最大吸收波长和最大发射波长红移近10nm；此外，双磺酸基取代荧光染料与双羧基取代荧光染料相比具有更高的摩尔吸光系数，且吲哚5位取代基团均造成荧光染料摩尔吸收系数降低；其中，吲哚5位氯代的双磺酸基荧光染料的最大发射波长在806nm，然而其在791nm和898nm处均拥有明显的荧光吸收，且898nm处的荧光吸收拥有更大的摩尔吸光系数。

表2

其中，

A为荧光染料在PBS中的最大吸收波长；

ε为荧光染料在PBS中的吸光系数；

λ_SPmax为单光子荧光的最大发射波长；

Φ_TP为荧光染料的最大双光子吸收截面；

MW为荧光染料的分子量。

实施例12体外细胞毒性实验

1)体外细胞培养

U87MG细胞系在75cm²培养瓶中单层培养；使用添加有10％胎牛血清(FBS)、2mM/L-谷氨酰胺、1％青霉素，链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM培养基并置于有充分湿气的含5％CO₂的37℃培养箱中培养；当细胞长满80％的面积时消化收集，以使细胞保持在指数增长状态。

2)体外细胞毒性实验

MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)细胞增殖实验用来测定经化合物1-6、ICG、IR783处理后U87MG细胞的活力；处于指数增长期的细胞用0.25％胰酶消化收集，得到单细胞悬液；用细胞计数器和普通光学显微镜(OLYMPUS BH-2)计算细胞密度，用适量细胞培养液重悬细胞，在96孔板的每个孔中加入含有约2×10³个细胞的100μL单细胞悬液。每个化合物浓度准备了8个复孔；细胞贴壁24小时后，化合物1-6、ICG及IR783样品溶液用

-HV的0.22μm注射器式滤器过滤除菌，且终浓度的梯度范围在0.05-10μM加入细胞；在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4天后，细胞用PBS浸洗两次，然后加入MTT测定细胞活力；利用未经任何处理过的细胞的活力值对不同化合物处理过细胞进行活力值标准化；荧光染料1-6的体外细胞毒性通过MTT法在人宫颈肿瘤Hela细胞中进行评价，结果如图5所示，IR783表现出最高的细胞毒性，在100μM浓度下孵育4天后，其细胞活性低于10％，而其他染料的细胞活性均高于60％。数据用平均值±方差来表示(每个浓度的实验n＝4)。

细胞毒性实验曲线如图8所示，其中，Hela细胞经不同浓度荧光染料化合物孵育24小时后的细胞活性，数据为8次试验点平均值±方差。

实施例13细胞摄取荧光染料后的单光子荧光显微镜成像

Hela细胞(2×10⁴cells/dish)培养在24孔板培养皿中；当细胞融合度达到50％后，将荧光化合物加入细胞培养液中(50μM)；孵育24h后，PBS浸洗3次，经5％PFA固定后，DAPI对细胞核荧光染色；在配备有DFC360FX低温CCD照相机的Leica DMF4000B荧光显微镜下观察细胞，其中，DAPI用360纳米光源激发，收集460-480nm处的发射光；单光子近红外荧光用710nm光源进行激发，收集800-840nm处的发射光；细胞摄取荧光染料后的单光子荧光显微镜成像图如图9所示。

实施例14单光子荧光显微镜成像研究荧光染料的细胞内分布

Hela细胞(2×10⁴cells/dish)培养在24孔板培养皿中。当细胞融合度达到50％后，将溶酶体特异荧光标记物Dex-FITC(200μg/mL)加入细胞中。孵育4小时后，细胞经浸洗后加入新鲜培养液继续孵育12小时已实现溶酶体的荧光标记。荧光化合物(50μM)加入溶酶体标记后的细胞中。孵育24h后，PBS浸洗3次，经5％PFA固定后，DAPI对细胞核荧光染色。在Leica TCS SP5荧光显微镜下观察细胞。其中DAPI用360纳米光源激发，收集460-480nm处的发射光；溶酶体标记物FITC用XX滤片后的光源激发，收集560-620nm处的发射光；单光子近红外荧光用710nm光源进行激发，收集800-840nm纳米处的发射光。

荧光染料在单光子荧光显微镜成像中细胞内分布位置如图10所示。

实施例15活Hela细胞摄取近红外荧光化合物的双光子共聚焦荧光显微镜成像

Hela细胞(2×10⁴cells/dish)培养在1.0cm的玻璃底培养皿中。当细胞融合度达到50％后，将荧光染料加入细胞培养液中(100μM)。孵育24h后，用4℃的PBS浸洗3次，加入培养液，在双光子荧光显微镜Laser Confocal Scanning Microscope(Leica TCS SP5)下进行观察，所有荧光染料均在900nm处激发，接收560-620nm处得双光子荧光。如图11所示，Hela细胞经不同荧光染料(100μM)孵育24小时后，化合物6及2均给出了较高的双光子荧光强度，4的双光子荧光强度较弱，而化合物1，3，5则未检测到明显的双光子荧光；细胞实验发现与单光子荧光规律相反，具有双羧基取代染料的双光子荧光强度大大高于双磺酸基取代荧光染料；双磺酸基取代染料2和6的荧光强度较双羧基取代的染料2和5要高，其次，吲哚环上不同取代基对双光子荧光效率的影响关系为Cl＞H＞Me，这也与单光子荧光有着显著不同。

上述实施例的结果表明，本有机近红外双光子荧光染料，经激发后，同时表现出较强的单光子近红外荧光及双光子荧光发光效率，其双光子荧光效率较其他羰花青类染料有明显提高；此外，上述荧光染料还表现出水溶性好、化学性质稳定、可用于生物大分子标记等特征，可用于医学影像诊断领域，特别是在光学影像指导下的肿瘤手术切除方面有很强的应用价值；同时，上述染料将在活体及离体状态下实现单光子近红外荧光和双光子荧光同步成像。

Claims

1.有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，具有式I的化学结构，

式I

其中，

X为氯或溴或碘或ClO₄ ^-；

n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；

R₁为氢、卤素、烷基、芳香基、硝基、磺酸基、醛基或羧基；

R₂为氯或溴。

2.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，所述的R₁中的卤素选自氯、溴或碘。

3.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，所述的R₁中的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。

4.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，所述的R₁中的芳香基选自苯基、萘基或取代苯基。

5.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，所述染料在700-760nm范围内染料分子被激发，产生单光子近红外荧光，荧光发射波长为780-850nm。

6.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，所述染料在900-980nm范围内被激发，产生双光子荧光，荧光发射波长为560-620nm。

7.按权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料，其特征在于，其合成路线如式II所示，

式II。

8.权利要求1所述的有机近红外双光子荧光染料在制备生物大分子标记中的用途。

9.按权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的式I结构的吲哚环5位上的羧基与生物大分子或聚合物上的伯胺基缩合实现荧光基团的标记。