CN111693495A - 一种近红外双通道荧光活体显微成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学影像领域，涉及一种近红外一区与二区双通道荧光活体显微成像技术，包括采用成像装置和荧光探针组合对动物活体组织和细胞的实时显微观察；其中，成像装置包括近红外光源、显微镜头、二向色镜、滤光片、套筒透镜、近红外一区荧光检测器和近红外二区荧光检测器；荧光探针为发射近红外一区荧光和近红外二区荧光的探针组合，其中，发射近红外二区荧光的探针为一种利用含聚集诱导发光基团的近红外二区荧光分子构建的荧光纳米探针；发射近红外一区荧光的探针为吲哚花菁衍生物。本发明涉及的成像装置和探针组合能够实现对动物活体组织和细胞的实时显微观察。

Description

一种近红外双通道荧光活体显微成像方法
技术领域
本发明属于生物医学影像领域，具体涉及一种近红外双通道荧光活体显微成像技术，包括采用一种对活体动物进行近红外一区/二区双通道荧光显微成像的装置，发射近红外二区荧光、可对细胞进行标记的荧光探针，以及发射近红外一区荧光、可对血管、或细胞进行标记的荧光探针。
背景技术
现有技术公开了双光子显微成像技术是观察活体组织中细胞形态、运动与功能的主要研究手段，它可以在时间、空间尺度上揭示细胞与细胞、血管、基质成分的相互作用；但是，由于传统荧光染料的发射波长在400-800nm之间，以及肝脏等组织的强吸收和高背景荧光的特性，双光子显微成像在成像深度和信噪比方面尚存不足。有研究显示，近红外一区(NIR-I，700-900nm)和近红外二区(NIR-II，900-1700nm)荧光成像，与可见光波段成像相比因其荧光波长更长，具有更低的背景自发荧光和组织散射干扰，更深的组织渗透能力、更高的空间分辨率和对比度，因而能够极大地提高成像质量与成像深度。目前，将近红外一区与二区相结合的双通道荧光活体显微成像技术国内外未见报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种近红外双通道荧光活体显微成像技术以及采用的荧光显微成像的装置和可对对血管、或细胞进行标记的荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种近红外双通道荧光活体显微成像方法以及采用的荧光显微成像的装置和可对血管、或细胞进行标记的荧光探针对动物活体组织和细胞的实时显微观察。
本发明的近红外一区与二区双通道荧光活体显微成像方法，包括采用成像装置和荧光探针组合对动物活体组织和细胞的实时显微观察，其中，成像装置包括近红外光源、显微镜头、二向色镜、滤光片、套筒透镜、近红外一区荧光检测器和近红外二区荧光检测器；荧光探针为发射近红外一区荧光和近红外二区荧光的探针组合；其中，发射近红外二区荧光的探针为一种利用含聚集诱导发光基团的近红外二区荧光分子构建的荧光纳米探针；发射近红外二区荧光的探针为吲哚花箐衍生物。
本发明中，所述显微镜头用于将近红外激发光聚焦于动物活体组织，并将荧光探针受激发后产生的发射光收集到成像装置内，显微镜头的放大倍数可以是5倍、10倍、20倍、40倍或者是更高倍数；镜头与组织样本之间可以采用空气、水或者硅油作为媒介。
本发明中，所述近红外光源可来自于激光、LED灯、卤素灯、氙灯、汞灯等光源；激发光源波长为600-1500nm，优选750-820nm。
本发明中，所述二向色镜1，用于将激发光反射入显微镜头中，并且保证显微镜头中采集到的发射光通过该二向色镜。
本发明中，所述套筒透镜用于实现将图像进行放大。
本发明中，所述二向色镜2，用于将光路系统中的近红外一区荧光反射、近红外二区荧光透过。
本发明中，所述滤光片1用于进一步过滤被二向色镜2反射的近红外一区荧光，消除干扰光，可以是带通滤光片；优选的，为波长在700-900nm范围内的带通滤光片。
本发明中，所述近红外一区荧光检测器是硅基芯片相机，可以是CCD相机，或者是SCMOS相机等。硅基芯片相机可以是风冷或者水冷，制冷的目的是降低暗电流，提高信噪比，也可以是InGaAs芯片相机。具体的，可以是热电制冷InGaAs芯片相机，也可以是液氮制冷InGaAs芯片相机；InGaAs芯片制冷的目的是降低暗电流，提高信噪比。
本发明中，所述滤光片2用于进一步过滤被二向色镜2透射的近红外二区荧光，消除干扰光，可以是长波通滤光片，也可以是带通滤光片，优选的，为波长在900-1700nm范围内的长波通滤光片或者带通滤光片，优选波长范围在1000-1700nm。
本发明中，所述近红外二区荧光检测器是InGaAs芯片相机，优选的，可以是热电制冷InGaAs芯片相机，也可以是液氮制冷InGaAs芯片相机，InGaAs芯片制冷的目的是降低暗电流，提高信噪比。
本发明涉及的近红外一区荧光染料与右旋糖酐的共价链接物，其特征在于所述的近红外荧光染料是吲哚花菁类染料，将吲哚花菁类染料的羧基与氨基化的右旋糖酐通过酰胺缩合反应链接得到的化合物，可以作为近红外一区荧光探针标记血管；
其结构通式包括吲哚花菁骨架和不同分子量的右旋糖酐，结构通式如下：
Figure BDA0001996971740000031
其中，
R1和R3是
Figure BDA0001996971740000032
R2是烷基，羧基，磺酸基，酯基，氨基或羟基；
n是20-600；m，x，y是0-20；z是0-8；
上述链接物的合成路线如下：
合成路线1
Figure BDA0001996971740000033
其中R1，R2和R3与通式I中的一致；m，n，x，y和z与通式I中的一致。
上述合成路线1中的试剂和条件：
a.吲哚花菁染料中间体的合成：
选用不同碳链长度的吲哚花菁单体和不同链长的二醛缩二苯胺，以乙酸和乙酸酐为溶剂，在加热回流条件下反应得到吲哚花菁染料中间体，优选地，所述的引入条件为吲哚花菁单体与烯醛缩二苯胺盐酸盐在乙酸和乙酸酐混合溶液中，加热至80℃反应1.5小时。
b.羧基化吲哚花菁染料的合成：
上步的中间体和侧链带羧基的吲哚花菁染料单体在乙酸和吡啶溶液中，加热回流条件下反应得到吲哚花菁染料。优选地，所述的反应条件80℃反应半小时。
c.不同分子量的右旋糖酐引入氨基的合成：
选用吡啶、水或二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，以N，N-羰基二咪唑(CDI)为活化剂，将不同碳链长度的二胺接到不同分子量的右旋糖酐的羟基上，得到氨基化的右旋糖酐。优选地，所述的引入条件为将右旋糖酐溶于无水DMSO中，加入CDI室温搅拌3小时，然后加入过量的二胺继续反应8小时。
d.吲哚花菁染料与右旋糖酐共价链接物的合成：
常用的溶剂为水和DMSO；常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。优选地，所述的缩合剂为EDC·HCl和NHS。
本发明涉及的发射近红外一区荧光的探针是吲哚花菁类衍生物，其特征在于所述的吲哚花菁类衍生物是脂溶性的，应用于细胞成像，其结构通式如下：
Figure BDA0001996971740000041
其中，
R1和R3是
Figure BDA0001996971740000042
R2和R4是烷基，羧基，磺酸基，酯基，氨基或羟基；
m，n是0-20；z是0-8。
本发明涉及的含聚集诱导发光(AIE)基团的近红外二区荧光分子，其特征在于此类分子是具有AIE基团的供体-受体类分子，其结构通式如下：
Figure BDA0001996971740000051
其中，
受体基团(A)通常为含硫、硒或碲芳香杂环化合物
Figure BDA0001996971740000052
X，Y＝S，Se或Te
供体基团(D)通常为具有聚集诱导发光效应的二苯胺、三苯胺、四苯乙烯、四苯基吡嗪及其衍生物，结构如下：
Figure BDA0001996971740000053
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure BDA0001996971740000054
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3，R4＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure BDA0001996971740000061
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3，R4，R5＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure BDA0001996971740000062
R1，R2，R3＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
本发明所述的发射近红外二区荧光的探针为一种利用含AIE基团的近红外二区荧光分子构建的荧光纳米探针。该荧光纳米探针包含具有AIE基团的供体-受体类荧光分子和聚乙二醇衍生化磷脂。所述的荧光分子与聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:0.1-1:100；优选地，质量比为1:0.5-1:10。
所述聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或它们的混合物。优选地，该聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
本发明所述的发射近红外二区荧光纳米探针其制备方法包括：
(1)将所述有AIE基团的供体-受体类荧光分子与所述聚乙二醇衍生化磷脂溶解于中；
(2)将步骤(1)的有机溶液与超纯水混合均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液进行超声处理；
(4)将步骤(3)得到的产物搅拌使有机溶剂挥发。
优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂。优选地，该有机溶剂为四氢呋喃。
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与水的比例为1:5-1:50(v/v)。
优选地，步骤(3)中超声处理条件：功率范围为50-500W，超声时间范围为1-10min。
优选地，步骤(4)中所述搅拌条件为：搅拌速率为200-2000rpm，搅拌温度为20-60℃。
本发明提供了一种近红外一区与二区双通道荧光活体显微成像技术，包括采用成像装置和荧光探针组合对动物活体组织和细胞的实时显微观察；经实践表明本发明的方法以及成像装置和探针组合能够较好的实现对动物活体组织和细胞的实时显微观察。
附图说明
图1.近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置示意图。
图2.近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置实物图。①液氮制冷InGaAs短波红外相机；②1000nm长波通滤光片；③950nm长波通二向色镜；④套筒透镜；⑤830nm长波通二向色镜；⑥20倍平场荧光物镜；⑦波长为808nm、最高功率为5W的半导体激光器；⑧830-880nm带通滤光片；⑨水制冷Si芯片sCOMS相机；⑩异氟烷小动物麻醉机。
图3.CT26-Luc结肠癌原位肿瘤模型鼠静脉注射ICG-dextran 40后肿瘤血管活体荧光显微成像(小鼠注射剂量按ICG计为0.3mg/kg)。(a)小鼠肿瘤血管在近红外一区通道(左)和近红外二区通道(右)下荧光显微成像。(b-e)小鼠肿瘤血管在近红外一区通道下荧光显微成像。
图4.BPBBT纳米粒的透射电镜图和粒径分布图。
图5.(a)BPBBT(50μM)和BPBBT纳米粒(50μM)溶液可见光照片和溶液在808nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下近红外二区荧光成像；(b)BPBBT(10μM)和BPBBT纳米粒(10μM)在不同溶液中的荧光光谱。
图6.(a)CT26-Luc肿瘤细胞在BPBBT纳米粒(200μg/mL)标记2h后近红外一区与近红外二区荧光成像图片；(b)MTT法测定CT26-Luc肿瘤细胞在BPBBT纳米粒孵育后24小时以及48小时的细胞存活率。Mean±SD，n＝4。
图7.(a)BPBBT纳米粒溶液(50μM)，ICG-dextran40(50μM)在牛血清白蛋白溶液中可见光照片和溶液在808nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下近红外一区荧光成像；(b)BPBBT纳米粒溶液(10μM)，ICG-dextran40(10μM)在牛血清白蛋白溶液中的荧光光谱(激发波长：808nm，发射波长范围：830-880nm)；(c)BPBBT纳米粒溶液(50μM)，ICG-dextran 40(50μM)在牛血清白蛋白溶液中可见光照片和溶液在808nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下近红外二区荧光成像；(d)BPBBT纳米粒溶液(10μM)，ICG-dextran40(10μM)在牛血清白蛋白溶液中的荧光光谱(激发波长：808nm，发射波长范围：1000-1450nm)。
图8.BPBBT纳米粒标记的CT26-Luc结肠癌原位肿瘤模型鼠静脉注射ICG-dextran40后对肿瘤血管进行近红外一区成像，对肿瘤细胞进行近红外二区成像。红色，肿瘤细胞；灰度，肿瘤血管。
图9.(a)中性粒细胞在BPBBT纳米粒(200μg/mL)标记1h后近红外一区与近红外二区荧光成像图片。(b)MTT法测定中性粒细胞在BPBBT纳米粒孵育后6小时以及12小时的细胞存活率。Mean±SD，n＝4。
图10.CT26-Luc结肠癌原位肿瘤模型鼠静脉注射BPBBT纳米粒标记的中性粒细胞(2×106)和ICG-dextran 40后，肿瘤部位活体近红外一区/二区荧光双通道显微成像拍摄的时间顺序照片以及中性粒细胞在30min内的移动路径图。红色，中性粒细胞；灰度，肿瘤血管。
图11.(a)巨噬细胞在ICG-OAc(6μg/mL)标记0.5h后近红外一区与近红外二区荧光成像图片。(b)MTT法测定巨噬细胞在ICG-OAc孵育后24小时以及48小时的细胞存活率。Mean±SD，n＝4。
图12.(a)BPBBT纳米粒溶液(50μM)，ICG-OAc(50μM)在脂质体溶液中可见光照片和溶液在808nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下近红外一区荧光成像；(b)BPBBT纳米粒溶液(10μM)，ICG-OAc(10μM)在脂质体溶液(激发波长：808nm，发射波长范围：830-880nm)；(c)BPBBT纳米粒溶液(50μM)，ICG-OAc(50μM)在脂质体溶液，ICG-dextran40(50μM)在牛血清白蛋白溶液中可见光照片和溶液在808nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下近红外二区荧光成像；(d)BPBBT纳米粒溶液(10μM)，ICG-OAc(10μM)在脂质体溶液中的荧光光谱(激发波长：808nm，发射波长范围：1000-1450nm)。
图13.BPBBT纳米粒标记的CT26-Luc结肠癌原位肿瘤模型鼠肿瘤内注射ICG-OAc标记的巨噬细胞(2×105)后，肿瘤边缘部位的近红外一区/二区双通道荧光显微成像拍摄的时间顺序照片。红色，肿瘤细胞；绿色，巨噬细胞。肿瘤细胞与巨噬细胞在0-4min相互分离，5-7min相互接触，在8min之后肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬。
具体实施方式
以下结合实施例、附图、附表对本发明作进一步描述，但附图、附表以及具体实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
本发明的近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置示意图如图1所示，由以下主要部件组成：
近红外激发光源是波长为808nm、最高功率为5W的半导体激光器；
二向色镜1是830nm长波通二色镜；
显微镜头是20倍平场荧光物镜；
套筒透镜是焦距f＝400mm的凸透镜；
二向色镜2是950nm长波通二向色镜；
滤光片1是830-880nm带通滤光片；
滤光片2是1000nm长波通滤光片；
近红外一区检测器是水制冷Si芯片sCOMS相机；
近红外二区检测器是液氮制冷InGaAs芯片短波近红外相机。
本发明的近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置实物图如图2所示。
实施例2：
用于标记血管的近红外一区荧光探针化合物7(ICG-dextran 40)，其合成路线如下所示：
合成路线3：
Figure BDA0001996971740000101
反应试剂和条件：
a.乙酸，乙酸酐，戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐；回流反应1.5小时；
b.乙酸，吡啶；回流反应0.5小时；
c.右旋糖酐(40kD)无水DMSO，CDI，1，3-丙二胺；室温反应8小时；
d.无水DMSO，EDC·HCl，NHS；室温避光反应过夜。
化合物2(吲哚花菁染料中间体)的合成：
化合物1(0.2g，0.56mmol)和戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(0.18g，0.63mmol)溶于醋酸(5mL)和醋酸酐(5mL)的混合溶液中，回流反应90分钟。然后冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。得红棕色油状粗品2，无需纯化直接投下一步。
化合物4(吲哚花菁染料)的合成：
化合物2(0.1g，0.18mmol)和3(0.06g，0.18mmol)溶于醋酸酐(5mL)和无水吡啶(5mL)的混合溶液中，回流反应半小时。待反应完成后，冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。剩余物经硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100:1–10:1)得化合物4为墨绿色固体45mg，产率35％。核磁分析：1H NMR(400MHz，DMSO-d)δ12.13(s，1H)，8.33–8.24(m，3H)，8.08(dd，J＝9.8，4.6Hz，4H)，8.01(m，2H)，7.80(d，J＝10.0Hz，2H)，7.73(d，J＝7.8Hz，2H)，7.70-7.63(m，2H)，7.57-7.47(m，2H)，6.63(d，J＝12.6Hz，1H)，6.57(d，J＝12.5Hz，1H)，4.31-4.13(m，4H)，3.15(s，2H)，2.53(s，6H)，2.34(m，2H)，1.93(s，6H)，1.81(m，4H)，1.73-1.62(m，4H).质谱分析ESI-MS m/z[M-H]-：C44H49N2O5S计算值：716.3；实测值：716.4
化合物6(氨基化右旋糖酐)的合成：
化合物5(右旋糖酐40kD，1.0g，5.56mmol)溶于60mL的无水DMSO溶液中，然后加入N，N-羰基二咪唑(CDI，0.68g，4.17mmol)。氮气保护下搅拌4小时，然后向反应液中加入1，3-丙二胺(3.2g，41.7mmol)。继续室温搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物6，冻干，得白色固体0.95g。
实施例2中化合物7(吲哚花菁染料与右旋糖酐共价链接物，ICG-dextran 40)的合成：
化合物4(10mg，0.025mmol)溶于无水DMSO中，然后依次加入EDC·HCl(14mg，0.075mmol)和NHS(9mg，0.075mmol)，避光搅拌3小时后将化合物6(45mg)加到上述反应液中，搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物7，冻干，得绿色固体。经核磁计算，吲哚花菁染料在右旋糖酐上取代度为3.3％。
将化合物7溶解于PBS配制溶液(小鼠注射剂量按ICG计为0.3mg/kg)，经小鼠尾静脉注射入体内，通过实施例1构建的成像系统可对肿瘤区域血管进行近红外一区成像，而在近红外二区无明显荧光信号(图3a)。同时该成像系统与血管荧光探针组合对可对血管流动情况进行实时影像(图3b-e)，并能够对直径为4.3μm的血管进行清晰成像(图3d)。
实施例3：
一种用于标记细胞的近红外二区荧光探针化合物8，其结构如下：
Figure BDA0001996971740000111
化合物8(BPBBT)是具有AIE基团的供体-受体类NIR-II荧光分子。称取1mg该化合物与0.8mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL四氢呋喃中。将混合溶剂加入5mL超纯水中并混合。使用超声波细胞粉碎机对混合溶液进行超声处理，超声功率为100W，超声时间为2min。之后将混合溶液倒入圆底烧瓶中，放置于通风橱中在40℃下高速搅拌4h均匀高速搅拌。最终使用30kD超滤管清洗并浓缩得到纳米探针溶液。纳米制剂的粒径、聚合物分散系数(Polymerdispersion index，PDI)、载药量和包封率(表1)，以及形态(图4)。
BPBBT在良性极性溶剂四氢呋喃(THF)中表现为荧光淬灭，在不良溶剂5％THF中表现为AIE现象，发出强烈荧光。将BPBBT制备成纳米探针，其在水中的荧光强度以及量子效率均高于BPBBT处于5％THF中的状态，表明将BPBBT制备成纳米制剂后可以增加BPBBT的荧光强度(图5，表2)。
使用BPBBT纳米粒对CT26-Luc肿瘤细胞进行了近红外二区荧光标记，结果表明标记后细胞在近红外二区波段能发出较强荧光，而在近红外一区波段没有荧光(图6a)。细胞毒性实验结果表明BPBBT纳米粒对于CT26-Luc肿瘤细胞存活率无显著影响(图6b)。
表1
Figure BDA0001996971740000121
表2
Figure BDA0001996971740000122
。
实施例4：
本发明涉及的近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置以及相关荧光探针组合用于肿瘤细胞与血管之间的关系研究，
为考察实施例2的ICG-dextran 40与实施例3的BPBBT纳米粒在成像时是否会有干扰，分别将相同摩尔浓度的近红外二区细胞染料BPBBT纳米粒分散在水溶液中，将近红外一区血管染料ICG-dextran 40溶解在牛血清白蛋白溶液中。测定两种溶液在近红外一区以及近红外二区两个波段下的荧光图谱以及量子效率。实验结果表明在近红外一区(830-880nm)，ICG-dextran 40发出较强荧光，而BPBBT纳米粒溶液不发出荧光，其荧光强度与量子效率均低于ICG-dextran 40(图7a，7b，表3)。而在近红外二区(1000-1450nm)，BPBBT纳米粒荧光强度与量子效率显著高于近红外一区染料ICG-dextran 40(图7c，7d，表3)。因此，ICG-dextran 40与BPBBT纳米粒分别只在各自对应波段发出较强荧光，这两种荧光探针在近红外一区和二区两个通道之间并无相互干扰。
采用BPBBT纳米粒标记的CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，小鼠尾静脉注射ICG-dextran 40PBS溶液(小鼠注射剂量按ICG计为0.3mg/kg)，10min后可以对肿瘤区域血管进行近红外一区显微成像，对肿瘤细胞同时进行近红外二区显微成像。实验结果表明在肿瘤区域内大量肿瘤细胞聚集在血管周围(图8)。
表3
Figure BDA0001996971740000131
。
实施例5：
本发明涉及的近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置以及相关荧光探针组合可以用于研究免疫细胞与血管之间的关系。
我们使用实施例3的BPBBT纳米粒对中性粒细胞进行了近红外二区标记。结果表明标记后细胞在近红外二区波段发出较强荧光，而在近红外一区波段没有荧光(图9a)。毒性实验结果表明BPBBT纳米粒对于中性粒细胞存活率均无显著影响(图9b)。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，小鼠尾静脉注射使用BPBBT纳米粒标记的中性粒细胞溶液(约2×106个细胞)，30min后尾静脉注射ICG-dextran 40PBS溶液(小鼠注射剂量按ICG计为0.3mg/kg)，使用实施例1的成像系统对原位结肠癌肿瘤区域进行活体实时成像。可以实时观察到中性粒细胞经血管迁移至肿瘤组织的动态过程(图10)。
实施例6：
本发明涉及的近红外一区/二区双通道荧光活体显微成像装置以及相关荧光探针组合可以用于研究肿瘤细胞与免疫细胞之间的关系。
一种用于标记细胞的近红外一区荧光探针化合物9(ICG-OAc)，
采用ICG-OAc对巨噬细胞进行标记，结果表明标记后细胞在近红外一区波段发出较强荧光，而在近红外二区波段没有荧光(图11a)。毒性实验结果表明ICG-OAc对于细胞存活率均无显著影响(图11b)。
为考察ICG-OAc与实施例3的BPBBT纳米粒在成像时是否会相互干扰，分别将相同摩尔浓度的近红外二区细胞染料BPBBT纳米粒分散在水溶液中，将近红外一区细胞染料ICG-OAc溶解在脂质体溶液中。实验结果表明在近红外一区(830-880nm)，ICG-OAc发出较强荧光，而BPBBT纳米粒溶液不发出荧光，其荧光强度与量子效率均低于ICG-OAc(图12a，12b，表4)。而在近红外二区(1000-1450nm)，BPBBT纳米粒荧光强度与量子效率显著高于近红外一区染料ICG-OAc(图12c，12d，表4)。因此，ICG-OAc与BPBBT纳米粒分别只在各自对应波段发出较强荧光，这两种荧光探针在近红外一区和二区两个通道之间并无相互干扰。
采用BPBBT纳米粒标记后的CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，切开腹腔，暴露肠段后，在原位结肠癌靠近表皮的区域瘤内注射5μL巨噬细胞悬液(约2×105个细胞)，之后使用本发明涉及的近红外一区/二区双通道荧光活体成像系统对巨噬细胞注射区域进行活体实时成像。可以实时观察到巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的动态过程(图13)。
表4
Figure BDA0001996971740000141
Figure BDA0001996971740000151
。
实施例7：
本发明提出了一种用于标记血管的近红外一区染料，其合成路线如下所示：
合成路线4：
Figure BDA0001996971740000152
反应试剂和条件：
a.乙酸，乙酸酐，丙二醛二苯胺盐酸盐；回流反应1.5小时
b.乙酸，吡啶；回流反应0.5小时
c.右旋糖酐(10kDa)无水DMSO，CDI，1，3-丙二胺；室温反应8小时
d.无水DMSO，EDC·HCl，NHS；室温避光反应过夜化合物10(吲哚花菁染料中间体)的合成：
化合物9(0.4g，1.12mmol)和丙二醛二苯胺盐酸盐(0.35g，1.34mmol)溶于醋酸(5mL)和醋酸酐(5mL)的混合溶液中，回流反应90分钟。然后冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。得红棕色油状粗品10，无需纯化直接投下一步。
化合物11(吲哚花菁染料)的合成：
化合物10(0.3g，0.65mmol)和3(0.2g，0.65mmol)溶于醋酸酐(5mL)和无水吡啶(5mL)的混合溶液中，回流反应半小时。待反应完成后，冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。剩余物经硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100:1-10:1)得化合物10为墨绿色固体0.25g，产率60％。质谱分析ESI-MS m/z[M-H]-；C44H51N2O2计算值：638.4；实测值：638.1
化合物13(氨基化右旋糖酐)的合成：
化合物12(右旋糖酐10kDa，1.0g，5.56mmol)溶于60mL的无水DMSO溶液中，然后加入CDI(0.68g，4.17mmol)。氮气保护下搅拌4小时，然后向反应液中加入1，3-丙二胺(3.2g，41.7mmol)。继续室温搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物13，冻干，得白色固体0.91g。经核磁计算，吲哚花菁染料在右旋糖酐上取代度为5.1％。
实施例7中化合物14(吲哚花菁染料与右旋糖酐共价链接物，ICG-dextran10)的合成：
化合物10(50mg，0.078mmol)溶于无水DMSO中，然后依次加入EDC·HCl(43mg，0.23mmol)和NHS(28mg，0.23mmol)，避光搅拌3小时后将化合物13(250mg)加到上述反应液中，搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物14，冻干，得绿色固体。
利用该化合物可对血管进行近红外一区标记，采用近红外一区/二区双通道显微成像装置可对动物活体组织的血管进行实时成像。
实施例8：
本发明还提出了一种用于标记细胞的近红外二区染料，其结构如下：
Figure BDA0001996971740000161
化合物15(BTPBBT)是具有AIE基团的供体-受体类近红外二区荧光分子。称取0.5mg该化合物与1mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL四氢呋喃中。将混合溶剂加入5mL超纯水中并混合。使用超声波细胞粉碎机对混合溶液进行超声处理，超声功率为100W，超声时间为2min。之后将混合溶液倒入圆底烧瓶中，放置于通风橱中在40℃下高速搅拌4h均匀高速搅拌。最终使用30kD超滤管清洗并浓缩得到纳米探针溶液。纳米制剂的粒径、聚合物分散系数(Polymer dispersion index，PDI)、载药量和包封率(表5)。
BTPBBT在良性极性溶剂四氢呋喃(THF)中表现为荧光淬灭，在不良溶剂5％THF中表现为AIE现象，发出强烈荧光。将BTPBBT制备成纳米探针，其在水中的荧光强度以及量子效率均高于BTPBBT处于5％THF中的状态，表明将BTPBBT制备成纳米制剂后可以调节BTPBBT的荧光强度。
利用该化合物可对细胞进行近红外二区标记，搭配近红外一区/二区双通道显微成像装置可对动物活体组织的被标记细胞进行实时成像。
表5
Figure BDA0001996971740000171
。
实施例9：
本发明提出了一种用于标记血管的近红外一区染料，其合成路线如下所示：
合成路线5：
Figure BDA0001996971740000172
反应试剂和条件：
a.乙酸，乙酸酐，戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐；回流反应1.5小时；
b.乙酸，吡啶；回流反应0.5小时；
c.右旋糖酐(70kDa)无水DMSO，CDI，1，3-丙二胺；室温反应8小时
d.无水DMSO，EDC·HCl，NHS；室温避光反应过夜；
实施例9中化合物17(吲哚花菁染料中间体)的合成：
化合物16(0.3g，1.01mmol)和戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(0.35g，1.21mmol)溶于醋酸(5mL)和醋酸酐(5mL)的混合溶液中，回流反应90分钟。然后冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。得红棕色油状粗品17，无需纯化直接投下一步。
化合物19(吲哚花菁染料)的合成：
化合物17(0.2g，0.41mmol)和18(0.11g，0.41mmol)溶于醋酸酐(5mL)和无水吡啶(5mL)的混合溶液中，回流反应半小时。待反应完成后，冷却至室温，40C以下减压蒸除溶剂。剩余物经硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100:1-20:1)得化合物17为蓝绿色固体0.16g，产率64％。质谱分析ESI-MS m/z[M-H]-；C36H45N2O5S计算值：616.4；实测值：616.3。
化合物21(氨基化右旋糖酐)的合成：
化合物20(右旋糖酐70kDa，1.0g，5.56mmol)溶于60mL的无水DMSO溶液中，然后加入CDI(0.68g，4.17mmol)。氮气保护下搅拌4小时，然后向反应液中加入1，3-丙二胺(3.2g，41.7mmol)。继续室温搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物19，冻干，得白色固体0.82g。
实施例9中化合物22(吲哚花菁染料与右旋糖酐共价链接物，ICG-dextran 70)的合成：
化合物19(20mg，0.032mmol)溶于无水DMSO中，然后依次加入EDC·HCl(18mg，0.097mmol)和NHS(12mg，0.097mmol)，避光搅拌3小时后将化合物21(120mg)加到上述反应液中，搅拌过夜。反应完成后经透析得纯品化合物22，冻干，得绿色固体。经核磁计算，吲哚花菁染料在右旋糖酐上取代度为2.1％。
利用该化合物可对血管进行近红外一区标记，搭配近红外一区/二区双通道显微成像装置可对动物活体组织的血管进行实时成像。
实施例10：
本发明还提出了一种用于标记细胞的近红外二区染料，其结构如下：
Figure BDA0001996971740000191
化合物3(TPABBT)是具有AIE基团的供体-受体类近红外二区荧光分子。称取0.2mg该化合物与1.2mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL四氢呋喃中。将混合溶剂加入5mL超纯水中并混合。使用超声波细胞粉碎机对混合溶液进行超声处理，超声功率为120W，超声时间为5min。之后将混合溶液倒入圆底烧瓶中，放置于通风橱中在40℃下高速搅拌4h均匀高速搅拌。最终使用30kD超滤管清洗并浓缩得到纳米探针溶液。纳米制剂的粒径、聚合物分散系数(Polymer dispersion index，PDI)、载药量和包封率(表6)。
TPABBT在良性极性溶剂四氢呋喃(THF)中表现为荧光淬灭，在不良溶剂5％THF中表现为AIE现象，发出强烈荧光。将TPABBT制备成纳米探针，其在水中的荧光强度以及量子效率均高于TPABBT处于5％THF中的状态，表明将TPABBT制备成纳米制剂后可以调节TPABBT的荧光强度。
利用该化合物可对细胞进行近红外二区标记，搭配近红外一区/二区双通道显微成像装置可对动物活体组织的被标记细胞进行实时成像。
表6
Figure BDA0001996971740000192
。

Claims (10)

1.一种近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的成像方法包括采用荧光成像装置和荧光探针用于生物活体成像检测；
所述的成像装置包括激发光源、显微镜头、二向色镜、滤光片、套筒透镜、近红外一区荧光检测器和近红外二区荧光检测器；
所述的荧光探针为发射近红外一区荧光和近红外二区荧光的探针组合，其中，所述的近红外一区荧光为发射波长在700-900nm范围内的荧光，所述的近红外二区荧光为发射波长在900-1700nm范围内的荧光。
2.根据权利要求1所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的成像装置中的激发光源波长为600-1500nm。
3.根据权利要求1所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的成像装置中，近红外一区荧光检测器接收的荧光波长范围为700-900nm，所述近红外二区荧光检测器接收的荧光波长范围为900-1700nm。
4.根据权利要求1所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的发射近红外一区荧光的探针是吲哚花菁类染料与右旋糖酐的共价链接物，所述的右旋糖酐分子量为4kD-100kD，所述的共价链接物是吲哚花菁类染料的羧基与氨基化的右旋糖酐通过酰胺缩合反应链接得到的化合物，用于血管成像；其结构通式包括吲哚花菁骨架和不同分子量的右旋糖酐，结构通式如下：
Figure FDA0001996971730000011
其中，
R1和R3是
Figure FDA0001996971730000012
R2是烷基，羧基，磺酸基，酯基，氨基或羟基；
n是20-600；m，x，y是0-20；z是0-8。
5.根据权利要求1所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的发射近红外一区荧光的探针是吲哚花菁类衍生物，所述的吲哚花菁类衍生物是脂溶性的，用于细胞成像，其结构通式如下：
Figure FDA0001996971730000021
R1和R3是
Figure FDA0001996971730000022
R2和R4是烷基，羧基，磺酸基，酯基，氨基或羟基；
m，n是0-20；z是0-8。
6.根据权利要求1所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的发射近红外二区荧光的探针是荧光纳米探针，该纳米探针的内核是一类含聚集诱导发光基团的供体-受体类近红外二区荧光分子，外壳是聚乙二醇衍生化磷脂。
7.按权利要求6所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的含聚集诱导发光基团的供体-受体类近红外二区荧光分子，其结构通式如下：
Figure FDA0001996971730000023
其中，
受体基团(A)通常为含硫、硒或碲芳香杂环化合物
Figure FDA0001996971730000024
X，Y＝S，Se或Te
供体基团(D)通常为具有聚集诱导发光效应的二苯胺、三苯胺、四苯乙烯、四苯基吡嗪及其衍生物，结构如下：
Figure FDA0001996971730000031
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure FDA0001996971730000032
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3，R4＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure FDA0001996971730000033
R1＝苯基，噻吩基；R2，R3，R4，R5＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基
Figure FDA0001996971730000034
R1，R2，R3＝氢，羟基，氨基，卤素，C1-C20烷基，杂烷基，环烷基，芳基，杂芳基。
8.按权利要求6所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的聚乙二醇衍生化磷脂，是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或它们的混合物。
9.按权利要求6所述的近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所述的荧光纳米探针通过下述方法制备：
(1)将按权利要求7所述荧光分子与权利要求8中所述聚乙二醇衍生化磷脂溶解于甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)将步骤(1)的有机溶液与超纯水混合均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液进行超声处理；
(4)将步骤(3)得到的产物搅拌使有机溶剂挥发。
10.按权利要求9近红外双通道荧光活体显微成像方法，其特征在于，所制备的荧光纳米探针中，荧光分子与聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:0.5-1:10，荧光分子的载药量为10％～80％，荧光探针的粒径为10-1000nm。
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